Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

أجريت تجارب حيود الأشعة السينية المبينة في هذه الورقة باستخدام بيملينيس 08-معرف و 08-BM في "مصدر الضوء الكندية"، التي تدعمها "مؤسسة كندا" للابتكار والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا، جامعة ساسكاتشوان، حكومة ساسكاتشوان، كندا التنويع الاقتصادي الغربي، كندا المجلس القومي للبحوث، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. نود أن نعترف الهيكلية والفيزيائية الأساسية مرفق، في مستشفى "الأطفال المرضى"، للوصول إلى أدوات مركز التجارة الدولية و BLI. وأيد J.E.O. قبل بانتنغ بعد الدكتوراه زمالة BPF-144483 من "المعاهد الكندية للبحوث الصحية". ت. س. هو أحد المستلمين من كندا خريج منحة الماجستير جائزة ومنحة Vanier خريج كندا من "المعاهد الكندية للبحوث الصحية". وأيد هذا العمل يعمل بمنحه PJT-148811 (ج. ب. ج.) من "المعاهد الكندية للبحوث الصحية". وأجرى هذا البحث، في جزء منه، بفضل التمويل المقدم من برنامج "كراسي البحث كندا" (ج. ب. ج.).

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

ترتكز على غشاء glycoproteins هي حاسمة بالنسبة لوظيفة الخلية والأهداف العلاجية جذابة. وهنا نقدم بروتوكولا لتوصيف الهيكلية والفيزيائية الحيوية لتنمية الطفولة المبكرة لغشاء جليكوبروتينس، سواء وحدها أو في المجمع مع يغاندس جزيء صغير والقوات المسلحة البوروندية وشظايا. لقد استخدمت بنجاح هذا البروتوكول لتحديد بنية بلورية الثلاثة مجالات Ig N-الطرفية-معظم الجزء الخاص بالخلية البشرية CD2228، مستقبل المشارك حرجة في الخلايا ب المشاركة في الحفاظ على حصانة humoral الاختيار79. ونحن أيضا يتسم موقع CD22 ملزمة مع سياليلاكتوسي α2-6 يجند الطبيعية لها، وتعريف طريقة الاعتراف بجسم العلاجية نحو CD22 البشرية. هذه النتائج ثاقبة علاقة بنية دالة عضو رئيسي في الأسرة سيجليكس التي تم تقييد التعبير على خلايا ب وجزيئية خارطة طريق نحو التنمية الجديدة CD22 جزيء الصغيرة المستهدفة والقائمة على جسم المداواة. بينما تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لمستقبلات خلية بالمحتويه على المفتش العام، فإننا نقترح أن يمكن تطبيق النهج الذي نتبعه لتوصيف أي بروتين سكري الغشاء مع منظمة متميزة في مجال الهيكلي والفيزيائية الحيوية. في مثل هذه الحالات، بناء التصميم واندماجي جليكان ن مرتبطة يمكن تقييمها الطفرات (أما جلن أو علاء) لإيجاد بنية مناسبة لنمو البلورات والحيود عالية الدقة.
الحصول على عينة متجانسة والصرفة بروتين سكري ذا أهمية حاسمة لنمو البلورات وحيود الأشعة السينية، وكذلك لتحديد الخصائص الفيزيائية المتلقين للمعلومات. جليكانس ن المرتبطة موجودة على جليكوبروتينس هي أصلاً غير متجانسة، ويمكن أن يسبب عدم تجانس كونفورماشونال والكيميائية داخل بروتين سكري يمكن أن تردع تشكيل الكريستال. لتقليل هذا الصغير-عدم التجانس، استراتيجيات لإدخال طفرات نقطة لإزالة بقايا Asn توقع إلى ميناء جليكانس المرتبطة بنون، أو باستخدام خطوط خلايا متحولة (مثل HEK293S) متبوعاً بالعلاج مع اندوجليكوسيداسيس (مثل اندة) يمكن إلى حد كبير تحسين تبلور نجاح15،،من2122. في هذا البروتوكول، ونحن نناقش تنقية glycoproteins القابلة للذوبان والشؤون التي هي يفرز داخل الخلية طافية. ويوفر إفراز بروتين سكري طريقا بسيطة نسبيا نحو النقاء، دون الحاجة إلى تحلل الخلية أو إضافة مواد كيميائية قاسية أو المنظفات. ثم تشغيل الخلية طافية، تحصل التالية الخلية حصاد مباشرة على عمود يحتوي على القرابة للبروتين للفائدة (مثلاً، ني-جاتا glycoproteins صاحب معلم، أو تقارب LC للقوات المسلحة البوروندية الشظايا). ومع ذلك، اعتماداً على العمود للاستخدام وظروف الخلية طافية (مثل درجة الحموضة)، يمكن أن تتأثر القدرة الملزمة من بروتين الفائدة للعمود. إذا كان هذا هو الحال، فإنه قد يكون من الضروري التركيز والمخزن المؤقت تبادل الخلية طافية لتحسين الربط للعمود. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن اتباع خطوات مراقبة الجودة أثناء تنقية للمساعدة في تقييم نقاوة البروتين. تشغيل الغربية وصمة عار لجميع العينات (قبل وأثناء وبعد خطوات تنقية) أو هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يمكن أن تسفر عن رؤى في ما إذا كان نظام تنقية المقترح مناسبة لبروتين الفائدة. إذا كانت العصابات تلويث مرئية على صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، أو إذا كان يتم الحصول على العديد من الأنواع من خلال تنقية (مثلاً، عدة قمم في حجم الاستبعاد)، خطوات تنقية إضافية ينبغي النظر، مثلاً، التبادل الأيوني اللوني، للحصول على في نقاء وزيادة فرص تبلور المصب80.
