Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Vi tackar Muthugapatti Kandasamy vid University of Georgia (UGA) biomedicinska mikroskopi kärnan för tekniskt bistånd och Jose-Juan Lopez-Rubio för att dela de pUF1-Cas9 och pL6 plasmidsna. Detta arbete stöds av bågar Foundation utmärkelser till D.W.C. och H.M.K., UGA start medel till V.M., bidrag från mars av Dimes Foundation (basilika O'Connor Starter Scholar Research Award) till V.M. och oss National Institutes of Health beviljar (R00AI099156 och R01AI130139) till V.M. och (T32AI060546) till H.M.K.

Kontinuerlig kultur av P. falciparum kräver användning av mänskliga röda blodkroppar, och vi utnyttjas kommersiellt tillgängliga enheter blod som berövats alla identifierare och anonymiseras. Den institutionella Review Board och Office för biosäkerhet på University of Georgia granskas våra protokoll och godkänns alla protokoll som används i vårt labb.
1. att välja en gärna sekvens
<ol><li>Gå till CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) och välj ' Fasta mål '</em...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

Genomförandet av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både ökad effektivitet och minskade mängden tid som behövs för att ändra parasitens arvsmassa, jämfört med tidigare metoder för genetisk manipulation. Denna omfattande protokoll beskriver stegen som krävs för att generera villkorlig mutanter med CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Medan metoden här är inriktade specifikt för generering av HA -glmS mutanter, kan denna strategi anpassas för en mängd behov, inklusive märkning av gener, ge...

Malaria är en förödande sjukdom orsakad av urdjursparasiter av släktet Plasmodium. P. falciparum, de flesta dödliga mänskliga malariaparasiten, orsakar cirka 445,000 dödsfall per år, mestadels i barn under fem1år. Plasmodium parasiter har en intrikat livscykel som innefattar en mygga vektor och en vertebrate värd. Människor smittas först när en infekterad mygga tar en blodmjöl. Parasiten invaderar sedan levern där den växer, utvecklas och delar för cirka en vecka. Efter denna process släpps parasiterna ut i blodomloppet, där de genomgår asexuell replikering i röda blodkroppar (RBC). Tillväxt av parasiter inom de röda blodkropparna är direkt ansvariga för kliniska symptom i samband med malaria2.
Tills nyligen var produktionen av transgena P. falciparum en mödosam process, som involverar flera omgångar av drogen urval som tog många månader och hade en hög felfrekvens. Detta tidsödande förfarande relieson bryter generering av slumpmässiga DNA i regionen av intresse och parasiten endogena förmåga att laga sin arvsmassa men homologa reparation3,4,5,6 . Nyligen, klustrade regelbundet mellanliggande Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) gen editering har framgångsrikt använts i P. falciparum7,8. Införandet av denna nya teknik i malaria forskning har varit avgörande för avancerad förståelse av biologi av dessa dödliga parasiter Plasmodium . CRISPR/Cas9 möjliggör specifik inriktning av gener genom guide RNAs (gRNAs) som är homolog till genen av intresse. Den gärna/Cas9 komplexa erkänner genen genom gärna och Cas9 sedan introducerar en dubbel-strand paus, tvingar inledandet av reparationsmekanismer i organismen9,10. Eftersom P. falciparum saknar maskinen för att reparera DNA pauser genom icke-homolog slutet att gå, det använder homolog rekombination mekanismer och integrerar transfekterade homologa DNA-mallar för att reparera det Cas9/gärna-inducerat dubbel-strand break11,12.
Här presenterar vi ett protokoll för generering av villkorlig knockdown mutanter i P. falciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering. Protokollet visar användningen av de glmS ribozym till villkorligt knockdown proteinnivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), ett förkläde exporteras av P. falciparum till värd röda blodkropparna13,14. Den glmS ribozym aktiveras genom behandling med glukosamin (som omvandlas till glukosamin-6-fosfat i celler) för att klyva dess associerade mRNA, leder till en minskning av protein14. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att utnyttja andra villkorsstyrda knockdown verktyg, såsom destabilisering domäner eller RNA aptamers4,5,15. Vår protokolldetaljer generering av en reparation plasmid bestående av en hemagglutinin (HA) tag och glmS ribozym kodande sekvens flankerad av sekvenser som är homolog till PfHsp70x öppen läsning ramen (ORF) och 3'-UTR. Vi beskriver också generationen av en andra plasmid att driva uttryck för gärna. Dessa två plasmider, tillsammans med en tredje som driver uttryck för Cas9, är transfekterade i röda blodkroppar och används för att ändra genomet hos P. falciparum parasiter. Slutligen beskriver vi ett polymeras-kedjereaktion (PCR)-baserad teknik för att kontrollera integrationen av den taggen och glmS Ribozym. Detta protokoll är mycket anpassningsbar till ändring eller komplett knockout av någon P. falciparum gener, förbättra vår förmåga att generera nya insikter i biologin av malariaparasiten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

