Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Мы благодарим Muthugapatti Кандасами сердцевиной биомедицинских микроскопии университета Джорджии (UGA) для оказания технической помощи и Хуан Хосе Лопес-Рубио для совместного pUF1-Cas9 и pL6 плазмид. Эта работа была поддержана дуги Фонд награды для D.W.C. и H.M.K., предоставляет средства запуска UGA в.м., гранты от марта Dimes фонда (Basil о ' Коннор стартера ученый исследования Award) в.м., и нас национальных институтов здравоохранения (R00AI099156 и R01AI130139) к в.м. и (T32AI060546) для H.M.K.

Непрерывное культуры P. falciparum требует использования человека эритроциты, и мы использовали коммерчески приобретенных единиц крови, которые были лишены всех идентификаторов и анонимными. Обзор наших протоколов и утверждены все протоколы, используемые в нашей лаборатории институц...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

Осуществление ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в P. falciparum как повысить эффективность работы и уменьшилось количество времени, необходимое для изменения генома паразита, по сравнению с предыдущим методами генетической манипуляции. Этот всеобъемлющий протокол описаны шаги, необходимые для генерации...

Малярия является разрушительное заболевание, вызванное простейших паразитов рода Plasmodium. P. falciparum, наиболее смертоносной человека малярийного паразита, вызывает около 445 000 смертей в год, главным образом детей в возрасте до пяти1. Plasmodium паразиты имеют сложный жизненный цикл, с участием вектора комаров и позвоночных хост. Сначала люди заражаются когда зараженный комар берет крови еды. Затем паразит вторгается в печень, где он растет, развивается и делит приблизительно одну неделю. После этого процесса паразиты попадают в кровь, где они проходят бесполое репликации в красные кровяные клетки (эритроциты). Рост паразитов внутри эритроцитов непосредственно отвечают за клинические симптомы, связанные с малярией2.
До недавнего времени, производство трансгенных P. falciparum был трудоемкий процесс, с участием нескольких раундов выбора препарата, который занимает много месяцев и имел высокий коэффициент отказа. Это длительная процедура relieson генерации случайных ДНК влезает в регионе интереса и эндогенных способность паразита починить его генома хотя гомологичных ремонт3,4,5,6 . Недавно изменения генома кластерного регулярно Interspaced рецидивирующий Repeat/Cas9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) успешно использовались в P. falciparum7,,8. Введение этой новой технологии в исследований малярии играет решающую роль для углубления понимания биологии этих смертоносных Plasmodium паразитов. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 позволяет для конкретного нацеливания генов через руководство РНК (оформления), которые являются гомологичного гена интереса. Комплекс Cas9 gRNA признает гена через gRNA и Cas9 затем вводит двухручьевой перерыв, заставляя начала ремонт механизмов в организме9,10. Потому что P. falciparum не хватает техники для ремонта разрывы ДНК путем присоединения к не гомологичных конец, он использует механизмы гомологичная рекомбинация и интегрирует transfected гомологичных ДНК шаблоны для ремонта Cas9/gRNA индуцированной двухручьевой перерыв11,12.
Здесь мы представляем протокол для генерации условных нокдаун мутантов в P. falciparum с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Протокол демонстрирует использование glmS рибозима условно нокдаун белка уровни PfHsp70x (PF3D7_0831700), сопровождающий экспортируемые P. falciparum в принимающей RBCs13,14. GlmS рибозима активируется путем обращения с глюкозамином, (который преобразуется в глюкозамин-6-фосфат в клетках) для расщеплять связанные мРНК, приводит к уменьшению белков14. Этот протокол может быть легко адаптирована для использования других условных нокдаун инструменты, такие как дестабилизации доменов или РНК аптамеры4,5,15. Наши детали протокола поколения ремонта плазмида, состоящий из гемагглютинина (HA) тег и glmS рибозима кодирования последовательности параллельной последовательности, гомологичных PfHsp70x рамка чтения открытая (ORF) и 3'-УТР. Мы также описывают поколения второй плазмида диск выражение gRNA. Эти два плазмиды, вместе с третьим, что диски, проявление Cas9, transfected в эритроциты и используется для изменения генома P. falciparum паразитов. Наконец, мы описываем полимеразной цепной реакции (ПЦР)-на основе технику для проверки интеграции тег и glmS рибозима. Этот протокол является весьма гибкой для модификации или полный нокаут любой P. falciparum генов, повышение нашей способности генерировать новые идеи в биологии малярийного паразита.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

