Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Agradecemos Muthugapatti Kandasamy en el centro de microscopia Biomédica de Universidad de Georgia (UGA) para asistencia técnica y Juan Jose Lopez-Rubio por compartir la plásmidos pUF1 Cas9 y pL6. Este trabajo fue apoyado por premios de la Fundación de arcos D.W.C. y H.M.K., otorga fondos de inicio UGA a V.M., subvenciones de la Fundación marcha de Dimes (Premio de investigación de albahaca o ' Connor arrancador erudito) a V.M. y nos institutos nacionales de salud (R00AI099156 y R01AI130139) a V.M. y (T32AI060546) a H.M.K.

Continua el cultivo de p. falciparum requiere el uso de glóbulos rojos humanos, y se utilizaron comercialmente compradas unidades de sangre que fueron despojados de todos los identificadores y anonimizada. La Junta de revisión institucional y la oficina de seguridad de la biotecnología en la Universidad de Georgia revisaron nuestros protocolos y aprobaron todos los protocolos utilizados en nuestro laboratorio.
1. elegir un gRNA secuencia
<ol><li>Ir a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

La implementación de CRISPR/Cas9 en p. falciparum tiene tanto aumentó la eficacia de y redujeron la cantidad de tiempo necesario para modificar el genoma del parásito, en comparación con los métodos anteriores de manipulación genética. Este protocolo integral esboza los pasos necesarios para la generación de mutantes condicionales utilizando CRISPR/Cas9 en p. falciparum. Mientras que el método está orientado específicamente para la generación de mutantes deMLG HA -, esta estrategia ...

La malaria es una enfermedad devastadora causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium. P. falciparum, el parásito del paludismo humano mortal más, hace aproximadamente 445.000 muertes por año, sobre todo en niños menores de cinco1. Plasmodium parásitos tienen un ciclo de vida complicado con un vector mosquito y un hospedador vertebrado. En primer lugar los seres humanos se infectan cuando un mosquito infectado toma una comida de sangre. Luego, el parásito invade el hígado donde crece, se desarrolla y se divide por aproximadamente una semana. Después de este proceso, los parásitos se liberan en el torrente sanguíneo, donde se someten a la replicación asexual en células de sangre rojas (RBCs). Crecimiento de los parásitos en los glóbulos rojos son directamente responsables de los síntomas clínicos asociados con la malaria2.
Hasta hace poco, producción de transgénicos por p. falciparum fue un proceso laborioso, que implica varias rondas de selección de la droga que tomó muchos meses y tenían una tasa alta de fracaso. Este procedimiento desperdiciador de tiempo relieson la generación de DNA al azar rompe en la región de interés y la capacidad endógena del parásito para reparar su genoma aunque reparación homóloga3,4,5,6 . Recientemente, agrupadas regularmente otro palindrómico Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) edición del genoma ha sido exitosamente utilizada en p. falciparum7,8. La introducción de esta nueva tecnología en la investigación de la malaria ha sido fundamental para el avance de la comprensión de la biología de estos parásitos Plasmodium mortales. CRISPR/Cas9 permite la focalización específica de genes a través de guía RNAs (gRNAs) que son homólogos a los genes de interés. El gRNA/Cas9 complejo reconoce el gen por el gRNA y Cas9 introduce entonces una rotura de doble cadena, obligando a la iniciación de los mecanismos de reparación en el organismo9,10. Porque p. falciparum carece de la maquinaria para reparar roturas de DNA por unirse a final no homóloga, que utiliza mecanismos de recombinación homóloga e integra plantillas de ADN homólogas transfected para reparar el Cas9 gRNA-inducido rotura de doble cadena11,12.
Aquí, presentamos un protocolo para la generación de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edición del genoma. El protocolo muestra el uso de la ribozima MLG a niveles de proteína condicional precipitación de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un acompañante exportadas por p. falciparum en host gr13,14. La ribozima MLG es activado por el tratamiento con glucosamina (que se convierte en la glucosamina-6-fosfato en las células) para hender su mRNA asociados, llevando a una reducción de la proteína14. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para utilizar otras herramientas de precipitación condicionales, como dominios de desestabilización o RNA aptámeros4,5,15. Nuestros detalles del protocolo la generación de un plásmido de reparación que consta de un ribozima de etiqueta y glmS de hemaglutinina (HA) secuencia flanqueada por secuencias de codificación son homólogas a las PfHsp70x marco abierto de lectura (ORF) y 3'-UTR. También se describe la generación de un segundo plásmido de expresión de la unidad de la gRNA. Estos dos plásmidos, junto con un tercero que conduce la expresión de Cas9, transfected en glóbulos rojos y sirve para modificar el genoma de p. falciparum parásitos. Por último, se describe una reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-basado en la técnica para verificar la integración de la etiqueta y glmS ribozyme. Este protocolo es altamente adaptable para la modificación o completo octavos de final de cualquier genes de p. falciparum , mejorar nuestra capacidad de generar nuevos conocimientos sobre la biología del parásito de la malaria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

