Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Biz Muthugapatti Kandasamy Georgia Üniversitesi (UGA) Biyomedikal mikroskobu temel teknik yardım için ve Juan Jose Lopez-Rubio pUF1-Cas9 ve pL6 plazmidleri paylaştığınız için teşekkür ederiz. Bu eser UGA başlangıç fon için VM, m. ve bize Ulusal Sağlık Enstitüleri Mart Dimes Vakfı (fesleğen O'Connor Starter bilim adamı Araştırma Ödülü) hibe verir kemerler Vakfı Ödülü D.W.C. ve H.M.K., tarafından desteklenmiştir (R00AI099156 ve R01AI130139) VM için ve (T32AI060546) H.M.K. için

P. falciparum sürekli kültür insan RBCs kullanımı gerektirir ve biz ticari satın alınan ünite kan tüm tanımlayıcıları çıkardı ve anonimleştirilir faydalanır. Kurumsal değerlendirme Komitesi ve biyogüvenlik Office Georgia Üniversitesi, bizim protokolleri gözden geçirilmiş ve onaylanmış bizim laboratuarda kullanılan tüm iletişim kuralları.
1. bir gRNA sıra seçimi
<ol><li>CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) gidin ve ' Fasta hedef 'seçin. <em...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

CRISPR/Cas9 P. falciparum olarak uygulanması hem verimliliği artan ve asıl olayın asalağın genom, genetik manipülasyon önceki yöntemlerine göre değiştirmek için gereken süreyi azalmıştır. Bu kapsamlı protokol koşullu mutantlar CRISPR/Cas9 P. falciparumkullanarak oluşturmak için gereken adımları açıklar. Yöntemi özellikle HA -glmS mutantlar üretimi için tasarlanmış olsa da, bu strateji ihtiyaçları, genler, gen renkleri çakıştırmama ve giriş noktası mutasyon...

Sıtma Plasmodiumcinsi protozoon parazitler tarafından neden yıkıcı bir hastalıktır. P. falciparum, en ölümcül insan sıtma parazit, her yıl, yaklaşık 445.000 ölümler çoğunlukla beş1yaşın altındaki çocuklarda neden olur. Plasmodium parazitleri bir sivrisinek vektör ve omurgalı bir ana bilgisayar içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. Ne zaman virüslü bir sivrisinek bir kan yemek alır insanlar ilk bulaşabilir. O zaman, parazit nerede büyür, gelişir ve yaklaşık bir hafta için böler karaciğer işgal etti. Bu işlem sonra parazitleri kan dolaşımına nerede kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) eşeysiz çoğaltma geçmesi, serbest bırakılır. Büyüme parazit RBCs içinde sıtma2ile ilişkili klinik belirtiler doğrudan sorumlu.
Yakın zamana kadar transgenik P. falciparum üretim zahmetli bir süreç, birkaç tur birçok ay sürdü ve yüksek başarısızlık oranı olan ilaç seçimi içeren oldu. Bu zaman alan yordamı relieson rasgele DNA nesil bölgenin ilgi ve parazit endojen yeteneğine rağmen genomunu onarmaya tatili homolog onarım3,4,5,6 . Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli olarak Interspaced palindromik tekrar/Cas9 (CRISPR/Cas9) genom düzenleme başarıyla P. falciparum7,8' kullanılmıştır. Bu yeni teknoloji sıtma araştırma giriş yapılmış bu ölümcül Plasmodium parazitler biyoloji anlayış ilerleyen için kritik. CRISPR/Cas9 Kılavuzu RNA'ların (gRNAs) faiz gen için homolog genlerin özel hedefleme için sağlar. GRNA/Cas9 karmaşık gen gRNA yoluyla tanır ve Cas9 sonra tamir mekanizmaları organizma9,10inisiyasyon zorlama iki iplikçikli mola tanıtır. P. falciparum homolog olmayan son katılma yoluyla DNA sonları onarmak için makine eksik olduğundan, Homolog rekombinasyon mekanizmaları kullanır ve Cas9/gRNA-indüklenen onarmak için transfected homolog DNA şablonları entegre iki iplikçikli ara11,12.
Burada, bir protokol P. falciparum koşullu devirme mutantların üretimi için CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak mevcut. Protokol glmS ribozyme PfHsp70x koşullu olarak devirme protein düzeyleri için kullanımı gösterilmiştir (PF3D7_0831700), bir koruyucuya ihraç P. falciparum tarafından ev sahibi RBCs13,14. GlmS ribozyme (ki glucosamine-6-fosfat hücrelerdeki dönüştürülür) glucosamine ile tedavi tarafından protein14bir azalma önde gelen onun ilişkili mRNA ayırmak için etkinleştirilir. Bu iletişim kuralı kolayca istikrarsızlık etki alanları veya RNA aptamers4,5,15gibi diğer koşullu devirme araçlarını kullanmak için adapte edilebilir. Bizim iletişim kuralı dizileri tarafından çevrili sıra kodlama hemagglutinin (HA) etiketi ve glmS ribozyme oluşan bir onarım plazmid nesil bu PfHsp70x açık okuma çerçevesi (ORF) ve 3' UTR homolog ayrıntılardır. Ayrıca gRNA sürücü ifade için ikinci bir plazmid nesil açıklar. Bir ifade Cas9, sürücüler üçüncü ile birlikte bu iki plazmit RBCs transfected ve P. falciparum parazitler genom değiştirmek için kullanılır. Son olarak, biz bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarif-entegrasyon-in etiket ve glmS ribozyme doğrulamak için teknik dayalı. Bu son derece uyarlanabilir ve/veya sıtma parazit biyoloji yeni görüşler üretmek için bizim yetenek geliştirme herhangi bir P. falciparum genlerin tam nakavt için iletişim kuralıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

