Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Vi takker Muthugapatti Kandasamy ved University of Georgia (UGA) biomedisinsk mikroskopi kjernen for kundestøtte og Juan Jose-Lopez-Rubio for deling plasmider pUF1-Cas9 og pL6. Dette arbeidet ble støttet av BUER Foundation priser D.W.C. og H.M.K., UGA oppstart midler til V.M., tilskudd fra mars Dimes Foundation (basilikum O'Connor Starter Scholar forskning Award) V.M. og oss National Institutes of Health gir (R00AI099156 og R01AI130139) til V.M. og (T32AI060546) til H.M.K.

Kontinuerlig kultur P. falciparum krever bruk av menneskelige RBCs, og vi utnyttet kjøpt kommersielt enheter av blod som ble fratatt alle identifikatorer og anonymiseres. Institusjonelle gjennomgang styret og Office biosikkerhet ved University of Georgia anmelder våre protokoller og godkjent alle protokollene som brukes i vår lab.
1. velge en gRNA rekkefølge
<ol><li>Gå til CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) og velg "Fasta mål". Under "Mål", lime 200 base...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

Gjennomføringen av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både for og redusert mengden tid for å endre det parasite genom, sammenlignet med tidligere metoder for genetisk manipulasjon. Denne omfattende protokollen beskriver trinnene nødvendig for å generere betinget mutanter bruker CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Mens metoden her er rettet spesielt for generering av HA -glmS mutanter, kan denne strategien tilpasses for ulike behov, inkludert merking av gener, gene fortrenging og innføring av punkt ...

Malaria er en ødeleggende sykdom forårsaket av protozoan parasitter av slekten Plasmodium. P. falciparum, de fleste dødelig menneskelig malariaparasitten, forårsaker ca 445.000 dødsfall per år, hovedsakelig i barn under fem1. Plasmodium parasitter har en intrikat livssyklus som involverer en mygg vektor og en virveldyr vert. Mennesker bli først infisert når en infisert mygg tar en blod måltid. Deretter invaderer parasitten leveren hvor det vokser, utvikler og deler i ca en uke. Etter denne prosessen frigis parasitter i blodet, hvor de gjennomgå aseksuell replikering i røde blodceller (RBCs). Veksten av parasitter i RBCs er direkte ansvarlig for kliniske symptomer assosiert med malaria2.
Inntil nylig var produksjonen av transgene P. falciparum en arbeidskrevende prosess, som involverer flere runder med narkotika utvalg som tok mange måneder og hadde en høy strykprosent. Dette tidkrevende prosedyre relieson bryter generering av tilfeldige DNA i regionen rundt og endogene evnen av parasitten å reparere dens Genova skjønt homologe reparasjon3,4,5,6 . Nylig har gruppert regelmessig Interspaced Palindromic gjenta/Cas9 (CRISPR/Cas9) genomet redigering blitt vellykket utnyttet i P. falciparum7,8. Innføringen av denne nye teknologien i malaria forskning har vært avgjørende for fremme forståelse av biologi av disse dødelige Plasmodium parasitter. CRISPR/Cas9 gir spesifikke målretting av gener gjennom guide RNAs (gRNAs) som er homologe til genet av interesse. GRNA/Cas9 komplekse gjenkjenner genet gjennom gRNA, og Cas9 deretter introduserer en dobbel-strand pause, tvinge initiering av reparasjonsmekanismene i organismen9,10. Fordi P. falciparum mangler maskiner for å reparere DNA bryter gjennom ikke-homologe slutten å delta, det utnytter homologe rekombinasjon mekanismer og integrerer transfekterte homologe DNA maler for å reparere Cas9/gRNA-indusert dobbel-strand pause11,12.
Her presenterer vi en protokoll for generering av betinget knockdown mutanter i P. falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering. Protokollen demonstrerer bruken av glmS ribozyme til betinget knockdown protein nivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), en Anstandsdame eksporteres av P. falciparum til verten RBCs13,14. GlmS -ribozyme aktiveres ved behandling med glucosamine (som er konvertert til glucosamine-6-fosfat i celler) for å holde seg sin tilknyttede mRNA, fører til en reduksjon i protein14. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å utnytte andre betinget knockdown verktøy, for eksempel destabilisering domener eller RNA aptamers4,5,15. Våre protokollen detaljer generering av en reparasjon plasmider bestående av en hemagglutinin (HA) koden og glmS ribozyme koding sekvens flankert av sekvenser som er homologe til PfHsp70x åpent lesing rammen (ORF) og 3-UTR. Vi beskriver også generering av en andre plasmider til stasjonen uttrykk for gRNA. Disse to plasmider, samt en tredje som driver uttrykk for Cas9, er transfekterte i RBCs og brukes til å endre genomet av P. falciparum parasitter. Til slutt, beskriver vi en polymerasekjedereaksjons (PCR)-basert teknikk for å kontrollere integrering av koden og glmS ribozyme. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktige for endring eller fullstendig knockout av noen P. falciparum gener, styrke vår evne til å generere ny innsikt i biologi av malariaparasitten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

