Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
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Des expériences de diffraction des rayons x décrits dans cet article ont été effectués avec ces faisceaux ID 08 et 08-BM au canadien de rayonnement synchrotron, qui est soutenu par la Fondation canadienne pour l’Innovation, Sciences naturelles et en génie conseil de recherches du Canada, le Université de la Saskatchewan, le gouvernement de la Saskatchewan, Diversification de l’économie de l’Ouest Canada, le Conseil National de recherches du Canada et les Instituts canadiens de recherche en santé. Nous tenons à remercier la construction & la biophysique Core Facility, l’hôpital pour enfants malades, accès aux instruments de CCI et BLI. Sergent a été pris en charge par Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 de l’instituts de recherche en santé du Canada. T.S. est récipiendaire du Canada Graduate Scholarship maîtrise Award et une bourse Canada de Vanier de l’instituts de recherche en santé du Canada. Ce travail a été soutenu par Subv PJT-148811 (J.-P.J.) de l’instituts de recherche en santé du Canada. Cette recherche a été entreprise, en partie, grâce au financement du programme des chaires de recherche du Canada (J.-P.J.).

Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.

Glycoprotéines membranaires ancrés sont critiques pour la fonction cellulaire et cibles thérapeutiques intéressantes. Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation structurale et biophysique de la JEC de glycoprotéines membranaires, les deux seuls ou en complexe avec des ligands de petites molécules et de fragments Fab. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour déterminer la structure cristalline des trois domaines Ig N-terminal-la plupart de la partie extracellulaire du humain CD2228, un corécepteur critique sur les cellules B impliqués dans le maintien de l’immunité humorale en cocher79. Nous avons également caractérisé l’accepteur de CD22 avec son ligand naturel α2-6 sialyllactose et défini le mode de reconnaissance d’un anticorps thérapeutique vers CD22 humaine. Ces résultats fournissent des aperçus de la relation structure-fonction de membre clé de la famille Siglecs qui a limité l’expression sur les lymphocytes B et une feuille de route moléculaire pour le développement de nouvelles petites molécules ciblées de CD22 et d’anticorps méthodes thérapeutiques. Alors que ce protocole a été utilisé avec succès pour un récepteur des cellules B contenant de l’Ig, nous proposons que notre approche peut être appliquée pour la caractérisation structurale et biophysique d’une glycoprotéine membranaire avec une organisation de domaine distincts. Dans ce cas, construire design et combinatoire glycane N-liés des mutations (que ce soit à Gln ou Ala) peuvent être évaluées pour trouver une construction approprié pour la croissance de cristaux et de diffraction à haute résolution.
Obtenir un échantillon homogène et pur glycoprotéine est d’une importance cruciale pour la croissance de cristaux et de diffraction des rayons x, ainsi que pour la caractérisation biophysique en aval. N-glycanes présents sur les glycoprotéines sont par nature hétérogènes et peuvent causer une hétérogénéité conformationnelle et chimique au sein de la glycoprotéine qui peut décourager la formation de cristaux. Pour réduire cette micro-hétérogénéité, stratégies qui introduisent des mutations ponctuelles pour éliminer les résidus Asn prévues pour héberger des N-glycanes, ou en utilisant des lignées de cellules mutantes (comme HEK293S) suivi du traitement par endoglycosidases (par exemple EndoH) peuvent considérablement améliorer la cristallisation succès15,21,22. Dans ce protocole, nous discutons de la purification de glycoprotéines solubles et Fabs qui sont sécrétées dans la cellule surnageante. Sécrétion de glycoprotéine fournit un itinéraire relativement simple vers la pureté, sans la nécessité de la lyse cellulaire ou l’ajout de produits chimiques ou détergents. La cellule surnageant, obtenu suivant cellule récolte est ensuite exécutée directement sur une colonne qui a une affinité pour la protéine d’intérêt (par exemple, Ni-NTA de glycoprotéines His-tag, ou de l’affinité de la LC pour les fragments Fab). Toutefois, selon la colonne d’utilisation et les conditions de la cellule surnageante (p. ex., pH), la fonctionnalité de liaison de la protéine d’intérêt pour la colonne peut être affectée. Si c’est le cas, il peut être nécessaire de se concentrer et de mettre en mémoire tampon la cellule surnageante d’échange afin d’améliorer la liaison à la colonne. En outre, il est fortement recommandé que des mesures de contrôle de la qualité durant la purification être employées pour évaluer la pureté de la protéine. Exécute un gel SDS-PAGE ou Western blot de tous les échantillons (avant, pendant et après les étapes de purification) peut donner un aperçu si le schéma de purification proposée convient à la protéine d’intérêt. Si contaminantes bandes sont visibles sur SDS-PAGE, ou si plusieurs espèces sont obtenus au cours de la purification (par exemple, plusieurs sommets sur l’exclusion de taille), étapes de purification supplémentaires devraient être envisagées, par exemple, chromatographie échangeuse d’ions, à gagner dans la pureté et l’augmentation des chances de cristallisation en aval80.