Malaria är en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Denna sjukdom, som främst drabbar dem som lever i tropiska och subtropiska regioner, orsakas av infektion med Plasmodium parasiter. Utvecklingen av mer effektiva läkemedel för att bekämpa malaria kan påskyndas genom att förbättra vår förståelse av biologi av denna komplexa parasit. Genmanipulation av dessa parasiter är nyckeln till att förstå deras biologi; men har historiskt genomet hos P. falciparum varit svårt att manipulera. CRISPR/Cas9 gen editering har nyligen använts i malaria parasiterna, vilket möjliggör enklare protein taggning, generation av villkorlig protein knockdowns och radering av gener. CRISPR/Cas9 gen editering har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att främja malaria forskning. Här, vi beskriver en CRISPR/Cas9 metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i P. falciparum. Denna metod är mycket anpassningsbar till andra typer av genetiska manipulationer, inklusive protein taggning och gen knockouts.

En schematisk av plasmidsna används denna metod som ett exempel på en sköld mutation visas i figur 1. Som ett exempel på hur man identifierar mutant parasiter efter transfection, redovisas resultaten från primärvården för att kontrollera integrationen av den HA -glmS konstruktionen i figur 2. En representativ bild av en kloning plattan visas i figur 3 att Visa färgaändringen av med...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Vi beskriver en metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i Plasmodiumfalciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i biologin hos den mänskliga malariaparasiten, P.Falciparum, genom att hjälpa till att avslöja proteinfunktion genom villkorlig knockdown. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör relativt lätt generering av villkorliga mutanter jämfört med tidigare metoder. Till att börja med går du till Chop Chop och väljer Fasta Target'Under Target, klistra in 200 baspar från de tre främsta slutet av den öppna avläsningsramen för en gen och 200 baspar från början av genens tre främsta UTR.Under In'select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next klickar du på Sök målplatser'Välj en gRNA-sekvens bland de presenterade alternativen, vilket ger företräde åt det mest effektiva gRNA som är närmast platsen för ändring och som har minst antal platser utanför målet. Köp gRNA-sekvensen och dess omvända komplement som polyakrylamidgelelektrofores renad oligos. Den gRNA-sekvens som används för att rikta pfh-sp70x finns i textprotokollet.Tillsätt 40 mikrogram vardera av pMK-U6, pUF1-Cas9, och pHA-glmS DNA i ett sterilt 1,5 millimeters centrifugrör. Tillsätt en tiondel av volymen av DNA av tre molar natriumacetat i vatten till röret och blanda det väl med hjälp av en virvel. Tillsätt sedan 2,5 gånger volymen av 100 procent etanol till röret och blanda det väl med hjälp av en virvel i minst 30 sekunder.Placera röret på is eller vid minus 20 grader Celsius i 30 minuter. Sedan centrifug röret vid 18, 300 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugeringen avlägsnas supernatanten försiktigt från röret utan att pelleten störs.Tillsätt tre gånger volymen av 70 procent etanol till röret och blanda den kort med hjälp av en virvel. Centrifugera röret vid 18, 300 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Återigen, ta försiktigt bort supernatanten från röret utan att störa pelleten.Låt röret vara öppet och låt pelleten lufttorka i 15 minuter. Förvara det utfällda DNA:t vid minus 20 grader Celsius tills det behövs för transfection. Till transfect RBCs, förbereda 1X cytomix buffert samt ofullständiga och kompletta RPMI som beskrivs i textprotokollet.Filtrera sterilisera bufferten med hjälp av ett 0,22 mikronfilter. Tillsätt 380 mikroliter av 1X cytomix till DNA och virvel för att lösa upp. Låt DNA:t lösas upp i 1X cytomixen i 10 minuter, virvelning var tredje minut i 10 sekunder.I en steril, 15 milliliter koniska rör, kombinera 300 mikroliter av isolerade mänskliga RBCs i den ofullständiga RPMI med fyra milliliter av 1X cytomix. Centrifugera RBC:erna vid 870 gånger G i tre minuter. Ta sedan bort supernatanten från RBC-pelleten.