Malaria er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Denne sykdommen, som hovedsakelig påvirker de som lever i tropiske og subtropiske områder, skyldes infeksjon med Plasmodium parasitter. Utvikling av mer effektiv narkotika for å bekjempe malaria kan akselereres ved å forbedre vår forståelse av biologi denne komplekse parasitten. Genetisk manipulering av disse parasittene er nøkkelen til å forstå deres biologi; men har historisk genomet av P. falciparum vært vanskelig å manipulere. Nylig har CRISPR/Cas9 genomet redigering blitt utnyttet under parasitten, noe som åpner for enklere protein merking, generasjon av betinget protein bokseren, og sletting av gener. CRISPR/Cas9 genomet redigering har vist seg for å være et kraftig verktøy for å fremme feltet malaria forskning. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-metoden for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i P. falciparum. Denne metoden er svært tilpasningsdyktige til andre typer genetisk manipulasjon, inkludert protein merking og gene fortrenging.

En skjematisk av plasmider brukes i denne metoden som et eksempel på en skjold mutasjon er vist i figur 1. Som et eksempel på hvordan å identifisere mutant parasitter etter transfection, vises resultatene fra PCRene for å sjekke integrering av HA -glmS Konstruer i figur 2. Et representativt bilde av en kloning plate er vist i Figur 3 å vise fargeendring av mediet i nærvær av parasitte...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Vi beskriver en metode for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i Plasmodium falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i biologien til den menneskelige malariaparasitten, P.Falciparum, ved å bidra til å avdekke proteinfunksjon gjennom betinget knockdown. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir mulighet for relativt enkel generering av betingede mutanter sammenlignet med tidligere metoder. Til å begynne med går du til Chop Chop og velger Fasta Target'Under Target, limer inn de 200 basisparene fra de tre viktigste enden av den åpne leserammen til et gen og 200 basispar fra starten av genets tre fremste UTR.Under In'select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next klikker du Finn målområder'Velg en gRNA-sekvens fra alternativene som presenteres, noe som gir preferanse til det mest effektive gRNA-området som er nærmest endringsstedet, og som har færrest off-target-nettsteder. Kjøp gRNA-sekvensen og dens omvendte komplement som polyakrylamid gel elektroforese renset oligos. GRNA-sekvensen som brukes til å målrette PfH-sp70x, finnes i tekstprotokollen.Tilsett 40 mikrogram hver av pMK-U6, pUF1-Cas9 og pHA-glmS DNA i et sterilt sentrifugerør på 1,5 millimeter. Tilsett en tiendedel av volumet av DNA av tre molar natriumacetat i vann til røret og bland det godt ved hjelp av en virvel. Deretter legger du til 2,5 ganger volumet på 100 prosent etanol til røret og blander det godt ved hjelp av en virvel i minst 30 sekunder.Plasser røret på is eller ved minus 20 grader Celsius i 30 minutter. Deretter sentrifuger røret ved 18, 300 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering, fjern forsiktig supernatanten fra røret uten å forstyrre pelleten.Tilsett tre ganger volumet på 70 prosent etanol til røret og bland det kort ved hjelp av en virvel. Sentrifuger røret ved 18, 300 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Igjen, fjern forsiktig supernatanten fra røret uten å forstyrre pelleten.La røret stå åpent og la pelleten lufttørke i 15 minutter. Oppbevar det utfelte DNA-et ved minus 20 grader Celsius til det er nødvendig for transinfeksjon. Hvis du vil transfisere RBC-er, klargjør du 1X cytomixbuffer samt ufullstendig og fullstendig RPMI som beskrevet i tekstprotokollen.Filter steriliser bufferen ved hjelp av et 0,22 mikronfilter. Tilsett 380 mikroliter av 1X cytomix til DNA og vortex for å oppløse. La DNA oppløses i 1X cytomix i 10 minutter, virvle hvert tredje minutt i 10 sekunder.I et sterilt, 15 milliliter konisk rør, kombinere 300 mikroliter isolerte menneskelige RBC-er i den ufullstendige RPMI med fire milliliter 1X cytomix. Sentrifuger RBC-ene ved 870 ganger G i tre minutter. Fjern deretter supernatanten fra RBC pellet.Suspender RBC pelleten igjen med DNA-cytomixblandingen og overfør