De cristallisation macromoléculaire, il est souvent essentiel d’obtenir des rendements élevés de la protéine d’intérêt pour permettre la projection d’un grand nombre des conditions de cristallisation potentiels à des concentrations de protéines pour trouver approprié crystal hits. Généralement, les lignées de cellules HEK293 discutées ici (HEK293F et HEK293S) sont des systèmes d’expression robuste et peuvent être facilement transposées de produire un échantillon plus que nécessaire. Cependant, il est possible que la protéine d’intérêt ne peut pas exprimer suffisamment au sein de ces lignées cellulaires. Dans ces cas, autres lignées de cellules, telles que les cellules de Expi29381,82, ont été trouvées pour montrer des niveaux supérieurs d’expression de la protéine et devraient être considérées comme une alternative.
Si bien ordonnées, diffraction de cristaux n’est pas obtenus après essais de plusieurs constructions de la protéine d’intérêt malgré le haut degré de pureté, il peut être nécessaire de développer des techniques de cristallisation pour promouvoir la formation de cristaux. Il a été démontré que des fragments Fab d’anticorps et nanocorps peuvent être exhausteurs de cristallisation excellent et promouvoir le cristal bien ordonnée d’emballage83,84,85. Ces fragments peuvent être exprimées et purifiés jusqu'à homogénéité et utilisés dans un complexe avec la protéine d’intérêt pour favoriser la cristallisation. Ce qui est important, des fragments Fab produites tel que décrit à l’article 10 peuvent ont tendance à former non-fonctionnel LC dimères86. Ces dimères sont des contaminants et devraient être supprimés au cours de la purification. Dans notre expérience, LC dimères souvent ont un volume de rétention différents sur l’exclusion de taille, ou éluer comme un pic distinct sur chromatographie échangeuse d’ions et donc peuvent être supprimés de la purification Fab - mais ce n’est pas toujours le cas. Si ces techniques ne suffisent pas à enlever les dimères de LC de la purification Fab, méthodes de purification supplémentaires, tels que de la purification d’affinité G protéines, peuvent être utilisées pour améliorer la pureté.
Alternative aux co-complexation avec les fragments Fab, techniques bien documentés comme matrice aléatoire microseeding peuvent améliorer ses chances d’obtenir des cristaux bien ordonnée63,70. Cette méthode implique l’addition de petites quantités de cristaux écrasé, sous-optimale dans la condition de la cristallisation, fournissant un cristal nuclée pour promouvoir la croissance des cristaux. Ceci peut être effectué à l’aide de cristaux de la protéine d’intérêt, ou ceux avec une structure similaire de domaine architecture et tertiaire. En outre, microseeding matrice aléatoire peut être effectuée pour tenter de cristalliser la protéine seule, ou en complexe avec un fragment Fab ou petite molécule d’intérêt. Les progrès récents en cryo-microscopie électronique aussi faire cette technique une alternative intéressante à la cristallographie par rayons x pour obtenir des informations structurales à haute résolution pour les molécules avec des caractéristiques appropriées87,88, 89,90,91.