لبلورة الجزيئات، المهم غالباً للحصول على غلة عالية من بروتين الفائدة للسماح لفحص عدد كبير من الشروط بلورة المحتملة بتركيزات عالية من البروتين لإيجاد يضرب الكريستال مناسبة. عموما، HEK293 خلية خطوط مناقشتها هنا (HEK293F و HEK293S) نظم التعبير قوية، ويمكن الارتقاء بسهولة لإنتاج أكثر من نموذج حسب الضرورة. ومع ذلك، من الممكن أن بروتين الاهتمام قد لا تعبر عن بما فيه الكفاية داخل هذه الخطوط الخلية. وفي هذه الحالات، وجدت لإظهار مستويات عالية من البروتين التعبير خطوط الخلايا الأخرى، مثل Expi293 الخلايا،من8182، وينبغي أن يعتبر كبديل.
إذا لم يتم الحصول على بلورات أمر جيد، ديفراكتينج عقب اختبار نيات العديد من بروتين الاهتمام على الرغم من درجة نقاء عالية، قد يكون من الضروري توسيع تقنيات التبلور لتشجيع تشكيل الكريستال. فقد ثبت أن القوات المسلحة البوروندية أجزاء من الأجسام المضادة ونانوبوديس يمكن أن تكون القدرة على بلورة ممتازة، وتعزيز أمر جيد كريستال التعبئة83،،من8485. يمكن أعربت هذه الشظايا وتنقيته للتجانس، والمستخدمة في مجمع مع البروتين لمصلحة تعزيز بلورة. الأهم من ذلك، يمكن أن يكون القوات المسلحة البوروندية الأجزاء المنتجة كما هو موضح في القسم 10 ميل إلى شكل غير وظيفية LC dimers86. Dimers هذه الملوثات وينبغي إزالتها أثناء التنقية. في تجربتنا، LC dimers غالباً ما يكون وحدة تخزين استبقاء مختلفة على حجم الاستبعاد، أو الوت كذروة متميزة على التبادل الأيوني اللوني، وبالتالي يمكن إزالتها من تطهير القوات المسلحة البوروندية-بيد أن هذا ليس هو الحال دائماً. إذا كانت هذه الأساليب غير كافية لإزالة LC dimers من تطهير القوات المسلحة البوروندية، يمكن أن تستخدم أساليب تنقية إضافية، مثل "البروتين ز" انجذاب تطهير، لتحسين نقاء.
بديل كومبليكسيشن co مع القوات المسلحة البوروندية الشظايا، تقنيات موثقة توثيقاً جيدا مثل ميكروسيدينج مصفوفة عشوائية يمكن أن تحسن فرص الحصول على بلورات أمر جيد63،70. يتضمن هذا الأسلوب إضافة كميات صغيرة من بلورات سحقت، دون المستوى الأمثل في حالة التبلور، توفير نوكليتي لتشجيع نمو البلورات كريستال. وهذا يمكن أن يؤديها باستخدام بلورات البروتين من الفائدة، أو تلك مع بنية المجال مشابه في الهندسة المعمارية، والتعليم العالي. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء ميكروسيدينج مصفوفة عشوائية في المحاولات الرامية إلى بلورة البروتينات وحدها أو في المجمع مع القوات المسلحة البوروندية يفتت أو جزيء صغير من الفائدة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في الميكروسكوب الإلكتروني البرد أيضا جعل هذا الأسلوب بديلاً جذاباً لعلم البلورات بالأشعة السينية للحصول على المعلومات الهيكلية ذات الدقة العالية لجزيئات مع الميزات المناسبة87،88، 89،،من9091.
عندما يفشل التدريجي لمجموعات البيانات حيود الأشعة السينية بالسيد، يلزم هكتار مغطس لحل مشكلة المرحلة بتشتت الشاذة أو استبدال إيسومورفوس. تفتيش تسلسل الأحماض الأمينية من البروتين يمكن أن توفر أدلة حول الاستراتيجية derivatization هكتار، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني الأمثل للربط. على وجه الخصوص، على وجه التحديد ربط سيستينيس مزاوج داخل البروتين هكتار من المركبات التي تحتوي على الزئبق. مغطس البلورات الأصلية مع مركبات ها عملية تكرارية لتحديد هوية المجمع هكتار الأمثل وتركيزه، وفترة الحضانة المطلوبة. إذا كانت لا تؤدي المحاولات الأولية مغطس بلورات جيدا ديفراكتينج التي تحتوي على ها مناسبة للتخلص التدريجي، قد يكون ضروريا لإدخال بدائل من الأحماض الأمينية لتحسين احتمالات ربط هكتار وتحسين الإشارات الشاذة. أمثلة الطفرات تشمل بقايا سيستين مجاناً لكفاءة ربط زئبق، والاتحاد الأفريقي، وحزب العمال أو Pb. التعبير عن البروتينات التدريجي الشاذة في وسائل الإعلام سيلينو-ميثيونين تستكمل في كولاي يستخدم على نطاق واسع للتخلص التدريجي الشاذة، ولكن نظام يعادل موثوق يتضمن سيلينو-الميثيونين ليست متاحة بسهولة لخلايا الثدييات في تعليق92،93، وهو مجال للتنمية في المستقبل.
