Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Ringraziamo Muthugapatti Kandasamy presso il nucleo di microscopia biomedica Università della Georgia (UGA) per l'assistenza tecnica e Jose-Juan Lopez-Rubio per aver condiviso i plasmidi pUF1-Cas9 e pL6. Quest'opera è stata sostenuta da archi Foundation Award di D.W.C. e di H.M.K., concede fondi avvio UGA di V.M., sovvenzioni da marzo di Dimes Foundation (Basil o ' Connor Starter Scholar Research Award) di V.M. e US National Institutes of Health (R00AI099156 e R01AI130139) di V.M. e (T32AI060546) a H.M.K.

Continua cultura di p. falciparum richiede l'uso di globuli rossi umani, e abbiamo utilizzato commercialmente acquistato unità di sangue che sono stati spogliati di tutti gli identificatori e resi anonimi. L'Institutional Review Board e l'ufficio di biosicurezza presso l'Università della Georgia esaminato i nostri protocolli e approvato tutti i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio.
1. scegliere una gRNA sequenza
<ol><li>Vai a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e selezi...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

L'implementazione di CRISPR/Cas9 a p. falciparum ha aumentato l'efficienza di sia diminuito la quantità di tempo necessario per la modifica del genoma del parassita, rispetto ai precedenti metodi di manipolazione genetica. Questo protocollo completo vengono delineati i passaggi necessari per la generazione di mutanti condizionali utilizzando CRISPR/Cas9 a p. falciparum. Mentre il metodo qui è orientato in modo specifico per la generazione di ettari -glmS mutanti, questa strategia può essere ...

La malaria è una malattia devastante causata da protozoi parassiti del genere Plasmodium. P. falciparum, il parassita della malaria umana mortale la maggior parte, provoca circa 445.000 morti all'anno, principalmente in bambini sotto l'età di cinque1. Parassiti del plasmodio hanno un ciclo di vita intricato che coinvolgono un vettore zanzara e un ospite vertebrato. Gli esseri umani in primo luogo essere infettati quando una zanzara infetta prende un pasto di sangue. Quindi, il parassita invade il fegato dove cresce, si sviluppa e si divide per circa una settimana. Dopo questo processo, i parassiti vengono rilasciati nel flusso sanguigno, dove subiscono asessuale replica in globuli rossi (RBCs). Crescita dei parassiti all'interno di globuli rossi sono direttamente responsabili per i sintomi clinici associati con la malaria2.
Fino a poco tempo, produzione di transgenici da p. falciparum era un processo laborioso, che coinvolge diverse fasi di selezione della droga che ha preso molti mesi e aveva un alto tasso di fallimento. Questa procedura richiede molto tempo relieson la generazione di casuale del DNA si rompe nella regione di interesse e la capacità endogena del parassita per riparare il suo genoma però riparazione omologa3,4,5,6 . Recentemente, l'editing genomico cluster regolarmente intervallate palindromi Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) è stato correttamente utilizzato in falciparum del p.7,8. L'introduzione di questa nuova tecnologia nella ricerca sulla malaria è stato fondamentale per far progredire la comprensione della biologia di questi parassiti Plasmodium mortale. CRISPR/Cas9 permette di targeting specifico di geni attraverso guida RNAs (gRNAs) che è omologo al gene di interesse. Il gRNA/Cas9 complesso riconosce il gene attraverso il gRNA e Cas9 introduce quindi una rotture a doppio filamento, costringendo l'iniziazione dei meccanismi di riparazione nell'organismo9,10. P. falciparum manca il macchinario per riparare le rotture del DNA attraverso unirsi non-omologo fine, si utilizza meccanismi di ricombinazione omologa e integra modelli del DNA omologhe trasfettate per riparare il Cas9/gRNA-indotta rotture a doppio filamento11,12.
Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di mutanti condizionali atterramento in p. falciparum usando CRISPR/Cas9 editing genomico. Il protocollo viene illustrato l'utilizzo del ribozima glmS ai livelli della proteina in modo condizionale atterramento di PfHsp70x (PF3D7_0831700), uno chaperon esportati da p. falciparum in host RBCs13,14. Il ribozima glmS viene attivato dal trattamento con glucosamina (che viene convertito in glucosamina-6-fosfato in cellule) per fendere il suo mRNA associato, che conduce ad una riduzione della proteina14. Questo protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare altri strumenti di atterramento condizionale, ad esempio domini di destabilizzazione o RNA aptameri4,5,15. I nostri dettagli del protocollo la generazione di un plasmide di riparazione che consiste di un ribozima emoagglutinina (HA) di tag e glmS sequenza fiancheggiato da sequenze di codificazione che sono omologhi al PfHsp70x open reading frame (ORF) e 3'-UTR. Inoltre descriviamo la generazione di un plasmide seconda espressione di unità del gRNA. Questi due plasmidi, insieme a un terzo che spinge espressione di Cas9, sono trasfettati in RBCs e utilizzati per modificare il genoma del p. falciparum parassiti. Infine, descriviamo una reazione a catena della polimerasi (PCR)-tecnica per verificare l'integrazione del ribozima tag e glmS basata. Questo protocollo è altamente adattabile per la modifica o la completa eliminazione di eventuali geni di p. falciparum , aumentando la nostra capacità di generare nuove intuizioni riguardanti la biologia del parassita della malaria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