Lorsque progressive des ensembles de données de diffraction des rayons x n’est pas par M., HA trempage peut être nécessaire pour résoudre le problème de la phase de dispersion anomale ou remplacement isomorphe. Inspection de la séquence d’acides aminés de la protéine peut fournir des indices sur la stratégie pour dérivatisation HA, y compris le pH optimum pour la liaison. En particulier, des cystéines non appariés au sein de la protéine peuvent lier spécifiquement HA composés contenant du mercure. Le trempage de cristaux natives avec HA composés est un processus itératif pour déterminer l’identité du composé HA optimale, sa concentration et le temps d’incubation nécessaire. Si les premières tentatives de trempage ne donnent pas de cristaux bien diffractants contenant un HA adapté pour l’élimination, il peut être nécessaire d’introduire des substitutions d’acides aminés pour améliorer la probabilité de liaison HA et signal anormal. Les exemples incluent des mutations pour inclure un résidu cystéine libre pour lier efficacement Hg, Au, Pt ou Pb. Expression de protéines pour élimination anormale dans un média séléno-méthionine complétée par e. coli est intensivement employé pour l’élimination anormale, cependant une un système équivalent qui intègre avec fiabilité séléno-méthionine n’est pas facilement disponible pour les cellules de mammifères en suspension92,93et est une zone de développement futur.
Une fois obtenue la structure aboutissent de la glycoprotéine d’intérêt, tremper les cristaux avec des ligands de petites molécules peut être effectuée pour obtenir une structure du complexe récepteur-ligand immunitaire. Ces données fournissent un modèle pour la conception rationnelle de plus spécifiques et de haute affinité des ligands qui peuvent servir de petit-molécule thérapeutique mais aussi permet de mieux comprendre la fonction biologique de la glycoprotéine haute résolution. Lorsque vous tentez de faire tremper les cristaux de glycoprotéine avec des ligands de petites molécules d’intérêt, inspection de la structure cristalline d’aboutissent peut indiquer si le trempage doit être possible. Si proches-l’entassement du cristal contacts se trouvent autour du site de liaison du ligand ou autour de régions devrait subir des modifications conformationnelles lors de la liaison ligands, trempage sera probablement être problématique. Dans ce cas, les autres méthodes telles que cocristallisation du complexe protéine-ligand doivent être effectuées.

Protéines de surface jouent un rôle crucial dans le fonctionnement cellulaire. Par le biais de leurs domaines extracellulaires, ces protéines membranaires peuvent moduler les interactions cellule-cellule, adhésion, transport et signalisation1,2. La localisation extracellulaire de ces protéines rend les cibles intéressantes pour le développement d’agents thérapeutiques pour le traitement d’un large éventail de maladies, notamment le cancer et les maladies auto-immunes3,4,5 , 6 , 7. les plis plus courantes de glycoprotéines de protéine de membrane humaine est le pli immunoglobuline-like (Ig), qui est formé de sept ou plusieurs β-brins disposés en deux β-feuilles8,9. En général, glycoprotéines contenant Ig sont des structures de multi-domaine avec domaines Ig disposés séquentiellement sur la portion extracellulaire de la protéine de membrane10. Les modifications post-traductionnelles de ces protéines de surface cellulaire, en particulier N - et O-liés glycosylation, ont démontré que jouent un rôle essentiel dans leur règlement, pliage, sécrétion et fonction11. Afin d’améliorer notre compréhension de leur fonction et à la meilleure thérapeutique de conception qui peut cibler leur, ne sont obligatoires qui permettent leur caractérisation moléculaire détaillée. Nous présentons ici une combinaison de techniques qui permettent la biophysique (biolayer interférométrie (BLI) et la calorimétrie isotherme titration (ITC)) et la caractérisation structurale (diffraction) du domaine extracellulaire Ig contenant du glycoprotéines membranaires, seuls et en complexe avec leurs ligands biologiquement pertinentes et les molécules thérapeutiques (Figure 1).