Åter upphäva RBC pelleten med DNA-cytomix blandningen och överföra den till en 0,2 centimeter elektroporation cuvette. Porera RBC:erna med hjälp av de villkor som anges i textprotokollet. Efter elektroporation, överför innehållet från cuvette till ett 15 milliliter koniskt rör som innehåller fem milliliter av komplett RPMI.Centrifugera röret vid 870 gånger G i tre minuter vid 20 grader Celsius. Sedan, dekantera supernatanten. Nu, åter upphäva pelleten i fyra milliliter av komplett RPMI och överföra till en brunn i en sex-väl vävnad kultur tallrik.Lägg till 400 mikroliter av en hög schizontkultur till de överförda RBC:erna. Underhåll alla kulturer vid 37 grader Celsius under tre procent syre, tre procent CO2 och 94 procent kväve. Nästa dag, tvätta kulturen med fyra milliliter av komplett RPMI.Centrifugera kulturen på 870 gånger G i tre minuter. Aspirera supernatanten. Åter avbryta kulturen i fyra milliliter av komplett RPMI.48 timmar senare, tvätta kulturen med fyra milliliter av komplett RPMI. Sedan åter upphäva kulturen i komplett RPMI som innehåller en mikromolar DSM1 att välja för Cas9 plasmid. Efter denna punkt, ersätta odlingsmediet med färska kompletta RPMI plus en mikromolar DSM1 varje 48 timmar.Fortsätt tvätta kulturerna varje dag med komplett RPMI tills parasiter inte längre är synliga av blodsutstryk. För att göra ett blodutstryk, pipettera 150 mikroliter av kultur i en 0,6 milliliter centrifugrör. Efter pelletering av cellerna genom centrifugeringen vid 1, 700 gånger G i 30 sekunder, aspirera bort supernatanten.Använd en pipett för att överföra de pelleterade cellerna till en glasrutschkana. Med hjälp av en andra glasrutschbana som hålls i 45 graders vinkel mot den första bilden, smeta bloddropparet. Fläcka in rutschkanan med hjälp av en färgningssats i kommersiellt sett enligt tillverkarens protokoll.Visa parasiterna med hjälp av 100 gånger olje-nedsänkning mål. Början fem dagar post-transfection, ta bort två milliliter av kulturen med RBCs åter uppskjutna i odlingsmediet. Lägg tillbaka två milliliter färskt medium och blod på två procent hematokrit.Tillsätt färskt blod på detta sätt en gång i veckan tills parasiten återkommer, som bestäms av tunt blod utstryk. Utför serieutspädningar av parasitkulturen för att uppnå en slutlig koncentration av 0,5 parasiter per 200 mikroliter. Tillsätt 200 mikroliter av den utspädda kulturen till brunnarna i en 96-väl vävnadskulturplatta.Underhåll kloningsplattan tills parasiter är detekterbara i brunnarna. Var 48:e timme, byt ut mediet i 96-brunnsplattan med färskt medium. En gång i veckan, med början fem dagar efter början kloningsplattan, ta bort 100 mikroliter från varje brunn och lägga tillbaka 100 mikroliter av färskt medium plus blod.För att identifiera eventuella brunnar som innehåller parasiter, placera 96-brunnsplattan i 45 graders vinkel i cirka 20 minuter, vilket gör att blodet kan bosätta sig i en vinkel inom plattan. Placera sedan 96-brunnsplattan på en ljuslåda. Lägg märke till att brunnarna som innehåller parasiter innehåller media som är gult i färg, jämfört med de rosa medierna av parasitfria brunnar, på grund av försurning av mediet av parasiterna.Med hjälp av en serologisk pipett, flytta innehållet i de parasithaltiga brunnarna till en 24-väl-vävnadskulturplatta för att möjliggöra expansion av parasitmien. Med hjälp av PCR-analys, kontrollera dessa klonala parasit linjer för korrekt integration. Resultaten av en immunofluorescens analys visas här, visar framgångsrikt HA märkning av PfH-sp70x.PfH-sp70x glmS parasiter var fasta och färgas med DAPI som en kärna markör, liksom antikroppar mot HA. Membran-associerade histidin rika protein en, en markör för protein export till värden RBC. En Western Blot-analys av PfH-sp70x proteinnivå efter behandling med glukosamin visas här. Som förväntat minskar proteinnivån under behandlingstiden.Denna teknik banar väg för forskare inom området parasitologi för att undersöka grundläggande frågor i malariaparasitens biologi. Det är viktigt att komma ihåg att P.Falciparum är en blodburen patogen och lämplig personlig skyddsutrustning bör bäras när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartläggning och CRISPR / Cas9 redigering för att identifiera en läkemedelsresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-medierad exakt gen redigering av Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definierade genomiska modifikationer med CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Medierad genomredigering i den fintrådiga Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...