La malaria è una causa significativa della morbosità e della mortalità in tutto il mondo. Questa malattia, che colpisce soprattutto coloro che vivono nelle regioni tropicali e subtropicali, è causata da infezione con parassiti del plasmodio . Lo sviluppo di farmaci più efficaci per combattere la malaria può essere accelerato da migliorare la nostra comprensione della biologia di questo parassita complesso. Manipolazione genetica di questi parassiti è la chiave per comprendere la loro biologia; Tuttavia, il genoma del p. falciparum è storicamente difficile da manipolare. Recentemente, è stato utilizzato CRISPR/Cas9 editing genomico in parassiti della malaria, consentendo per la proteina più semplice tagging, generazione di atterramenti proteina condizionale e delezione dei geni. L'editing genomico CRISPR/Cas9 ha dimostrato di essere un potente strumento per far progredire il campo della ricerca sulla malaria. Qui, descriviamo un metodo CRISPR/Cas9 per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in p. falciparum. Questo metodo è altamente adattabile ad altri tipi di manipolazioni genetiche, tra cui proteine tagging e knockout del gene.

Uno schema dei plasmidi utilizzati in questo metodo, così come un esempio di una mutazione di scudo sono mostrati nella Figura 1. Come un esempio di come identificare parassiti mutanti dopo trasfezione, risultati da PCRs per controllo integrazione del costruttoglmS ettari - sono riportati in Figura 2. Un'immagine rappresentativa di una piastra di clonazione è illustrata nella Figura 3 per ...