N-lié glycosylation est une des modifications après traduction plus courantes sur les protéines de mammifères et se produit au cours de la maturation de la protéine dans le réticulum endoplasmique et le Golgi12,13. Des lignées de cellules, telles que les 293 cellules rein embryonnaire humain (HEK), ont été développées pour l’expression recombinante de grandes quantités de glycosylée protéines de mammifères14,15. Cette lignée cellulaire a été développée sous forme de suspension qui permet pour la facilité d’intensification de la production de protéines de plus grandes quantités par rapport aux lignées de cellules adhérentes. Ici, nous utilisons deux lignées de cellules HEK293 : HEK293F et HEK293 Gnt j’ai- / - (HEK293S), qui se distinguent par l’absence de N-acétylglucosaminyl transférase I (Gnt je) dans le second. À son tour, production de glycanes complexes (comme on le voit dans HEK293F) n’est pas possible et mannose-type plutôt élevé glycanes (principalement Man5GlcNAc2) résident à glycan N-linked sites18,19,20 . À l’aide de ces deux lignées cellulaires en parallèle permet d’étudier l’effet de glycane de taille et de complexité sur la fonction biologique et ciblage thérapeutique. En effet, glycoprotéines produites dans les cellules de HEK293F aura des glycanes plus volumineux et plus complexes par rapport à la même glycoprotéine produite dans les cellules HEK293S. Glycoprotéines produites dans les cellules HEK293S sont plus propices à la cristallisation, en raison de l’hétérogénéité chimique et conformationnelle réduite de leur N-glycanes. Afin d’améliorer crystallizability, glycoprotéines produites dans les cellules HEK293S (mais pas HEK293F) peuvent être traitées avec l’enzyme endoglycosidase H (Endo H), qui se traduit par le clivage des glycanes riche en mannose tel que seul un unique N-acétylglucosamine (GlcNAc) portion reste à chaque site de glycosylation N-liés21,22. Autres méthodes permettent également de limiter le traitement N-glycanes dans les cellules, telles que l’ajout des inhibiteurs de la glycosyltransférase au cours de l’expression de glycoprotéine, y compris le caddie23. Approches alternatives impliquent l’expression des glycoprotéines natifs (dans les cellules HEK293F) suivi de déglycosylation enzymatique à l’aide de peptide N-glycosidase F (PNGaseF). Cependant, déglycosylation avec PNGaseF s’est avérée moins efficace dans des conditions natives et augmente l’agrégation dans certaines protéines ; dans le cas lorsque la protéine reste soluble après le traitement, il acquiert des charges négatives sur sa surface, en raison de la désamidation du résidu asparagine, acide aspartique24, qui pourrait être préjudiciable pour sa cristallisation. Sites de N-glycosylation prédites peuvent également être mutés, plus souvent à des résidus alanine ou la glutamine, pour empêcher la glycosylation N-liée à ces sites et de générer des échantillons de la glycoprotéine de grande homogénéité. Alternativement, les glycoprotéines peuvent être produites dans d’autres cultures de cellules eucaryotes, y compris les levures, insecte et systèmes de plantes ou autres lignées cellulaires de mammifères tels que les hamsters chinois ovarienne (CHO) cellules16,17.
De nombreux vecteurs d’expression chez les mammifères, y compris pHLsec, permettent la sécrétion des glycoprotéines recombinantes glycoprotéine dans la cellule moyenne25. Sécrétion de glycoprotéines de cellules HEK293 permet une purification rapide et facile sans besoin de lyse cellulaire. Ajout de balises de purification (par exemple, His-tag, Strep-tag, drapeau-tag, tag-Myc, HA-tag) jusqu’au terminus de N ou C de la cible glycoprotéine permet la purification par une chromatographie d’affinité de la seule étape. Par la suite, chromatographie d’exclusion peut être utilisée pour obtenir un échantillon de monodispersés pour la caractérisation biophysique et structurel.
Un échantillon de glycoprotéine très pure et homogène dans des conditions appropriées peut entraîner des cristaux bien diffractants. Une fois un ensemble de données complet de diffraction des rayons x a été obtenue de ces cristaux, phases initiales doivent être déterminé pour calculer la densité d’électrons de la glycoprotéine. Grâce à un nombre toujours croissant des structures dans la Banque de données de protéine (PDB), la méthode couramment utilisée pour l’élimination est devenue de loin de remplacement moléculaire (MR), qui utilise une structure protéique connexes pour obtenir des phases initiales de26. Toutefois, lorsque M. ne parvient pas à résoudre le problème de phase, comme ce fut parfois le cas pour multi-Ig domaine glycoprotéines27,28,29, méthodes alternatives sont nécessaires. Dans cet article, nous détaillons une méthode à tremper des cristaux avec des atomes lourds (HA) pour l’élimination, qui était nécessaire pour résoudre la structure du CD22 ectodomaine28. Identifier le droit HA pour l’élimination est un processus itératif qui dépend HA réactivité, atomes disponibles dans la glycoprotéine dans un réseau cristallin donné et la cristallisation solution30,31. Alternativement, les atomes de soufre naturel dans les résidus de cystéine et méthionine peuvent être utilisés pour progressive s’il est présent à un taux assez élevé d’autres atomes dans la glycoprotéine, et si les données de la diffraction des rayons x peuvent être collectées avec redondance assez élevé32, 33.