Малярия является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Эта болезнь, которая прежде всего затрагивает людей, живущих в тропических и субтропических районах, вызванного инфекцией с Plasmodium паразитов. Разработка более эффективных лекарственных препаратов для борьбы с малярией может быть ускорен путем улучшения нашего понимания биологии этого комплекса паразита. Генетические манипуляции этих паразитов является ключом к пониманию их биологии; Однако геном P. falciparum исторически трудно манипулировать. Недавно изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 был использован в малярийных паразитов, позволяющие проще белка, пометки, поколение нокдаунов условного белка и удаления генов. Изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 оказался мощным инструментом для продвижения области исследований малярии. Здесь мы описываем ТРИФОСФАТЫ/Cas9 метод для генерации glmS-на основе условного нокдаун мутантов в P. falciparum. Этот метод является весьма адаптированы для других типов генетических манипуляций, включая пометки белка и Джин нокауты.

На рисунке 1показаны схема плазмид, используемые в этот метод, а также пример щит мутации. В качестве примера как идентифицировать мутант паразитов после трансфекции результаты от PCRs для проверки интеграции ха -glmS конструкции показано на <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum

Мы описываем метод для генерации glmS-на основе условного нокдаун мутантов в Plasmodium falciparum с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологии человека малярийного паразита, P.Falciparum, помогая раскрыть функцию белка через условный нокдаун. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет относительно легкое поколение условных мутантов по сравнению с предыдущими методами. Для начала перейдите на Chop Chop и выберите Fasta Target'Under Target, вставьте 200 базовых пар из трех основных конце открытого считываемого кадра гена и 200 базовых пар с самого начала трех основных UTR гена.В соответствии с In'select P.Falciparum'and выберите CRISPR/Cas9'under Using'Next, нажмите Найти целевые сайты'Выберите последовательность gRNA из представленных вариантов, отдавая предпочтение наиболее эффективной гРНК, которая находится ближе всего к месту модификации и которая имеет несколько внецелеховых сайтов. Приобретете последовательность гРНК и ее обратное дополнение в качестве полиакриламинида гель электрофореза очищенных олиго. Последовательность gRNA, используемая для таргетинга pfH-sp70x, содержится в текстовом протоколе.Добавьте 40 микрограммов каждый из pMK-U6, pUF1-Cas9 и pHA-glmS DNA в стерильную 1,5-миллиметровую центрифугу. Добавьте одну десятую объема ДНК трех ацетатов молярного натрия в воду в трубку и хорошо перемешайте с помощью вихря. Затем добавьте в трубку в 2,5 раза объем 100-процентного этанола и хорошо перемешайте его с помощью вихря в течение по крайней мере 30 секунд.Поместите трубку на лед или при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Затем центрифуга трубки на 18, 300 раз G в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации, тщательно удалить супернатант из трубки, не нарушая гранулы.Добавьте в трубку в три раза больше 70-процентного этанола и смешайте его с помощью вихря. Центрифуга трубки при 18, 300 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Опять же, осторожно удалить супернатант из трубки, не нарушая гранулы.Оставьте трубку открытой и дайте грануле высохнуть в течение 15 минут. Храните осажденную ДНК при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пока она не необходима для трансфекции. Чтобы заразить РБК, подготовь 1X цитомикс буфер, а также неполный и полный RPMI, как описано в текстовом протоколе.Фильтр стерилизовать буфер с помощью фильтра 0,22 микрона. Добавьте 380 микролитров цитомикса 1X в ДНК и вихрь, чтобы раствориться. Разрешить ДНК растворяться в 1X cytomix в течение 10 минут, вихри каждые три минуты в течение 10 секунд.В стерильной, 15 миллилитровой конической трубке, объединить 300 микролитров изолированных человеческих RBCs в неполной RPMI с четырьмя миллилитров 1X cytomix. Центрифуга РБК в 870 раз G в течение трех минут. Затем удалите супернатант из гранулы РБК.Повторно приостанавливайте гранулы РБК смесью ДНК-цитомикс и перенесите ее на 0,2-сантиметровый кювет электропорации. Порист РБК, используя условия, перечисленные в текстовом протоколе. После электропорации перенесите содержимое из кювета в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров полного RPMI.