La malaria es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Esta enfermedad, que afecta sobre todo a los que viven en regiones tropicales y subtropicales, es causada por infección con los parásitos Plasmodium . El desarrollo de medicamentos más eficaces para combatir la malaria puede acelerarse mediante la mejora de nuestra comprensión de la biología de este parásito complejo. Manipulación genética de estos parásitos es clave para entender su biología; sin embargo, el genoma de p. falciparum ha sido históricamente difícil de manipular. Recientemente, CRISPR/Cas9 edición del genoma ha sido utilizada en parásitos de la malaria, permitiendo para la proteína más fácil etiquetado, generación de caídas de proteína condicional y canceladura de los genes. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha demostrado para ser una poderosa herramienta para avanzar en el campo de la investigación de la malaria. Aquí, describimos un método CRISPR/Cas9 para generar MLG-base de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum. Este método es altamente adaptable a otros tipos de manipulaciones genéticas, incluyendo proteína etiquetado y golpes de gracia del gene.

Figura 1muestra un esquema de lo plásmidos utilizados en este método, así como un ejemplo de una mutación de escudo. Como un ejemplo de cómo identificar parásitos mutantes después de transfección, resultados de PCRs para comprobar la integración de la construcción HA -MLG se muestran en la figura 2. Una imagen representativa de una clonación de la placa se muestra en la figura 3 p...

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CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Se describe un método para la generación de MLG-base condicionales mutantes precipitación usando CRISPR/Cas9 edición del genoma del falciparum del Plasmodium .