La fonction biologique des glycoprotéines membranaires est souvent véhiculée par les interactions protéine-protéine ou des interactions de protéine-ligand, comme contenant des glucides. Quand le ligand est assez petit pour diffuser de la solution vers le site de liaison de glycoprotéine dans le réseau cristallin, trempage des expériences peut réussir à obtenir une structure en cristal co glycoprotéine-ligand pour mieux comprendre la reconnaissance ligand.
Les protocoles présentés ici sont également pertinentes pour comprendre les interactions des glycoprotéines de surface avec des ligands thérapeutiques synthétiques34,35 et anticorps thérapeutique36,37. Lorsqu’il est combiné avec l’information structurale, cinétique et thermodynamique contraignants peuvent être puissants pour comprendre et améliorer leurs mécanismes d’action. Une technique qui permet l’analyse cinétique des anticorps thérapeutiques liant à une glycoprotéine est BLI38,,39. BLI utilise des biocapteurs avec un ligand immobilisé pour mesurer la cinétique association et dissociation avec un partenaire de liaison, déterminant en fin de compte une constante de dissociation de l’équilibre (KD). BLI est une approche intéressante car de petites quantités de glycoprotéines sont requises (< 100µg), temps d’expérience est rapide (~ 10-15 min par course), et il peut être automatisé. ITC est également utile pour l’étude des affinités entre les glycoprotéines et liaison partenaires40,41,42,43. ITC est plus de temps et de réactif intensive, des renseignements précieux peuvent être obtenus au sujet de la thermodynamique de l’interaction (ΔG, ΔH, ΔS et stoechiométrie). ITC est également très utile pour l’étude des interactions faibles qui sont souvent associées à la liaison passagère des glycoprotéines de surface aux ligands. En outre, ces techniques peuvent servir en même temps à la liaison de diverses constructions et d’évaluer l’effet de différents N-liés glycoformes obtenues d’exprimer la glycoprotéine dans différentes lignées cellulaires. Produisant de BLI et ITC avec glycoprotéines produites dans HEK293F, HEK293S et traités avec Endo H peut fournir une vision approfondie du rôle des glycanes dans l’activité biologique et engagement thérapeutique.
Nous avons appliqué avec succès ces protocoles pour caractériser le domaine extracellulaire (DPE) humaine CD22 contre28, un membre de la glycoprotéine de la famille des lectines (Siglecs) acide sialique liant Ig-like qui est essentielle au maintien de l’homéostasie de B-cellule44 . Nous avons effectué conception construction approfondie pour faciliter la cristallisation et progressivement le dataset des rayons x par HA trempage avec Hg. Nous avons aussi trempé CD22 cristaux avec son ligand l’acide sialique (α2-6 sialyllactose) pour obtenir une structure du complexe récepteur-ligand immunitaire et donc fourni les plans pour la conception de structure guidée de glycane mimétiques45,46. En outre, nous avons généré la liaison de l’antigène de fragment (Fab) de l’epratuzumab d’anticorps thérapeutiques anti-CD22 - un candidat actuellement en essais cliniques de phase III de lymphome non hodgkinien47- afin de déterminer son affinité par BLI et ITC à différentiellement glycosylée CD22 DPE construit. Ces études ont révélé un rôle essentiel pour la glycosylation N-liés dans epratuzumab engagement, avec des implications potentielles pour CD22 reconnaissance sur les cellules B dysfonctionnels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Glycoprotéines sur la surface des cellules jouent un rôle crucial dans le fonctionnement cellulaire, y compris la signalisation, l’adhérence et le transport. Sur les leucocytes, plusieurs de ces glycoprotéines possèdent des plis de l’immunoglobuline (Ig) et sont au cœur de la réglementation et de reconnaissance immunitaire. Nous présentons ici, une plate-forme pour la conception, l’expression et la caractérisation biophysique du domaine extracellulaire du récepteur des cellules B humaines CD22. Nous proposons que ces approches sont largement applicables à la caractérisation des mammifères glycoprotéine glycoprotéines contenant les domaines de l’Ig. Deux suspension rein embryonnaire humain (HEK) lignées cellulaires, HEK293F et HEK293S, servent à exprimer des glycoprotéines abriter des glycans complexes et riches en mannose, respectivement. Ces glycoprotéines recombinantes avec différentes glycoformes permettent sur les effets de glycane taille et composition sur la liaison du ligand. Nous discutons des protocoles pour l’étude de la cinétique et thermodynamique de la liaison de la glycoprotéine à ligands biologiquement pertinentes et candidats d’anticorps thérapeutiques. Glycoprotéines recombinantes produites dans les cellules HEK293S sont prêtent à la cristallisation en raison de la homogénéité de glycan, flexibilité réduite et la susceptibilité au traitement endoglycosidase H. Nous présentons des méthodes pour le trempage des cristaux de glycoprotéine avec des atomes lourds et petites molécules pour la détermination de la phase et l’analyse de liaison du ligand, respectivement. Les protocoles expérimentaux discutées ici sont prometteurs pour la caractérisation des glycoprotéines mammifères à donner un aperçu de leur fonction et d’étudier le mécanisme d’action de la thérapeutique.