Центрифуга трубки при 870 раз G в течение трех минут при 20 градусах по Цельсию. Затем, decant супернатант. Теперь, повторно приостановить гранулы в четыре миллилитров полного RPMI и передачи в один колодец в шесть хорошо ткани культуры пластины.Добавить 400 микролитров высокой культуры шизонта в переданных RBCs. Поддержание всех культур на 37 градусов по Цельсию под три процента кислорода, три процента CO2, и 94 процентов азота. На следующий день, мыть культуру с четырьмя миллилитров полного RPMI.Центрифуга культуры на 870 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатанта. Повторно приостановить культуру в четыре миллилитров полного RPMI.48 часов спустя, мыть культуру с четырьмя миллилитров полного RPMI. Затем повторно приостанавливать культуру в полном RPMI, содержащий один микромолейный DSM1, чтобы выбрать для плазмиды Cas9. После этого момента, заменить культуру среды со свежим полным RPMI плюс один микромоляной DSM1 каждые 48 часов.Продолжайте мыть культур каждый день с полным RPMI до тех пор, пока паразиты больше не видны мазок крови. Чтобы сделать мазок крови, пипетка 150 микролитров культуры в 0,6 миллилитров центрифуги трубки. После гранулирования клеток центрифугой в 1700 раз G в течение 30 секунд, аспирировать от супернатанта.Используйте пипетку для переноса гранулированную клетку на стеклянную горку. Используя второй стеклянный слайд, удерживаемый под углом 45 градусов к первому слайду, мазок капли крови. Пятно слайд с помощью коммерчески доступных окрашивания комплект в соответствии с протоколом производителя.Просмотр паразитов с помощью 100 раз нефти погружения цели. Начиная с пяти дней после трансфекции, удалите два миллилитров культуры с РБК повторно приостановлено в среде культуры. Добавить обратно два миллилитров свежей среды и крови на два процента гематокрита.Добавляйте свежую кровь таким образом один раз в неделю, пока паразит не появится снова, как это определено тонким мазком крови. Выполните серийные разбавления культуры паразитов для достижения окончательной концентрации 0,5 паразитов на 200 микролитров. Добавьте 200 микролитров разбавленной культуры в колодцы пластины культуры тканей 96 скважин.Поддерживайте клонирование пластины до тех пор, пока паразиты не будут обнаружены в колодцах. Каждые 48 часов, заменить средний в 96-хорошо пластины со свежей среде. Раз в неделю, начиная с пяти дней после начала клонирования пластины, удалить 100 микролитров из каждой хорошо и добавить обратно 100 микролитров свежей среды плюс кровь.Чтобы определить любые скважины, содержащие паразитов, поместите 96-хорошо пластины под углом 45 градусов в течение примерно 20 минут, что позволяет крови поселиться под углом внутри пластины. Затем поместите 96-хорошо пластины на световой ящик. Обратите внимание, что скважины, содержащие паразитов содержат средства массовой информации, которые желтого цвета, по сравнению с розовыми средствами без паразитов скважин, из-за подкисления среды паразитами.Используя серологическую пипету, переместите содержимое тунеядческих колодцев в 24-хорошо ткани культуры пластины, чтобы расширение паразитов. Используя анализ ПЦР, проверьте эти линии клональных паразитов для правильной интеграции. Результаты анализа иммунофлуоресценции показаны здесь, демонстрируя успешно HA пометки PfH-sp70x.PfH-sp70x glmS паразиты были зафиксированы и окрашены DAPI в качестве маркера ядра, а также антитела к HA. Мембран-связанный histidine богатый протеин одно, маркер экспорта протеина к хозяину РБК. Западный анализ пятно PfH-sp70x уровень белка после лечения глюкозамином показано здесь. Как и ожидалось, уровень белка снижается в течение всего срока лечения.Этот метод прокладывает путь для исследователей в области паразитологии для изучения фундаментальных вопросов в биологии малярийного паразита. Важно помнить, что P.Falciparum является патогеном, передающихся через кровь, и соответствующее средства индивидуальной защиты следует носить во время выполнения этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping и CRISPR / Cas9 для определения гена резистентности к лекарственным средствам в<em&gt; Токсоплазма гондии</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин-опосредовано Точное редактирование генов трубэлектрогенерации

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Опосредованное редактирование генома в filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...