حالما يتم الحصول على هيكل أونليجانديد بروتين سكري للفائدة، يمكن إجراء مغطس البلورات مع جزيء صغير يغاندس الحصول على بنية المجمع يجند مستقبلات محصنة. هذه البيانات توفر مخططا لتصميم يغاندس أكثر تحديداً والنسب العالية التي يمكن استخدامها كالمداواة جزيء صغير، فضلا عن توفر أفكاراً عالية الدقة في الوظيفة البيولوجية لبروتين سكري عقلانية. فحص بنية بلورية أونليجانديد عند محاولة نقع بلورات بروتين سكري مع يغاندس جزيء صغير من الفائدة، يمكن أن تشير إلى سواء مغطس ينبغي أن يكون من الممكن. في حالة إغلاق كريستال-التعبئة جهات الاتصال التي وجدت في جميع أنحاء الموقع ملزم يجند أو حول المناطق التي من المتوقع أن يخضع لتغييرات كونفورماشونال عند يجند ملزمة، مغطس من المرجح أن يكون مشكلة. وفي هذه الحالة، ينبغي القيام بطرق أخرى مثل بلورة المشارك من البروتين-يجند المجمع.

البروتينات السطحية تلعب أدواراً حاسمة في وظيفة الخلوية. من خلال هذه المجالات خارج الخلية، يمكن أن تعدل هذه البروتينات الغشاء التفاعلات خلية خلية، الالتصاق، والنقل، ويشير إلى1،2. توطين هذه البروتينات خارج الخلية يجعلها أهدافا جذابة لتطوير علاجات لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض المناعة الذاتية3،،من45 , 6 , 7-واحد من طيات الغشاء البشري البروتين اكتودومينس الأكثر شيوعاً هو إضعاف مثل الغلوبولين المناعي (Ig)، المكونة من سبعة أو أكثر β-خيوط ترتيبها في ورقتين β،من89. عادة، يتم glycoproteins المحتوية على المفتش العام هياكل متعددة المجالات مع المجالات Ig مرتبة تسلسلياً على الجزء خارج الخلية من غشاء بروتين10. بوستترانسلاشونال إدخال تعديلات على هذه البروتينات سطح الخلية، لا سيما glycosylation N و O مرتبطة، تبين أن تلعب أدواراً أساسية في تنظيمها، للطي، إفراز ووظيفة11. مطلوبة لتحسين فهمنا لوظيفتها والمداواة تصميم أفضل التي يمكن توجيهها، التقنيات التي تسمح لتكييفها الجزيئية المفصلة. هنا، فإننا نقدم مجموعة من التقنيات التي تسمح الفيزيائية الحيوية (بيولايير قياس التداخل (BLI) ومعايرة متحاور القياس (ITC)) ووصف الهيكلية (علم البلورات بالأشعة السينية) للمجال خارج الخلية التي تحتوي على المفتش العام غشاء جليكوبروتينس، وحدها وفي المجمع مع يغاندس بيولوجيا ذات الصلة وجزيئات علاجية (الشكل 1).