Sıtma morbidite ve mortalite dünya çapında önemli bir nedenidir. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgelerde yaşayanlar etkiler, bu hastalığı enfeksiyon için Plasmodium parazit neden olur. Daha etkili mücadele sıtma ilaçlara gelişimi bu karmaşık parazit biyoloji anlayışımız geliştirerek hızlandırılabilir. Bu parazitler genetik manipülasyon biyolojilerinin anlama anahtarıdır; Ancak, tarihsel olarak P. falciparum genom işlemek zor olmuştur. Son zamanlarda, sıtma parazit, etiketleme, koşullu protein nakavtlar nesil ve silme genlerin daha kolay protein için izin içinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 genom düzenleme alanı sıtma araştırmanın ilerleyen için güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Burada, glmSüretmek için CRISPR/Cas9 yöntemi açıklamak- P. falciparumkoşullu devirme mutantlar dayalı. Bu yöntem son derece gen basılmasını ve genetik manipülasyon, protein etiketleme de dahil olmak üzere, diğer türleri için uyarlanabilir.

Kullanılan bu yöntem yanı sıra bir kalkan mutasyon örneği plazmid şematik resim 1' de gösterilmiştir. Transfection sonra mutant parazitler nasıl bir örnek olarak, HA -glmS yapı entegrasyonu denetimi PCR sonuçlarını Şekil 2' de gösterilir. Klonlama bir tabak temsilcisi bir görüntüsünü parazitler huzurunda orta renk değişimi göstermek için Şekil 3 ' te gösterilmişt...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Bu yöntem, insan sıtma paraziti, P.Falciparum biyolojisinde anahtar sorulara cevap yardımcı olarak, koşullu nakavt yoluyla protein fonksiyonu ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, önceki yöntemlere göre koşullu mutantların nispeten kolay nesil sağlar olmasıdır. Başlamak için Chop Chop'a gidin ve Fasta Target'Under Target'ı seçin, bir genin açık okuma çerçevesinin üç ana ucundan 200 baz çiftini ve genin üç ana UTR'sinin başlangıcından itibaren 200 baz çiftini yapıştırın.In'select P.Falciparum'un altında ve CRISPR/Cas9'under'ı seçin'Next' seçeneğini tıklatın, sunulan seçeneklerden Hedef Siteleri Bul'Select'in bir gRNA dizisini seçin, modifikasyon sitesine en yakın ve hedef dışı en az siteye sahip olan en verimli gRNA'yı tercih edin. Satın gRNA dizisi ve poliakrilamid jel elektroforez saf oligos olarak ters kompleman. PfH-sp70x'i hedeflemek için kullanılan gRNA dizisi metin protokolünde bulunabilir.Steril 1,5 milimetrelik bir santimetrelik santimetrelik tüpe pMK-U6, pUF1-Cas9 ve pHA-glmS DNA'sının her birini 40 mikrogram ekleyin. Suya üç azı lı sodyum asetat DNA hacminin onda birini tüpüne ekleyin ve bir girdap kullanarak iyice karıştırın. Daha sonra, tüpe yüzde 100 etanol hacmi 2,5 kat ekleyin ve en az 30 saniye boyunca bir girdap kullanarak iyice karıştırın.Tüpü buza veya eksi 20 derecede 30 dakika yerleştirin. Sonra, tüpü 18, 300 kez G'de 30 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Santrifüjden sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı tüpten dikkatlice çıkarın.Tüpe yüzde 70 etanol hacminin üç katını ekleyin ve bir girdap kullanarak kısa bir süre karıştırın. Tüpü 18, 300 kez G'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüj edin. Yine, dikkatle pelet rahatsız etmeden tüpten supernatant çıkarın.Tüpü açık bırakın ve peletin 15 dakika kurumasını bekleyin. Çökelmiş DNA'yı transfeksiyon için gerekli olana kadar eksi 20 derecede saklayın. Transfect RBC'ler için, metin protokolünde açıklandığı gibi 1X sitomix arabelleği ve eksik ve eksiksiz RPMI hazırlayın.Filtre 0,22 mikron filtre kullanarak arabellek sterilize. Çözünmek için DNA ve girdap için 1X sitomix 380 mikrolitre ekleyin. DNA'nın 1X sitomikte 10 dakika boyunca erimesine izin verin, her üç dakikada bir 10 saniye girdap.Steril bir, 15 mililitre konik tüp, 1X sitomix dört mililitre ile tamamlanmamış RPMI izole insan RbCs 300 mikrolitre birleştirir. RBC'leri 870 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Sonra RBC pelet supernatant çıkarın.DNA-sitomik