Plusieurs constructions de CD22 DPE ont satisfait clonées dans le vecteur d’expression pHLsec et surexprimés dans mammifères HEK293F et HEK293S lignées de cellules (Figure 2 et 3 a). Toutes les constructions ont été purifiées jusqu'à homogénéité de taille par chromatographie d’exclusion et a donné un échantillon très pur pour les études de cristallisation (Figure 3 b et 3C). La construction de CD22 qui a mené à bien diffractants cristaux était la troncature de d1-d3 (résidus 20-330), avec cinq des six sites prédit N lié glycosylation mutés de Asn à Ala (N67A, N112A, N135A, N164A et N231A), produite dans les cellules HEK293S, tels que seul le site de glycosylation postées sur N101 a été retenu (cette construction se nomme CD2220-330, 5 a). Cristaux ont été obtenus dans plusieurs conditions de l’écran de matrices creuses MCSG-1, mais les meilleurs cristaux proviennent d’un état contenant 30 % (p/v) de polyéthylène glycol 4000, chlorure de lithium de 0,2 M et 0,1 M Tris, pH 8,5. Ces cristaux native diffractés à 2.1 résolution Å ; à l’aide de structures connues de domaines connexes Siglec protéines Ig n’a donné aucune solution dans les recherches de Monsieur.
Pour obtenir des informations "phasage", nous imbibé natives cristaux avec un panel de HA composés comprenant Hg, Pt, Os, Ta et Br à des concentrations allant de 1 à 20 mM de HA composé pour une durée d’incubation de 5 min à 1 d (Figure 4). Nous avons surveillé les cristaux pour les changements dans la morphologie et constaté que les cristaux imbibé HA composé de 20 mM a entraîné la fissuration rapide et la dissolution du cristal. Nous avons gelé un total de 63 cristaux qui ont conservé leur forme après des temps de jeu d’incubation qui ont été imbibés de cluster de tantale bromure, le chlorure de platine, acétate mercurique et chlorure mercurique. Cristaux imbibé de 7 mM de chlorure mercurique pour 30 min signal anormal ne présentaient un scan de fluorescence à la Canadian Light Source (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) et a permis à dispersion anomale multi-longueur d’onde collecte de données de rayons x sur un seul Crystal. Ces ensembles de données nous a permis de résoudre la sous-structure de mercure de CD2220-330, 5 a, qui a révélé un atome de mercure unique lié à une cystéine libre en position C308 et finalement nous a permis de construire la structure du CD225 a 20-330, dans la progressive carte de densité des électrons à l’aide de AutoBuild78.