Glycosylation المرتبطة بنون واحدة من التعديلات بعد انتهاء الترجمة الأكثر شيوعاً في البروتينات الثدييات، ويحدث أثناء نضج البروتين داخل هيولى وغولجي12،13. وقد وضعت خطوط الخلايا، مثل الخلايا 293 الكلي الجنينية البشرية (HEK)، للتعبير المؤتلف لكميات كبيرة من البروتينات الثدييات الغليكوزيلاتي14،15. وقد وضعت هذا الخط الخليوي في شكل تعليق، الذي يسمح بالسهولة للارتقاء بمستوى إنتاج البروتين بكميات أكبر بالمقارنة مع خطوط الخلايا ملتصقة. هنا، فنحن نستخدم اثنين من خطوط الخلايا HEK293: HEK293F وجنت HEK293 أنا-/- (HEK293S)، التي تختلف بسبب غياب ترانسفيراز أسيتيلجلوكوسامينيل ن أنا (جنت أنا) في الحالة الثانية. وفي المقابل، ليس من الممكن إنتاج جليكانس معقدة (كما في HEK293F) وعالية بدلاً من ذلك يطلق من نوع جليكانس (غالباً الرجل5جلكناك2) يقيمون في جليكان ن ربط مواقع18،19،20 . يسمح باستخدام هذه الخطوط الخلية اثنين بالتوازي مع دراسة تأثير حجم جليكان والتعقيد على الوظيفة البيولوجية، واستهداف العلاجية. وفي الواقع، سيكون glycoproteins تنتج في الخلايا HEK293F جليكانس أكبر حجماً وأكثر تعقيداً مقارنة بروتين سكري نفس المنتج في خلايا HEK293S. جليكوبروتينس التي تنتج في خلايا HEK293S أكثر قابلية للتبلور، بسبب عدم تجانس الكيميائية و conformational انخفاض جليكانس ن مرتبطة بهم. لمواصلة تحسين كريستاليزابيليتي، glycoproteins تنتج في الخلايا HEK293S (ولكن ليس HEK293F) يمكن أن يعاملوا معاملة الإنزيم اندوجليكوسيداسي ح (ح إندو)، مما يؤدي الانقسام ومن جليكانس عالية يطلق مثل هذه إلا أن واحد ن-أسيتيلجلوكوساميني (GlcNAc) ويظل moiety في كل موقع جليكوسيليشن ن ربط21،22. يمكن أيضا استخدام أساليب أخرى للحد من المعالجة جليكان ن داخل الخلايا، مثل إضافة مثبطات جليكوسيلترانسفيراسي خلال التعبير بروتين سكري، بما في ذلك كيفونينسيني23. النهج البديلة تنطوي على التعبير عن glycoproteins الأصلية (في الخلايا HEK293F) تليها الانزيمية ديجليكوسيليشن باستخدام الببتيد و ن-جليكوسيداسي (بنجاسيف). ومع ذلك، قد تبين ديجليكوسيليشن مع بنجاسيف أقل فعالية في ظل الظروف الأصلية وتجميع زيادات في بعض البروتينات؛ في الحالات عندما لا يزال البروتين للذوبان بعد العلاج، يكتسب الاتهامات السلبية على سطحه بسبب ديميديشن بقايا الهليونين إلى24من حمض الأسبارتيك، التي قد تكون ضارة لأن تبلور. يمكن أيضا تحور تنبأ glycosylation ن المواقع، في أغلب الأحيان إلى بقايا ألانين أو الجلوتامين، لمنع جليكوسيليشن ن مرتبطة في هذه المواقع وتوليد عينات بروتين سكري من التجانس عالية. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تنتج glycoproteins في الثقافات الخلية حقيقية النواة الأخرى، بما في ذلك الخميرة، والحشرات، والنظم النباتية، أو خطوط خلايا الثدييات الأخرى مثل الهامستر الصيني المبيض (شو) خلايا16،17.
تسمح العديد من ناقلات التعبير الثدييات، بما في ذلك فلسيك، لإفراز اكتودومينس بروتين سكري المؤتلف في خلية متوسطة25. يسمح إفراز جليكوبروتينس من الخلايا HEK293 لتنقية سريعة وسهلة دون الحاجة لتحلل الخلية. إضافة العلامات تنقية (مثلاً، صاحب العلامة، وبكتيريا-العلامة، العلم، العلامة، علامة حركة، ها-العلامة) إلى المحطة N أو ج الهدف يسمح بروتين سكري تنقية بلوني تقارب خطوة واحدة. وفي وقت لاحق، يمكن استخدام حجم الاستبعاد اللوني تسفر عن عينة مونوديسبيرسي لتحديد الخصائص الفيزيائية-الحيوية والهيكلية.
عينة بروتين سكري عالية نقية ومتجانسة تحت الظروف الملائمة يمكن أن ينتج بلورات ديفراكتينج جيدا. مجرد مجموعة كاملة من حيود الأشعة السينية الحصول من هذه البلورات، المراحل الأولية بحاجة إلى مصممين على حساب كثافة الإلكترون بروتين سكري. وبفضل عدد متزايد من أي وقت مضى من الهياكل في مصرف بيانات البروتين (PDB)، أصبح الأسلوب الأكثر شيوعاً للتخلص التدريجي حتى الآن استبدال الجزيئية (MR)، الذي يستخدم بنية بروتين ذات صلة للحصول على26من المراحل الأولية. ومع ذلك، عندما يفشل MR لحل مشكلة المرحلة، كما حدث أحياناً للمفتش العام متعدد المجال glycoproteins27،،من2829، الأساليب البديلة مطلوبة. في هذه المقالة، نحن بالتفصيل طريقة نقع بلورات مع الذرات الثقيلة (ها) للتخلص التدريجي، الذي كان يلزم لحل هيكل اكتودومين CD2228. تحديد حق ها للتخلص التدريجي هي عملية تكرارية تعتمد على مفاعليه هكتار، الذرات المتوفرة في بروتين سكري في شعرية كريستال معين، وفي بلورة حل30،31. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام ذرات الكبريت الطبيعية في بقايا السيستين والميثيونين التدريجي إذا كان موجوداً بنسبة عالية بما يكفي لذرات أخرى في بروتين سكري، وإذا كان يمكن جمع البيانات حيود الأشعة السينية مع التكرار مرتفعة بما يكفي32، 33.
