Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

우리 조지아 대학 (UGA) 생물 현미경 핵심 기술 지원 Muthugapatti Kandasamy와 호세 후안 로페즈-루비 오 pUF1 Cas9 및 pL6 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사. 이 작품 호 재단 수상 D.W.C. 하 고 H.M.K.에 의해 지원 되었다 UGA 시작 자금 V.M., V.M., 그리고 미국 국립 보건원에 천 재단 (바 질 오 코너 스타터 학술 연구 상)의 3 월에서에서 보조금을 부여 (R00AI099156 및 R01AI130139) V.M. 하 고 (T32AI060546) H.M.K.를

P. falciparum 에의 지속적인 문화 인간의 RBCs의 사용을 요구 하 고 우리 모든 식별자의 박탈 되었고 익명 혈액의 상업적으로 구입한 단위를 활용. 제도적 검토 보드와 조지아 대학에서 Biosafety 사무실 우리의 프로토콜을 검토 하 고 우리가 실험실에서 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했다.
1. gRNA 시퀀스 선택
<ol><li>CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/)에 고 ' Fasta 대상 '을 ?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

CRISPR/Cas9 P. falciparum 에 구현은 모두의 효율성을 증가 하 고 기생충의 게놈, 유전자 조작의 이전 방법에 비해 수정에 필요한 시간을 감소. 이 포괄적인 프로토콜 P. falciparum에 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 돌연변이 생성에 필요한 단계를 설명 합니다. 여기 방법은 하-glmS 돌연변이의 발생을 위해 특별히 기어 드,이 전략의 다양 한 요구, 유전자, 유전자 녹아웃 그리고 점 돌연변이...

말라리아 속 변형 체의 protozoan 기생충에 의해 발생 하는 치명적인 질병 이다. P. falciparum, 대부분 치명적인 인간 말라리아 기생충 51세 미만의 아이 들에서 주로 년 당 약 445,000 사망자를 발생합니다. 변형 체 기생충 모기 벡터와 척추와 관련 된 복잡 한 라이프 사이클 있다. 인간은 먼저 감염 된 모기는 혈액 식사 때 감염 될. 그런 다음, 기생충 어디 그것은 성장, 발전 하 고 분할 약 1 주일 간 침공. 이 과정 후, 기생충은 어디 그들이 받을 성적 복제 적혈구 (Rbc)에 혈 류로 발표 됩니다. Rbc 내 기생충의 성장을 직접 말라리아2와 관련 된 임상 증상에 대 한 책임이 있습니다.
최근까지, 유전자 변형 P. falciparum 에의 생산 힘 드는 과정, 몇 달 동안을 했다 하 고 높은 고장율을 했다 약물 선택의 여러 라운드를 포함 했다. 이 시간이 걸리는 절차 relieson 무작위 DNA의 세대 나누기 관심 영역에 비록 그것의 게놈을 고쳐야 하는 기생충의 내 생 능력 동종 수리3,,45,6 . 최근, 클러스터 정기적으로 Interspaced 구조 반복/Cas9 (CRISPR/Cas9) 게놈 편집은 성공적으로 이용 되어 P. falciparum7,8. 말라리아 연구에서이 새로운 기술의 도입이 치명적인 변형 체 기생충의 생물학의 이해를 발전에 대 한 중요 한 되었습니다. CRISPR/Cas9 가이드 동종 관심사의 유전자는 RNAs (gRNAs)을 통해 유전자의 특정 대상에 대 한 수 있습니다. GRNA/Cas9 복잡 한 gRNA를 통해 유전자 인식 하 고 Cas9 다음 유기 체9,10수리 메커니즘의 개시를 강제로 이중 가닥 브레이크 소개. P. falciparum 복구 비 동종 끝에 합류를 통해 DNA 나누기 기계 부족, 때문에 그것은 동종 재결합 메커니즘을 활용 하 고 Cas9/gRNA-유도 복구 동종 transfected DNA 템플릿을 통합합니다 두 배 물가 틈11,12.
여기, 선물이 프로토콜 P. falciparum 에 조건부 최저의 돌연변이의 발생을 위한 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용 하 여. 프로토콜에는 PfHsp70x의 조건에 따라 최저 단백질 수준 glmS ribozyme의 사용 방법을 보여 줍니다 (PF3D7_0831700)는 보호자 여 내보낸 P. falciparum 호스트에 Rbc13,14. GlmS ribozyme 다니엘의 관련된 mRNA, 단백질14에 있는 감소에 지도를 (어떤 셀에 글루코사민-6-인산으로 변환 됩니다) 글루코사민 치료 활성화 됩니다. 이 프로토콜 불안 도메인 또는 RNA aptamers4,,515등 다른 조건부 최저의 도구 활용을 쉽게 적응 될 수 있다. 우리의 프로토콜 내용을 조류 (HA) 태그와 glmS ribozyme 코딩 시퀀스 시퀀스에 의해 형벌의 구성 된 수리 플라스 미드의 세대는 동종 PfHsp70x 열려있는 독서 프레임 (ORF)와 3'-UTR에 있습니다. 우리는 또한 드라이브 식는 gRNA의 두 번째 플라스 미드의 생성을 설명합니다. 드라이브 Cas9의 표현 제 3 함께 이러한 두 개의 플라스 미드는 Rbc로 페 고 P. falciparum 기생충의 게놈을 수정 하는 데 사용. 마지막으로, 우리는 연쇄 반응 (PCR) 기술-태그와 glmS ribozyme의 통합을 확인 하는 기술을 기반으로. 이 프로토콜은 수정 이나 말라리아 기생충의 생물학에 새로운 통찰력을 생성 하는 우리의 기능을 강화, 어떤 P. falciparum 유전자의 완전 한 녹아웃에 대 한 높은 적응력입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