den til en 0,2 centimeter elektroporasjonscuvette. Porate RBCene ved hjelp av betingelsene som er oppført i tekstprotokollen. Etter elektroporasjon, overfør innholdet fra cuvette til en 15 milliliter konisk rør som inneholder fem milliliter med fullstendig RPMI.Sentrifuger røret ved 870 ganger G i tre minutter ved 20 grader Celsius. Deretter dekantere supernatant. Nå, re-suspendere pellet i fire milliliter av komplett RPMI og overføre til en brønn i en seks-brønns vev kultur plate.Tilsett 400 mikroliter av en høy schizontkultur til de overførte RBCene. Oppretthold alle kulturene ved 37 grader Celsius under tre prosent oksygen, tre prosent CO2 og 94 prosent nitrogen. Neste dag, vask kulturen med fire milliliter med komplett RPMI.Sentrifuge kulturen på 870 ganger G i tre minutter. Aspirer det overnaturante. Re-suspendere kulturen i fire milliliter med komplett RPMI.48 timer senere, vask kulturen med fire milliliter med komplett RPMI. Deretter kan du suspendere kulturen i fullstendig RPMI som inneholder én mikromos DSM1 for å velge for Cas9 plasmid. Etter dette punktet, erstatte kulturmediet med frisk komplett RPMI pluss en mikromos DSM1 hver 48 timer.Fortsett å vaske kulturene hver dag med fullstendig RPMI til parasitter ikke lenger er synlige ved blodsmøring. For å lage blodsmøring, pipette 150 mikroliter av kultur i en 0,6 milliliter sentrifuge rør. Etter pelleting cellene ved sentrifugering ved 1, 700 ganger G i 30 sekunder, aspirer av supernatant.Bruk en pipette til å overføre pelleted cellene til et glass lysbilde. Bruk en annen glasssklie holdt i en 45 graders vinkel til det første lysbildet, smør bloddråpen. Beis lysbildet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig fargesett i henhold til produsentens protokoll.Se parasittene ved hjelp av 100 ganger olje-nedsenking mål. Fra og med fem dager etter transfection fjerner du to milliliter av kulturen med RBC-er som er suspendert på nytt i kulturmediet. Legg tilbake to milliliter friskt medium og blod på to prosent hematokrit.Tilsett friskt blod på denne måten en gang i uken til parasitten dukker opp igjen, som bestemt av tynt blodsmøring. Utfør seriefortynninger av parasittkulturen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0, 5 parasitter per 200 mikroliter. Tilsett 200 mikroliter av den fortynnede kulturen til brønnene til en 96-brønns vevskulturplate.Oppretthold kloningsplaten til parasitter kan oppdages i brønnene. Hver 48. En gang i uken, starter fem dager etter å ha startet kloning plate, fjerne 100 mikroliter fra hver brønn og legge tilbake 100 mikroliter av friskt medium pluss blod.For å identifisere eventuelle brønner som inneholder parasitter, legg 96-brønnplaten i en 45-graders vinkel i ca. 20 minutter, slik at blodet kan bosette seg i en vinkel i platen. Deretter plasserer du 96-brønnsplaten på en lysboks. Legg merke til at brønnene som inneholder parasitter inneholder medier som er gule i farge, sammenlignet med det rosa mediet av parasittfrie brønner, på grunn av forsuring av mediet av parasittene.Bruk en serologisk pipette, flytt innholdet i parasittholdige brønner til en 24-brønns vevskulturplate for å tillate utvidelse av parasittemien. Ved hjelp av PCR-analyse, sjekk disse klonale parasittlinjene for riktig integrering. Resultatene av en immunofluorescence analyse er vist her, viser vellykket HA merking av PfH-sp70x.PfH-sp70x glmS parasitter ble fikset og farget med DAPI som en kjernemarkør, samt antistoffer mot HA. Membran-assosiert histidin rik protein en, en markør for protein eksport til verten RBC. En Western Blot analyse av PfH-sp70x proteinnivå etter behandling med glukosamin er vist her. Som forventet reduseres proteinnivået i løpet av behandlingen.Denne teknikken baner vei for forskere innen parasitologi for å undersøke grunnleggende spørsmål i malariaparasittens biologi. Det er viktig å huske at P.Falciparum er et blodbåren patogen og passende personlig verneutstyr bør brukes mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering for å identifisere et stoffresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definerte genomisk modifikasjoner bruke CRISPR-CAS9 i Human Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-mediert genomredigering i filamentous ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...