الوظيفة البيولوجية لغشاء جليكوبروتينس هو غالباً بوساطة تفاعلات البروتين البروتين أو البروتين-يجند التفاعلات، كما هو الحال مع الكربوهيدرات. عندما يجند صغيرة بما يكفي لنزع فتيل من الحل إلى موقع ربط بروتين سكري في الكريستال المشبك، يمكن مغطس تجارب ناجحة الحصول على بنية كريستال مشارك يجند بروتين سكري فهم أفضل ليجند الاعتراف.
البروتوكولات المقدمة هنا أيضا ذات صلة بفهم التفاعلات بين glycoproteins السطحية مع يغاندس العلاجية الاصطناعية34،35 وجسم المداواة36،37. عندما يتم دمجها مع المعلومات الهيكلية، ملزمة الحركية والديناميكا الحرارية يمكن قوية لفهم وتحسين آلياتها للعمل. هو أسلوب واحد الذي يسمح للتحليل الحركية للأجسام المضادة العلاجية ملزمة بروتين سكري BLI38،39. BLI يستخدم أجهزة استشعار العوامل البيولوجية مع يجند المعطل تداولها لقياس حركية الرابطة وتفكك مع شريك ملزم، في نهاية المطاف تحديد قيمة ثابتة تفكك توازن (كد). BLI نهج جذابة لأن كميات صغيرة من glycoproteins مطلوبة (< 100 ميكروغرام)، وقت التجربة بسرعة (~ 10-15 دقيقة لكل تشغيل)، وأنه يمكن أن يكون آليا. مركز التجارة الدولية أيضا مفيدة لدراسة الصلات بين glycoproteins وربط الشركاء40،41،،من4243. أن مركز التجارة الدولية مزيدا من الوقت وكاشف المكثفة، فيمكن الحصول على معلومات قيمة بخصوص الديناميكا الحرارية للتفاعل (ΔG، ΔH، ΔS، وستويتشيوميتري). مركز التجارة الدولية أيضا مفيدة جداً لدراسة التفاعلات الضعيفة التي غالباً ما ترتبط مع ربط عابر glycoproteins السطحية إلى يغاندس. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنيات بالاقتران بتقييم الربط من بنيات مختلفة وتأثير مختلف جليكوفورمس ن ربط الحصول على التعبير بروتين سكري في خطوط الخلايا مختلفة عن. يمكن أن توفر أداء BLI ومركز التجارة الدولية مع جليكوبروتينس المنتجة في HEK293F، HEK293S، وتعامل مع ح إندو نظرة متعمقة لدور جليكانس في النشاط البيولوجي والمشاركة العلاجية.
نحن طبقت بنجاح هذه البروتوكولات لوصف المجال خارج الخلية (النماء) للبشرية CD2228، عضو الأسرة lectins (سيجليكس) مثل Ig الحامض اللعابي الملزمة التي لا غنى عنها للحفاظ على التوازن ب-خلية44 بروتين سكري . نحن إجراء تصميم بنية متعمقة لتيسير بلورة ومراحل dataset بالأشعة السينية قبل ها مغطس مع الزئبق. نحن أيضا غارقة بلورات CD22 مع حمض اللعابي يجند لها (سياليلاكتوسي α2-6) الحصول على بنية مجمع المناعي مستقبلات-يجند وهكذا قدمت المخططات لتصميم هيكل تسترشد جليكان mimetics45،46. وبالإضافة إلى ذلك، أنشأنا ربط مستضد يفتت (القوات المسلحة البوروندية) ابراتوزوماب جسم العلاجية المضادة-CD22-مرشح علاجية حاليا في المرحلة الثالثة التجارب السريرية ل الأورام اللمفاوية غير هودجكين47-لتحديد تقارب ملزم واسطة BLI و مركز التجارة الدولية خلطات الغليكوزيلاتي نيات CD22 نماء الطفولة المبكرة. وكشفت هذه الدراسات دوراً حاسما جليكوسيليشن ن مرتبطة في الاشتباك ابراتوزوماب، مع الآثار المحتملة للاعتراف CD22 على اختلال ب الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

جليكوبروتينس على سطح الخلايا تلعب أدواراً حاسمة في وظيفة الخلوية، بما في ذلك الإشارات، التصاق والنقل. في الكريات البيضاء، العديد من هذه جليكوبروتينس تملك طيات الغلوبولين المناعي (Ig) وهي المركزية للاعتراف بالحصانة والتنظيم. نقدم هنا، منبرا للتصميم والتعبير وتوصيف الفيزيائية الأحيائية في المجال خارج الخلية من الخلايا البشرية بمستقبﻻت CD22. ونحن نقترح أن هذه النهج قابلة للتطبيق على نطاق واسع لوصف اكتودومينس بروتين سكري الثدييات التي تحتوي على نطاقات المفتش العام. تعليق الكلي الجنينية البشرية (HEK) خلية سطرين، HEK293F و HEK293S، تستخدم للتعبير عن glycoproteins إيواء جليكانس معقدة وعالية-يطلق، على التوالي. هذه glycoproteins المؤتلف مع جليكوفورمس مختلفة تسمح للتحقيق في تأثير الحجم جليكان وتكوينها على ملزم يجند. ونحن نناقش البروتوكولات لدراسة حركية والديناميكا الحرارية لربط بروتين سكري يغاندس بيولوجيا ذات الصلة والمرشحين جسم العلاجية. Glycoproteins المؤتلف تنتج في الخلايا HEK293S قابلة للتبلور بسبب التجانس جليكان وانخفاض المرونة والقابلية للعلاج اندوجليكوسيداسي ح. نقدم أساليب لامتصاص بروتين سكري بلورات مع الذرات الثقيلة والجزيئات الصغيرة لمرحلة التصميم والتحليل ليجند ملزمة، على التوالي. البروتوكولات التجريبية وناقش هنا تبشر بتوصيف glycoproteins الثدييات تعطي فكرة عن وظيفتها والتحقيق في إليه العمل للمداواة.