말라리아 병 적 상태와 사망률 전세계의 중요 한 원인입니다. 주로 열 대와 아열대 지역에 그 생활에 영향을 미치는,이 질병은 변형 체 기생충 감염에 의해 발생 합니다. 전투 말라리아에 더 효과적인 약물의 개발이 복잡 한 기생충의 생물학의 우리의 이해를 개선 하 여 가속 될 수 있다. 이 기생충의 유전자 조작; 그들의 생물학을 이해 하는 열쇠 이다 그러나, 역사적으로의 P. falciparum 게놈이 되었습니다 조작 하기 어려운. 최근, CRISPR/Cas9 게놈 편집 태그, 조건부 단백질 knockdowns의 생성 및 유전자의 삭제 쉽게 단백질에 대 한 허용 하는 말라리아 기생충에 이용 되어 있다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 말라리아 연구의 분야를 발전을 위한 강력한 도구가 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 glmS생성 하는 CRISPR/Cas9 방법 설명- P. falciparum에 조건부 최저의 돌연변이 기반으로. 이 메서드는 매우 다른 종류의 유전자 조작, 단백질 태그를 포함 하 여 및 유전자 녹아웃에 적응할 수 있습니다.

방패 돌연변이의 예가이 방법에서 사용 되는 플라스 미드의 회로도 그림 1에 나와 있습니다. Transfection 후 돌연변이 기생충을 식별 하는 방법의 예를 들어, HA-glmS 구문의 통합 검사 PCRs에서 결과 그림 2에 표시 됩니다. 복제 판의 대표 이미지 기생충의 매체의 색상 변화를 설명 하기 위해 그림 3 에 표?...

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CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