Une fois qu’on a résolu la structure d’aboutissent, nous étions intéressés à résoudre la structure du CD22 lié à son ligand, α2-6 siallylactose. Tout d’abord, nous avons calculé l’affinité de CD22 vers sialyllactose α2-6 à l’aide de ITC pour caractériser la thermodynamique de liaison de l’interaction. Nous avons observé une affinité de ~ 280 µM et utilisé ces informations pour identifier une concentration initiale (~ 100 x KD) du ligand à utiliser pour le trempage de nos cristaux de20-330, 5 a CD22 native. Nous tremper les cristaux de CD2220-330, 5 a avec siallylactose de 25 mM pour 5 min, 2 h, 14 h, 40 h et 5D et suivi des changements dans la morphologie des cristaux. Un total de 75 ~ cristaux ont été gelé de divers points dans le temps et envoyés à la CLS synchrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Canada) pour la collecte de données à distance. Un total de six ensembles de données de rayons x ont été prélevés de cristaux bien diffractants. La structure de chaque jeu de données de rayons x a été résolue par M. utilisant l’aboutissent CD2220-330, 5 a la structure comme un modèle de recherche initiale. La densité d’électrons qui en résulte pour tous les ensembles de données a été ensuite inspectée pour densité positive dans la carte Fo-Fc qui correspondrait pour consolidé sialyllactose α2-6 dans le site de liaison du CD22. Fait remarquable, tous les ensembles de données recueillies, même ceux de cristaux trempés après seulement 5 min de temps d’incubation, contenue densité positive correspondant au ligand dans le site de liaison. Les structures globales de l’aboutissent et CD22 liés ont été très similaires avec des changements conformationnels minimales, ce qui pourraient expliquer le succès de trempage expérimente le sialyllactose α2-6.
Ensuite, nous avons caractérisé la surface antigénique du CD22 reconnus par des anticorps thérapeutiques epratuzumab dans les expériences de BLI et le CCI (Figure 5). Thermodynamique et cinétique des profils de liaison Fab epratuzumab pour des constructions de CD22 avec différent glycoformes a révélé une affinité croissante à CD22 avec taille réduite glycane N-liés, avec jusqu'à 14 fois en affinité pour les plus petits glycanes (327 nM vs 24 nM dans BLI ; 188 nM nM de vs 58 au CCI). Le CD22 N-liés glycane limitant l’accès de l’anticorps à l’épitope a été identifié par BLI utilisant monopoint mutants de CD22 et en résolvant l’epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co crystal structure28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figure 1 . Vue d’ensemble de caractérisation de la glycoprotéine de la conception de la construction de caractérisation biophysique et structurelle. (1) analyse de la séquence primaire de glycoprotéine représentatif. En gris, le domaine extracellulaire (DCE) ; en vert, le segment transmembranaire de (TM) ; et en bleu, le domaine cytosolique de la glycoprotéine. Prédites N-glycanes sont étiquetés. (2) de clonage de constructions de DPE. (3) expression de DPE construit en cellules mammifères. (4) purification de glycoprotéine. Tandis que les protéines exprimées en HEK293F contiendra glycans complexes, protéines exprimées en HEK293S aura riche en mannose glycanes. Le traitement enzymatique des glycoprotéines produites dans les cellules HEK293S Endo H résultats chez glycoprotéines avec seulement une portion GlcNAc aux sites de glycosylation N-liés. glycoprotéines (5 a) sont testés pour leur liaison aux anticorps par interférométrie biolayer (BLI) et calorimétrie isotherme titration (ITC). Affinité pour les ligands petits peut également être mesurée par CCI. (5 b) les essais de cristallisation des glycoprotéines avec homogène N-glycanes, tels que ceux exprimés en HEK293S et déglycosylée avec Endo H. (6) dans certains cas, mutation des sites de glycosylation N-liés est nécessaire pour obtenir des cristaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figure 2 . Conception de CD22 ectodomaine ADN construit pour l’expression en cellules mammifères. A) représentation du plasmide pHLsec utilisé pour la transfection transitoire de CD22 DPE constructions. AgeI et KpnI sites utilisés pour le clonage sont indiquées par des cases rouges. B) The CD22 DPE contient sept domaines Ig (d1-d7) et 12 sites de glycosylation de N-liés prédites (en bleu). Quatre concepts ont été conçus dès le DPE CD22. C) gel d’agarose à 1 % montrant amplimères PCR du CD22 DJE construit pour le clonage dans le vecteur d’expression chez les mammifères pHLsec. Première voie contient le marqueur d’ADN 1 Ko. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figure 3 . Expression et purification des glycoprotéines. A) effet de la densité des cellules sur les rendements de l’expression. Expression de la glycoprotéine dans la culture à petite échelle 25 mL de HEK293F suspension de cellules transfectées à l’aide de trois densités différentes de départ des cellules (0,5 x 106 cellules mL-1, 1,0 x 106 cellules mL-1et 1. 