بنجاح عدة بنيات للنماء CD22 المستنسخة في ناقلات التعبير فلسيك و overexpressed في الثدييات HEK293F و HEK293S خطوط الخلايا (الشكل 2 و 3 ألف). كافة بنيات تنقيته لتجانس الحجم حسب حجم الاستبعاد اللوني وأسفرت عن عينة نقية جداً لبلورة دراسات (الشكل 3 و 3 ج). بناء CD22 التي أدت إلى بلورات ديفراكتينج جيدا تم اقتطاع d1 d3 (بقايا 20-330)، مع خمسة من ستة مواقع glycosylation المتوقعة المرتبطة بنون تحور من Asn لعلاء (N67A، N112A، N135A، N164A و N231A)، تنتج في الخلايا HEK293S، إلا أن مثل هذه موقع جليكوسيليشن في موقف أبقى N101 (يسمى هذا بناء CD2220-330، 5 ألف). تم الحصول على بلورات في عدة شروط للشاشة متفرق مصفوفة مكسج-1، ولكن كانت بلورات أفضل من حالة التي تحتوي على 30% (w/v) البولي إيثيلين غليكول 4000 وكلوريد الليثيوم 0.2 M 0.1 M تريس، pH 8.5. هذه البلورات الأصلية ديفراكتيد 2.1 Å القرار؛ استخدام الهياكل المعروفة للمفتش العام في المجالات ذات الصلة سيجليك البروتينات لم تسفر عن أي حلول في تفتيش MR.
للحصول على معلومات التنفيذ على مراحل، ونحن غارقة البلورات الأصلية مع فريق من هكتار من المركبات التي شملت Hg، Pt، نظام التشغيل، تا، وفرع بتركيزات تتراوح بين 1-20 ملم ها مجمع لفترة حضانة من 5 دقائق إلى د 1 (الشكل 4). نحن رصد بلورات للتغييرات في التشكل، ووجدت أن بلورات غارقة مع ها المجمع في 20 مم أدى إلى تكسير السريع وتذويب البلورة. نحن جمدت ما مجموعة 63 بلورات الإبقاء على شكلها بعد الحضانة تعيين الأوقات التي كانت غارقة مع الكتلة بروميد تانتالوم، كلوريد البلاتين، خلات نيل الزئبق وكلوريد ميركوريك. بلورات غارقة مع 7 ملم كلوريد ميركوريك لمدة 30 دقيقة أظهرت الإشارات الشاذة على تفحص fluorescence في بيمليني 08-BM مصدر الضوء الكندية (CLS) (ساسكاتون، كندا) ويسمح للتشتت الشاذ متعددة الطول الموجي جمع بيانات الأشعة السينية على واحد كريستال. هذه datasets سمح لنا بحل الهيكلية الزئبق من CD2220-330، 5A، التي كشفت من ذرة واحدة من الزئبق منضمة إلى سيستين مجاناً في موقف C308 وفي نهاية المطاف سمح لنا ببناء هيكل CD225A 20-330، إلى مراحل خريطة كثافة الإلكترونات باستخدام أوتوبويلد78.
مرة واحدة تم حلها هيكل أونليجانديد، نحن مهتمون في حل هيكل CD22 ملزمة بأن يجند، سياليلاكتوسي α2-6. أولاً حسبنا تقارب CD22 نحو سياليلاكتوسي α2-6 استخدام المركز لتحديد خصائص الديناميكا الحرارية ملزم للتفاعل. أننا لاحظ تقارب ميكرومتر ~ 280 وتستخدم هذه المعلومات للتعرف تركيز أولية (~ 100 × كد) ليجند لاستخدامها لامتصاص لدينا الأصلي CD2220-330، 5A بلورات. ونحن غارقة بلورات CD2220-330، 5 ألف مع سياليلاكتوسي 25 مم لمدة 5 دقائق، ح 2، ح 14، ح 40 ود 5 ورصد التغيرات في مورفولوجيا كريستال. مجموعة بلورات ~ 75 كانت مجمدة من النقاط الزمنية المختلفة وإرسالها إلى CLS السنكروتروني بيمليني 08-المعرف (ساسكاتون، كندا) لجمع بيانات الاستشعار عن بعد. وجمعت ما مجموعة ست مجموعات بيانات الأشعة السينية من بلورات ديفراكتينج جيدا. الهيكل من كل مجموعة بيانات الأشعة السينية تم حلها بالسيد باستخدام أونليجانديد CD2220-330، 5A هيكل كنموذج بحث أولية. ثم جرى تفتيش كثافة الإلكترونات الناتجة عن ذلك لجميع مجموعات البيانات لكثافة إيجابية في خريطة Fo-إف سي أن تتوافق مع الالتزام سياليلاكتوسي α2-6 داخل الموقع الملزم ل CD22. بشكل ملحوظ، جميع مجموعات البيانات التي تم جمعها، حتى أولئك من بلورات غارقة بعد الواردة فقط 5 دقائق من وقت الحضانة، كثافة الإيجابية المقابلة ليجند في الموقع ملزم. الهياكل العامة أونليجانديد وليجانديد CD22 متشابهة جداً مع تغيرات طفيفة كونفورماشونال، الذي قد يفسر نجاح تجارب مغطس مع سياليلاكتوسي α2-6.