이 방법은 조건부 녹다운을 통해 단백질 기능을 발견하는 것을 도움으로써 인간 말라리아 기생충, P.Falciparum의 생물학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 방법에 비해 조건부 돌연변이의 비교적 쉬운 생성을 허용한다는 것입니다. 시작하려면, 잘라 잘라 내고 Fasta Target'Under Target'Under Target을 선택하고 유전자의 열린 판독 프레임의 3개의 프라임 엔드에서 200개의 기본 쌍을 붙여넣으며 유전자의 3가지 주요 UTR의 시작부터 200개의 기본 쌍을 붙여넣습니다.In'select P.Falciparum'에서 '다음 사용'에서 CRISPR/Cas9'를 선택하면 대상 사이트 찾기를 클릭'표시옵션에서 gRNA 시퀀스를 선택하여 수정 사이트에 가장 가깝고 대상 사이트가 가장 적은 gRNA를 선호합니다. gRNA 서열과 폴리아크릴아미드 젤 전기포고정제로 그 역보체를 구입한다. PfH-sp70x를 대상으로 하는 데 사용되는 gRNA 서열은 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있다.pMK-U6, pUF1-Cas9 및 pHA-glmS DNA 각각 40마이크로그램을 멸균 1.5mm 원심분리기 튜브에 추가합니다. 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 DNA 부피의 1/10을 물에 넣고 소용돌이를 사용하여 잘 섞습니다. 그런 다음 튜브에 100% 에탄올의 2.5배의 부피를 추가하고 적어도 30초 동안 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다.튜브를 얼음 위에 놓거나 영하 20도에서 30분 동안 보관하십시오. 그런 다음, 4섭씨에서 30분 동안 18, 300회 G에서 튜브를 원심분리합니다. 원심 분리에 따라 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하십시오.튜브에 70%의 에탄올 의 3배를 넣고 소용돌이를 사용하여 짧게 섞습니다. 18, 300회 G에서 튜브를 섭씨 4도에서 30분간 원심분리합니다. 다시 말하지만, 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하십시오.튜브를 열어 놓고 펠릿이 15분 동안 건조하게 됩니다. 침전된 DNA를 섭씨 영하 20도에서 섭씨 로 저장하여 감염에 필요할 때까지 보관하십시오. RPC를 변환하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1X 사이토믹스 버퍼뿐만 아니라 불완전하고 완전한 RPMI를 준비합니다.필터는 0.22 미크론 필터를 사용하여 버퍼를 살균합니다. 1X 사이토믹스의 마이크로리터 380을 DNA와 소용돌이에 추가하여 용해합니다. DNA가 1X 사이토믹스에 10분 동안 용해되도록 하고, 10초 동안 3분마다 소용돌이를 피합니다.멸균, 15 밀리리터 원칼 튜브, 결합 300 불완전한 RPMI에 고립 된 인간 RPC의 마이크로 리터 와 1X 사이토 믹스의 4 밀리리터. 3분 동안 870배 G로 RBC원심분리. 그런 다음 RBC 펠릿에서 상체를 제거합니다.DNA-사이토믹스 혼합물로 RBC 펠릿을 다시 중단하고 0.2센티미터 의 전기 기공 큐벳으로 옮춥니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 조건을 사용하여 RBC를 porate합니다. 전기화 후, 쿠벳에서 완전한 RPMI의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원추형 튜브로 내용을 전송합니다.20°C에서 3분간 870회 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음, 상체를 decant. 지금, 완전한 RPMI의 4 밀리리터에 있는 펠릿을 다시 중단하고 6 웰 조직 배양 판에 있는 1개로 잘 전송합니다.전송된 RCC에 높은 치존 배양의 400 마이크로리터를 추가합니다. 다음 날, 완전한 RPMI의 네 밀리리터로 문화를 씻어.3 분 동안 870 배 G에서 문화를 원심 분리합니다. 상체를 흡인합니다. 완전한 RPMI의 4 밀리리터에서 문화를 다시 중단합니다.48시간 후, 완전한 RPMI의 4밀리리터로 문화를 씻어내라. 그런 다음, Cas9 플라스미드에 대해 선택하기 위해 하나의 마이크로몰러 DSM1을 포함하는 완전한 RPMI에서 배양을 다시 중단한다. 이 시점 이후에는 배양 매체를 48시간마다 신선한 완전 RPMI와 1개의 마이크로몰러 DSM1로 교체하십시오.기생충이 더 이상 혈액 얼룩에 의해 보이지 않는 때까지 완전한 RPMI로 매일 문화를 세척하십시오. 혈액 얼룩을 만들기 위해, 파이펫 150 마이크로 리터 의 배양에 0.6 밀리 리터 원심 분리튜브. 30초 동안 1, 700회 G에서 원심분리로 세포를 펠릿화한 후, 상류체를 흡인시한다.파이펫을 사용하여 펠릿 셀을 유리 슬라이드로 옮기십시오. 첫 번째 슬라이드에 45도 각도로 유지되는 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 혈액 방울을 얼룩지게합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 염색 키트를 사용하여 슬라이드를 염색합니다.100배의 오일 침수 목표를 사용하여 기생충을 볼 수 있습니다. 5일 간의 전환 후, 배양 배지에서 다시 중단된 RBC를 통해 문화의 2밀리리터를 제거합니다. 2%의 헤마토크릿에 신선한 배지와 혈액의 2밀리리터를 다시 넣습니다.기생충이 다시 나타날 때까지 일주일에 한 번이 방식으로 신선한 혈액을 추가, 얇은 혈액 얼룩에 의해 결정. 기생충 문화의 연쇄 희석을 수행하여 200 마이크로리터 당 0.5 기생충의 최종 농도를 달성하십시오. 희석 된 배양의 마이크로 리터 200을 96 웰 조직 배양 판의 우물에 추가하십시오.기생충이 우물에서 검출될 때까지 복제 플레이트를 유지하십시오. 매 48 시간, 신선한 매체와 96 잘 접시에 매체를 교체합니다. 복제 플레이트를 시작한 후 5일 후에 일주일에 한 번 각 우물에서 100마이크로리터를 제거하고 신선한 배지와 혈액 100마이크로리터를 다시 추가합니다.기생충을 포함하는 모든 우물을 확인하기 위해, 혈액이 플레이트 내의 각도로 정착 할 수 있도록 약 20 분 동안 45도 각도로 96 웰 플레이트를 배치합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 라이트 박스에 놓습니다. 기생충을 함유한 우물에는 기생충에 의한 배지의 산성화로 인해 기생충이 없는 우물의 분홍색 매체에 비해 색으로 황색인 배지가 포함되어 있습니다.혈청 경피를 사용하여 기생충 함유 우물의 내용을 기생충의 팽창을 허용하기 위해 24웰 조직 배양 판으로 이동합니다. PCR 분석을 사용하여 이러한 클로날 기생충 라인을 확인하여 올바른 통합을 확인하십시오. 면역 형광 분석의 결과는 PfH-sp70x의 성공적인 HA 태깅을 보여주는 여기에서 표시됩니다.PfH-sp70x glmS 기생충은 HA에 대한 항체뿐만 아니라 핵 마커로서 DAPI로 고정및 염색되었다. 멤브레인-관련 히스티딘 풍부한 단백질 하나, 숙주 RBC에 단백질 수출의 마커. 글루코사민으로 치료한 후 PfH-sp70x 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석이 여기에 나와 있다. 예상대로, 단백질 수준은 치료 기간 동안 감소합니다.이 기술은 말라리아 기생충의 생물학에 있는 근본적인 질문을 조사하기 위하여 기생충학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다. P.Falciparum은 혈액 매개 병원체이며 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

연구

유전학

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...