karışımı ile RBC pelet yeniden askıya ve 0.2 santimetre elektroporasyon cuvette aktarın. Metin protokolünde listelenen koşulları kullanarak RBC'leri porate. Elektroporasyondan sonra, içindekileri cuvette'den beş mililitre tam RPMI içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Tüpü 870 kez G'de 20 santigrat derecede üç dakika santrifüj edin. Sonra, supernatant decant. Şimdi, peleti dört mililitre lik tam RPMI'de yeniden askıya alıp altı kuyulu doku kültürü plakasında ki bir kuyuya aktarın.Aktarılan RBC'lere 400 mikrolitre yüksek schizont kültürü ekleyin. Ertesi gün, tam RPMI dört mililitre ile kültür yıkayın.Kültürü 870 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire. Dört mililitre tam RPMI kültürü yeniden askıya alın.48 saat sonra, tam RPMI dört mililitre ile kültür yıkayın. Daha sonra, Cas9 plazmid için seçmek için bir mikromolar DSM1 içeren tam RPMI kültürü yeniden askıya. Bu noktadan sonra, taze tam RPMI artı bir mikromolar DSM1 her 48 saatte bir kültür ortamı değiştirin.Parazitler artık kan yayma ile görünür kadar tam RPMI ile her gün kültürleri yıkamaya devam edin. Bir kan bulaşması yapmak için, pipet kültür 150 mikrolitre bir 0.6 mililitre santrifüj tüp içine. Hücreleri santrifüj ile 30 saniye boyunca 1, 700 kez G'de peletledıktan sonra, süpernatanttan aspirasyon.Peletli hücreleri cam bir slayta aktarmak için bir pipet kullanın. İlk slayt için 45 derecelik açıyla düzenlenen ikinci bir cam slayt kullanarak, kan damlacık smear. Üreticinin protokolüne göre ticari olarak kullanılabilen bir boyama kiti kullanarak slaydı lekeleyin.Parazitleri 100 kez yağ daldırma amacı kullanarak görüntüleyin. Transfeksiyon sonrası beş gün başlayarak, kültür ortamında yeniden askıya alınan KÇ'ler ile kültürün iki mililitresini çıkarın. %2 hematokrit taze orta ve kan iki mililitre geri ekleyin.Parazit yeniden ortaya çıkana kadar haftada bir kez bu şekilde taze kan ekleyin, ince kan yayma tarafından belirlenen. 200 mikrolitre başına 0,5 parazit son konsantrasyonu elde etmek için parazit kültürünün seri seyreltme gerçekleştirin. 96 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularına seyreltilmiş kültürün 200 mikrolitresini ekleyin.Parazitler kuyularda tespit edilene kadar klonlama plakasını koruyun. Her 48 saatte bir, 96 kuyulu tabaktaki ortayı taze orta ile değiştirin. Haftada bir kez, klonlama plakası başladıktan beş gün sonra, her kuyudan 100 mikrolitre çıkarın ve taze orta artı kan 100 mikrolitre geri ekleyin.Parazit içeren kuyuları belirlemek için, 96 kuyulu plakayı yaklaşık 20 dakika boyunca 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve kanın plaka içinde bir açıyla yerleşmesini bekleyin. Daha sonra, 96-kuyu plakasını bir ışık kutusuna yerleştirin. Parazit içeren kuyuların, parazitsiz kuyuların pembe ortamına kıyasla, parazitsiz kuyuların pembe ortamına göre sarı renkli ortam içerdiğine dikkat edin.Serolojik pipet kullanarak, parazit içeren kuyuların içeriğini parazitin genişlemesine izin vermek için 24 kuyulu doku kültürü plakasına taşıyın. PCR çözümlemesi kullanarak, doğru tümleştirme için bu klonal parazit hatlarını kontrol edin. Bir immünüffloresans tahsin sonuçları burada gösterilmiştir, PfH-sp70x başarılı HA etiketleme gösteren.PfH-sp70x glmS parazitleri bir çekirdek belirteci olarak DAPI ile ve HA antikorları ile sabit ve lekeli idi. Membran ilişkili histidin zengin protein bir, konak RBC protein ihracatı bir belirteç. Burada glukozamin ile tedavi sonrası PfH-sp70x protein düzeyinin Western Blot analizi gösterilmiştir. Beklendiği gibi, tedavi süresince protein düzeyi azalır.Bu teknik, parazitoloji alanında araştırmacıların sıtma parazitinin biyolojisindeki temel soruları araştırmalarının önünü açsA. P.Falciparum'un kan yoluyla bulaşan bir patojen olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanın takılması gerektiğini unutmamak gerekir.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...