نحن التالية يتميز سطح مستضدي CD22 المعترف بها ابراتوزوماب جسم العلاجية في تجارب BLI ومركز التجارة الدولية (الشكل 5). كشفت التشكيلات الحركية والديناميكا الحرارية لربط ابراتوزوماب القوات المسلحة البوروندية إلى ثوابت CD22 مع مختلف جليكوفورمس تقارب متزايد إلى CD22 مع حجم انخفاض جليكان المرتبطة بنون، مع يصل إلى حدوث تحسن معدل في تقارب لأصغر جليكانس (327 نيوتن متر مقابل 24 نانومتر في BLI؛ 188 نيوتن متر مقابل 58 شمال البحر الأبيض المتوسط في مركز التجارة الدولية). وكان يحددها جليكان ن CD22 مرتبطة تقييد حصول من الجسم إلى بيفرتون في BLI استخدام طفرات نقطة واحدة من CD22 وحل ابراتوزوماب القوات المسلحة البوروندية-CD22 d1 d3 كريستال المشارك هيكل28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> الشكل 1 . نظرة عامة على توصيف بروتين سكري من تصميم بناء على الخصائص الفيزيائية-الحيوية والهيكلية- (1) تحليل تسلسل الأولية من بروتين سكري الممثل. في الرمادي، المجال خارج الخلية (النماء)؛ باللون الأخضر، الجزء (TM) ترانسميمبراني؛ وفي الزرقاء، مجال سيتوسوليك بروتين سكري. تتم تسمية جليكانس المتوقعة المرتبطة بنون. (2) الاستنساخ من بنيات نماء الطفولة المبكرة. (3) التعبير عن نيات النماء في خلايا الثدييات. (4) تنقية بروتين سكري. في حين سوف تحتوي على البروتينات التي أعرب عنها في HEK293F جليكانس معقدة، سيكون البروتينات التي أعرب عنها في HEK293S جليكانس يطلق عالية. العلاج الأنزيمي من جليكوبروتينس المنتجة في الخلايا HEK293S مع نتائج ح إندو في جليكوبروتينس مع فقط مجموعة جلكناك في مواقع مرتبطة بنون جليكوسيليشن. اختبار جليكوبروتينس (5a) حيث تجليدها للأجسام المضادة بيولايير قياس التداخل (BLI) ومعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). يمكن أيضا قياس النسب إلى يغاندس الصغيرة بمركز التجارة الدولية. 5 () بلورة المحاكمات من جليكوبروتينس مع جليكانس ن ربط متجانسة، مثل تلك التي عبرت في HEK293S وديجليكوسيلاتيد مع إندو حاء (6) وفي بعض الحالات، طفرة المواقع المرتبطة بنون glycosylation من الضروري الحصول على بلورات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> الشكل 2 . تصميم اكتودومين CD22 الحمض النووي بنيات للتعبير في خلايا الثدييات. A) تمثيل بلازميد فلسيك المستخدمة تعداء عابرة من بنيات CD22 نماء الطفولة المبكرة. يتم الإشارة إلى المواقع يجئ وكبني المستخدمة لاستنساخ مع مربعات حمراء. ب) "CD22 النماء" يحتوي على سبعة مجالات Ig (d1-d7) و 12 موقعا glycosylation المتوقعة المرتبطة بنون (باللون الأزرق). وقد صممت ثوابت أربعة من النماء CD22. ج) 1% [اغروس] هلام عرض أمبليكونس بكر من النماء CD22 بنيات للاستنساخ في ناقلات التعبير الثدييات فلسيك. لين أول يحتوي على علامة الحمض النووي 1 كيلو بايت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> الشكل 3 . التعبير وتنقية glycoproteins. A) أثر كثافة الخلية على غلة التعبير. بروتين سكري التعبير في الثقافة الصغيرة 25 مل من خلايا تعليق HEK293F ترانسفيكتيد باستخدام ثلاثة كثافات مختلفة بدءاً من الخلايا (0.5 × 106 خلايا مل-1و 1.0 × 106 خلايا مل-1و 1.5 × 106 خلايا مل -1). إجراء القياس الكمي بقياس كثافة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في اللوحة اليسرى و BLI الكمية في اللوحة اليمنى. القيم ممثل واحد بروتين سكري إعداد. ب) تشروماتوجرام لتنقية الخطوة الأولى لبناء CD2220-330، 5 ألف من 600 مل من المادة طافية باستخدام عمود النسب ني-الإدارة الوطنية للسياحة. وكان التيد بروتين سكري استخدام رج ايميدازول (خط رمادي)، حيث يتوافق 100% مع شطف المخزن المؤقت، والذي يتضمن ايميدازول 500 ملم. ويرد الكسور المجمعة مع خطوط عمودية. ج) تشروماتوجرام حجم الاستبعاد لبناء CD2220-330، 5A عالية أداء باستخدام هلام