5 x 106 cellules mL -1). Quantification réalisée par densitométrie de SDS-PAGE dans le panneau de gauche et par BLI quantitative dans le panneau de droite. Valeurs sont représentatives d’une préparation de glycoprotéine. B) chromatogramme de la première étape de purification pour construire CD2220-330, 5 a de 600 mL du surnageant à l’aide d’une colonne d’affinité Ni-NTA. La glycoprotéine a été éluée utilisant un gradient de l’imidazole (ligne grise), où 100 % correspond à la mémoire tampon d’élution, qui contient l’imidazole de 500 mM. Mise en commun des fractions sont dépeints avec des lignes verticales. C) chromatogramme d’exclusion stérique pour construire CD2220-330, 5 a , à l’aide d’une haute performance gel colonne de filtration. Mise en commun des fractions après avoir culminé à élution sont dépeints avec des lignes verticales. En médaillon : Gel de coloration au bleu de Coomassie SDS-PAGE montrant la pureté de la glycoprotéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figure 4 . Cristal de trempage en atomes lourds. A) station de travail échantillon pour le trempage des cristaux natives avec HA composés. Tous les requis outils sont étiquetés. B) les étapes suivies pour tremper les cristaux de construire CD2220-330, 5 a avec HA composés. Étape 1, ouvrez cupule contenant des cristaux et des cristaux de transfert en utilisant une boucle à une baisse de 0.2 µL sur une lamelle couvre-objet contenant HA solution diluée dans la condition de la cristallisation, telle que la concentration finale de HA varie de 1 à 10 mM. Étape 2, scelle la chute de la plaque de cristallisation et incuber les cristaux avec le HA composé pour différentes périodes de temps. Étape 3, monter le cristal trempé dans la boucle et le dos-laisser tremper pendant 30 s dans trois baisses consécutives de µl 0,2 contenant la solution de liqueur mère additionnée de 20 % (v/v) de glycérol distribué sur une lamelle couvre-objet. Étape 4, flash geler le cristal monté sur une boucle à l’azote liquide et placez-le dans une rondelle pour envoi à la source de rayonnement synchrotron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figure 5 . Biolayer, mesures de calorimétrie titration interférométrie et isotherme. A) expérience représentant BLI. Panneau supérieur : exemple de plaque de montage pour une expérience de cinétique, où ce qui suit est étiqueté de : 1 cinétique x buffer (B), sonx 6-glycoprotéine tagged chargement (L), les concentrations de Fab représentatives (62,5, 125, 250, 500 nM), PBS + régénération de 500 mM tampon (R) et 1 x neutralisation cinétique tampon (B). Eh bien, chacun contient 200 µL de solution. Numéro de l’étape pour l’expérience cinétique est indiqué en haut de la plaque. Panneau milieu : Données brutes représentante d’expérience BLI effectuée à l’aide de biocapteurs Ni-NTA et la plaque dans le panneau supérieur. Étape numéros correspondent à la base (1), ses6 x glycoprotéine chargement (2), référence (3), association en dilution en série de Fab (4) et la dissociation (5). Étapes de la régénération ne sont pas représentés (étapes 6 et 7). Panneau inférieur : Représentatifs ont analysé les données liste brute association et dissociation (ligne bleue) avec le correspondant 1:1 monter (ligne rouge). B) panneau supérieur : installation de plaque représentant une seule CCI se faire sur un instrument automatisé de ITC avec sept expériences dans un 96 puits rond moufle. Chaque expérience est composé de trois puits. Le premier puits (rouge) correspond à l’échantillon pour la cellule (400 µL), le deuxième puits (vert) d’échantillon pour la seringue (120 µL). Le troisième bien est laissé vide, et les échantillons mixtes seront retournés à ceci bien après l’achèvement de l’expérience. Expériences de 1, 2 et 7 sont tampon dans des contrôles de la mémoire tampon. Expériences de 3-5 représentent en triple expérimente la glycoprotéine (P) dans la cellule et la Fab ou le ligand (L) dans la seringue. Expérience 6 représente une chaleur de ligand du contrôle de la dilution et devrait être soustrait du 3-5 des expériences au cours de l’analyse des données. Panneau inférieur : Représentant brut (en haut) et transformés (en bas) CCI données montrant Fab (epratuzumab) liant à CD22 DPE produites dans les cellules HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Nous présentons des approches pour la caractérisation biophysique et structurelle des glycoprotéines avec le pli de l’immunoglobuline par interférométrie biolayer, calorimétrie isotherme de titration et cristallographie aux rayons x.

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

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