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CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Descriviamo un metodo per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in Plasmodium falciparum utilizzando CRISPR/Cas9 editing genomico.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nella biologia del parassita della malaria umana, P.Falciparum, aiutando a scoprire la funzione proteica attraverso il knockdown condizionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette una generazione relativamente facile di mutanti condizionali rispetto ai metodi precedenti. Per iniziare, vai a Chop Chop e seleziona Fasta Target'Under Target, incolla le 200 coppie di basi dalle tre estremità principali del frame di lettura aperto di un gene e 200 coppie di basi dall'inizio dei tre UTR primi del gene.In In'select P.Falciparum' e selezionare CRISPR/Cas9'under Using'Next, fare clic su Trova siti di destinazione'Selezionare una sequenza di gRNA tra le opzioni presentate, privilegiando il gRNA più efficiente più vicino al sito di modifica e con il minor numero di siti fuori destinazione. Acquista la sequenza di gRNA e il suo complemento inverso come oligo purificato di elettroforesi in gel di poliacrilammide. La sequenza di gRNA utilizzata per colpire PfH-sp70x può essere trovata nel protocollo di testo.Aggiungere 40 microgrammi ciascuno di DNA pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA-glmS in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 millimetri. Aggiungere un decimo del volume di DNA di tre acetato di sodio molare in acqua al tubo e mescolarlo bene usando un vortice. Quindi, aggiungere 2,5 volte il volume di etanolo al 100% al tubo e mescolarlo bene usando un vortice per almeno 30 secondi.Posizionare il tubo sul ghiaccio o a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, centrifuga il tubo a 18.300 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante dal tubo senza disturbare il pellet.Aggiungere tre volte il volume del 70% di etanolo al tubo e mescolarlo brevemente usando un vortice. Centrifugare il tubo a 18.300 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Ancora una volta, rimuovere con cura il supernatante dal tubo senza disturbare il pellet.Lasciare il tubo aperto e lasciare asciugare il pellet per 15 minuti. Conservare il DNA precipitato a meno 20 gradi Celsius fino a quando non è necessario per la trasfezione. Per trasfetto gli RBC, preparare il buffer 1X cytomix e l'RPMI incompleto e completo come descritto nel protocollo di testo.Filtrare sterilizzare il buffer utilizzando un filtro da 0,22 micron. Aggiungere 380 microlitri della 1X cytomix al DNA e al vortice per dissolversi. Lasciare sciogliere il DNA nel 1X cytomix per 10 minuti, vortice ogni tre minuti per 10 secondi.In un tubo conico sterile da 15 millilitri, unire 300 microlitri di RBC umani isolati nell'RPMI incompleto con quattro millilitri di 1X cytomix. Centrifuga gli RBC a 870 volte G per tre minuti. Quindi rimuovere il supernatante dal pellet RBC.Sospendere di nuovo il pellet RBC con la miscela DNA-cytomix e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione di 0,2 centimetri. Porate gli RBC utilizzando le condizioni elencate nel protocollo di testo. Dopo l'elettroporazione, trasferire il contenuto dalla cuvetta ad un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI completo.Centrifugare il tubo a 870 volte G per tre minuti a 20 gradi Celsius. Quindi, decantare il supernatante. Ora, sospendere di nuovo il pellet in quattro millilitri di RPMI completo e trasferirlo in un pozzo in una piastra di coltura tissutale a sei pozzi.Aggiungete 400 microlitri di coltura ad alto schizont agli RBC trasferiti. Mantenete tutte le colture a 37 gradi Celsius sotto il 3% di ossigeno, il 3% di CO2 e il 94% di azoto. Il giorno dopo, lavare la coltura con quattro millilitri di RPMI completo.Centrifugare la coltura a 870 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante. Sospendere di nuovo la coltura in quattro millilitri di RPMI completo.48 ore dopo, lavare la coltura con quattro millilitri di RPMI completo. Quindi, sospendere di nuovo la coltura in RPMI completo contenente un DSM1 micromolare da selezionare per il plasmide Cas9. Dopo questo punto, sostituire il mezzo di coltura con RPMI fresco completo più un DSM1 micromolare ogni 48 ore.Continua a lavare le colture ogni giorno con RPMI completo fino a quando i parassiti non sono più visibili dallo striscio di sangue. Per fare uno striscio di sangue, pipettare 150 microlitri di coltura in un tubo di centrifuga da 0,6 millilitri. Dopo aver pellettato le cellule per centrifugazione a 1.700 volte G per 30 secondi, aspirare fuori dal supernatante.Utilizzare una pipetta per trasferire le celle a pellet in uno scivolo di vetro. Utilizzando un secondo scivolo di vetro tenuto con un angolo di 45 gradi alla prima diapositiva, spalmare la goccia di sangue. Macchiare la diapositiva utilizzando un kit di colorazione disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.Guarda i parassiti usando l'obiettivo 100 volte l'immersione dell'olio. A partire da cinque giorni dopo la trasfezione, rimuovere due millilitri della coltura con RBC ri-sospesi nel mezzo di coltura. Aggiungere indietro due millilitri di mezzo fresco e sangue al due per cento di ematocrito.Aggiungere sangue fresco in questo modo una volta alla settimana fino a quando il parassita non riappare, come determinato da sottile striscio di sangue. Eseguire diluizioni seriali della coltura parassita per ottenere una concentrazione finale di 0,5 parassiti per 200 microlitri. Aggiungere 200 microlitri della coltura diluita ai pozzi di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzoli.Mantenere la piastra di clonazione fino a quando i parassiti non sono rilevabili nei pozzi. Ogni 48 ore, sostituire il mezzo nella piastra da 96 pozzi con mezzo fresco. Una volta alla settimana, a partire da cinque giorni dall'inizio della piastra di clonazione, rimuovere 100 microlitri da ogni pozzo e aggiungere indietro 100 microlitri di mezzo fresco più sangue.Per identificare eventuali pozzi contenenti parassiti, posizionare la piastra di 96 po 'con un angolo di 45 gradi per circa 20 minuti, consentendo al sangue di depositarsi ad angolo all'interno della piastra. Quindi, posizionare la piastra da 96 po 'su una scatola luminosa. Si noti che i pozzi contenenti parassiti contengono mezzi di colore giallo, rispetto ai mezzi rosa dei pozzi senza parassiti, a causa dell'acidificazione del mezzo da parte dei parassiti.Utilizzando una pipetta sierologica, spostare il contenuto dei pozzi contenenti parassiti su una piastra di coltura tissutale di 24 pozzi per consentire l'espansione della parasitemia. Utilizzando l'analisi PCR, controllare queste linee di parassiti clonali per una corretta integrazione. I risultati di un test di immunofluorescenza sono mostrati qui, dimostrando il tagging HA con successo di PfH-sp70x.I parassiti glmS PfH-sp70x sono stati fissati e macchiati con DAPI come marcatore del nucleo, così come gli anticorpi contro ha. Proteina ricca di istidina associata alla membrana, un marcatore dell'esportazione di proteine nell'RBC ospite. Qui viene mostrata un'analisi Western Blot del livello proteico PfH-sp70x dopo il trattamento con glucosamina. Come previsto, il livello proteico diminuisce durante la durata del trattamento.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della parassitologia per indagare le questioni fondamentali nella biologia del parassita della malaria. È importante ricordare che P.Falciparum è un agente patogeno trasportato dal sangue e dovrebbero essere indossati adeguati dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Ricerca

Genetica

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CrispR-Cas9-Mediato Genome Editing nel Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...