الترشيح العمود. ويرد الكسور المجمعة من ذروة شطف مع خطوط عمودية. اقحم: جل الملطخة بأخذ الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عرض نقاء بروتين سكري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> الشكل 4 . كريستال مغطس مع الذرات الثقيلة. A) محطة العمل عينة لامتصاص البلورات الأصلية مع مركبات هكتار. كافة المطلوبة يتم تسمية الأدوات. ب) الخطوات التي اتبعتها نقع بلورات من تشييد CD2220-330، 5A مع مركبات هكتار. الخطوة 1، فتح أيضا تحتوي على بلورات ونقل بلورات استخدام حلقة إلى انخفاض 0.2 ميليلتر في كشف الغطاء الذي يحتوي على حل ها مخففة في حالة تبلور بتركيز ها النهائي يتراوح بين 1-10 ملم. الخطوة 2، ختم قطره في لوحة تبلور واحتضان بلورات مع ها مجمع لفترات مختلفة من الزمن. الخطوة 3، جبل الكريستال غارقة في الحلقة ونقع مرة أخرى لمدة 30 ثانية في ثلاث متتالية 0.2 ميليلتر قطرات تحتوي على الحل الخمور الأم تستكمل مع 20% (v/v) والغليسيرول الاستغناء في كشف الغطاء. الخطوة 4، فلاش تجميد الكريستال التي شنت على حلقة مع النتروجين السائل ووضعه في عفريت لشحنها إلى بيمليني السنكروتروني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> الشكل 5 . بيولايير قياس التداخل ومتحاور المعايرة القياس القياسات. A) تجربة الممثل BLI. أعلى اللوحة: مثال من لوحة الإعداد لتجربة حركية، حيث تتم تسمية التالية: المخزن المؤقت 1 x حركية (ب)، تقريرهالعاشر 6-بروتين سكري كلمات تحميل (L)، وتركيزات القوات المسلحة البوروندية الممثل (500، 250، 125، 62.5 nM)، برنامج تلفزيوني + التجديد 500 مم المخزن المؤقت (R)، و 1 × تحييد حركية المخزن المؤقت (ب). كذلك يتضمن كل 200 ميليلتر للحل. تتم الإشارة إلى عدد خطوة للتجربة الحركية في الجزء العلوي من اللوحة. الفريق الأوسط: الممثل البيانات الخام BLI تجربة إجراء باستخدام أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ني-جاتا واللوحة الموصوفة في أعلى اللوحة. وتناظر الأرقام خطوة الأساس (1)، له بروتين سكري6 x تحميل (2)، والأساس (3)، رابطة في تمييع المسلسل من القوات المسلحة البوروندية (4) والانفصال (5). خطوات التجديد ليست ممثلة (الخطوات 6-7). اللوحة السفلية: ممثلة من البيانات تم تحليلها تبين الرابطة الخام والانفصال (الخط الأزرق) مع المناظرة 1:1 تناسب (الخط الأحمر). ب) أعلى اللوحة: تشغيل الإعداد لوحة تمثيلية لمركز مفردة على صك مركز الآلي مع سبع تجارب في 96-فضلا عن جولة كتلة أسفل. وتتألف من ثلاثة آبار كل تجربة. البئر الأولى (أحمر) يتوافق مع نموذج للخلية (400 ميليلتر)، البئر الثاني (الأخضر) يتوافق مع عينة للمحاقن (120 ميليلتر). الثالث هو ترك فارغاً، وسوف تعاد العينات المختلطة إلى هذا جيدا بعد إتمام التجربة. تجارب 1 و 2 و 7 من المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت لعناصر التحكم. وتمثل التجارب 3-5 ثلاث تجارب مع بروتين سكري (P) في الخلية، والقوات المسلحة البوروندية أو يجند (L) في المحاقن. التجربة 6 تمثل حرارة يجند لتخفيف السيطرة وينبغي طرح من تجارب 3-5 أثناء تحليل البيانات. اللوحة السفلية: الممثل الخام (أعلى) وبيانات المركز المجهزة (أسفل) تظهر القوات المسلحة البوروندية (ابراتوزوماب) ملزمة للنماء CD22 تنتج في الخلايا HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

نقدم النهج لتوصيف glycoproteins الفيزيائية-الحيوية والهيكلية مع حظيرة الغلوبولين المناعي بقياس التداخل بيولايير ومعايرة متحاور القياس وعلم البلورات بالأشعة السينية.

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

Liquids, Solids, and Intermolecular Forces

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

خطوط أنابيب البلورات الآلية في مرفق EMBL HTX في غرونوبل

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...