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del parásito de la malaria humana, P.Falciparum, ayudando a descubrir la función proteica a través de la eliminación condicional. La principal ventaja de esta técnica es que permite una generación relativamente fácil de mutantes condicionales en comparación con los métodos anteriores. Para comenzar, ve a Chop Chop y selecciona Fasta Target'Under Target, pega los 200 pares base del extremo principal del marco de lectura abierto de un gen y 200 pares base desde el inicio de los tres UTR primos del gen.En In'select P.Falciparum'and seleccione CRISPR/Cas9'en Using'Next, haga clic en Buscar sitios de destino'Seleccione una secuencia de GRNA de las opciones presentadas, dando preferencia al ARNN más eficiente que está más cerca del sitio de modificación y que tiene el menor número de sitios fuera de destino. Compra la secuencia de GRNA y su complemento inverso como oligos purificados de electroforesis de gel de poliacrilamida. La secuencia de GRNA utilizada para apuntar a PfH-sp70x se puede encontrar en el protocolo de texto.Agregue 40 microgramos cada uno de ADN pMK-U6, pUF1-Cas9 y pHA-glmS en un tubo estéril de centrífuga de 1,5 milímetros. Añadir una décima parte del volumen de ADN de tres acetatos molar de sodio en agua al tubo y mezclarlo bien usando un vórtice. Luego, agregue 2,5 veces el volumen de etanol al 100 por ciento al tubo y mezcle bien usando un vórtice durante al menos 30 segundos.Coloque el tubo sobre hielo o a menos 20 grados Centígrados durante 30 minutos. Luego, centrifuga el tubo a 18,300 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante del tubo sin alterar el pellet.Añadir tres veces el volumen de etanol al 70 por ciento al tubo y mezclarlo brevemente usando un vórtice. Centrifugar el tubo a 18, 300 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez más, retire cuidadosamente el sobrenadante del tubo sin alterar el pellet.Deje el tubo abierto y deje que el pellet se seque al aire durante 15 minutos. Almacene el ADN precipitado a menos 20 grados centígrados hasta que sea necesario para la transfección. Para transfecctar RBCs, prepare el búfer de citomix 1X, así como la RPMI incompleta y completa como se describe en el protocolo de texto.El filtro esteriliza el búfer con un filtro de 0,22 micras. Añadir 380 microlitros de la citomix 1X al ADN y vórtice para disolver. Deje que el ADN se disuelva en la citomix 1X durante 10 minutos, vórtice cada tres minutos durante 10 segundos.En un tubo cónico estéril de 15 mililitros, combine 300 microlitros de glóbulos rojos humanos aislados en la RPMI incompleta con cuatro mililitros de 1X citomix. Centrifugar los RBC a 870 veces G durante tres minutos. A continuación, retire el sobrenadante del pellet RBC.Vuelva a suspender el pellet RBC con la mezcla DNA-cytomix y transfiéralo a una cubeta de electroporación de 0,2 centímetros. Porte los RBC utilizando las condiciones enumeradas en el protocolo de texto. Después de la electroporación, transfiera el contenido de la cubeta a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI completa.Centrifugar el tubo a 870 veces G durante tres minutos a 20 grados centígrados. Entonces, decantar al sobrenadante. Ahora, vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de RPMI completo y transfiera a un pozo en una placa de cultivo de tejido de seis pozos.Añadir 400 microlitros de un alto cultivo esquizonte a los glóbulos rojos transferidos. Al día siguiente, lave el cultivo con cuatro mililitros de RPMI completa.Centrifugar la cultura a 870 veces G durante tres minutos. Aspirar al sobrenadante. Re-suspenda el cultivo en cuatro mililitros de RPMI completa.48 horas más tarde, lavar el cultivo con cuatro mililitros de RPMI completa. A continuación, vuelva a suspender el cultivo en RPMI completa que contiene un DSM1 micromolar para seleccionar para el plásmido Cas9. Después de este punto, sustituya el medio de cultivo por RPMI completa fresca más un DSM1 micromolar cada 48 horas.Continúe lavando los cultivos cada día con RPMI completa hasta que los parásitos ya no sean visibles por un frotis de sangre. Para hacer un frotis de sangre, pipetee 150 microlitros de cultivo en un tubo centrífugo de 0,6 mililitros. Después de peletizar las células por centrifugación a 1.700 veces G durante 30 segundos, aspirar del sobrenadante.Utilice una pipeta para transferir las células peletadas a un portaobjetos de vidrio. Usando una segunda diapositiva de vidrio sostenida en un ángulo de 45 grados con respecto a la primera diapositiva, frote la gota de sangre. Manche la diapositiva utilizando un kit de tinción disponible comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante.Vea los parásitos utilizando 100 veces el objetivo de inmersión en aceite. A partir de cinco días después de la transfección, retire dos mililitros de la cultura con RBC re-suspendido en el medio de cultivo. Agregue dos mililitros de medio fresco y sangre al dos por ciento de hematocrito.Agregue sangre fresca de esta manera una vez a la semana hasta que reaparezca el parásito, según lo determinado por un frotis de sangre delgada. Realizar diluciones en serie del cultivo de parásitos para lograr una concentración final de 0,5 parásitos por cada 200 microlitros. Añadir 200 microlitros del cultivo diluido a los pozos de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos.Mantenga la placa de clonación hasta que los parásitos sean detectables en los pozos. Cada 48 horas, sustituya el medio de la placa de 96 pozos por un medio fresco. Una vez a la semana, a partir de cinco días después de comenzar la placa de clonación, retire 100 microlitros de cada pozo y agregue de nuevo 100 microlitros de medio fresco más sangre.Para identificar los pozos que contengan parásitos, coloque la placa de 96 pozos en un ángulo de 45 grados durante aproximadamente 20 minutos, permitiendo que la sangre se asiente en un ángulo dentro de la placa. A continuación, coloque la placa de 96 pozos en una caja de luz. Observe que los pozos que contienen parásitos contienen medios de color amarillo, en comparación con los medios rosados de los pozos libres de parásitos, debido a la acidificación del medio por los parásitos.Usando una pipeta serológica, mueva el contenido de los pozos que contienen parásitos a una placa de cultivo de tejido de 24 pozos para permitir la expansión de la parasitemia. Usando el análisis de PCR, compruebe estas líneas de parásitos clonales para la integración correcta. Los resultados de un ensayo de inmunofluorescencia se muestran aquí, demostrando el etiquetado HA con éxito de PfH-sp70x.Los parásitos pfH-sp70x glmS fueron fijos y manchados con DAPI como marcador del núcleo, así como anticuerpos contra la HA. Proteína rica en histidina asociada a la membrana, un marcador de exportación de proteínas al huésped RBC. Aquí se muestra un análisis de Western Blot del nivel de proteína PfH-sp70x después del tratamiento con glucosamina. Como era de esperar, el nivel de proteína disminuye durante la duración del tratamiento.Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la parasitología investiguen cuestiones fundamentales en la biología del parásito de la malaria. Es importante recordar que P.Falciparum es un patógeno transmitido por la sangre y se debe usar un equipo de protección personal adecuado durante la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Investigación

Genética

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Edición del genoma mediado por CRISPR-Cas9 en el Ascomicete Filamentoso Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...