Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

קרני רנטגן הניסויים המתוארים במאמר זה בוצעו באמצעות beamlines 08-ID ו- 08-מוניטור במקור אור קנדי, אשר נתמך על ידי קרן קנדה חדשנות, מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה, האוניברסיטה של ססקצ'ואן, הממשלה של ססקצ'ואן, גיוון כלכלי במערב קנדה, קנדה המועצה הלאומית למחקר של מכוני הקנדית לחקר בריאות. אנחנו רוצים להכיר את מבנה & מתקן הליבה Biophysical, בית חולים לילדים חולים, עבור גישה אל כלי הנגינה ITC, רבנות בלי. J.E.O. נתמך על ידי בנטינג פוסט-דוקטורט במלגת BPF-144483 מן המכון הקנדי של בריאות המחקר. ט. ס הוא הנמען של קנדה בוגר מלגת תואר פרס ואת וניהר קנדה במלגה ללימודי תואר שני מהמכון הקנדי של בריאות המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי הפועלים מענק PJT-148811 (ג'-P.J.) מכונים הקנדי למחקר בריאות. מחקר זה נערך, בין השאר, הודות למימון התוכנית קנדה מחקר כיסאות (ג'יי-פי).

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.

ממברנה-מעוגן glycoproteins קריטי לתפקוד התא והם אטרקטיביים מטרות טיפוליות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור אפיון מבניים biophysical ECD של הממברנה glycoproteins, גם לבד וגם במתחם עם מולקולה קטנה ליגנדים, Fab שברים. אנחנו משתמשים בהצלחה פרוטוקול זה לקבוע את מבנה הגביש של שלושת תחומי Ig N-מסוף-רוב החלק חוץ-תאי של האדם CD2228, קולטן שותף קריטי בתאי B, מעורב בשמירה humoral חסינות הסימון79. יש גם מאופיין אתר איגוד של CD22 עם sialyllactose α2-6 שלה ליגנד טבעי, ואנו מוגדרת במצב של הכרה נוגדן טיפולית כלפי האדם CD22. תוצאות אלו לספק תובנות הגומלין מבנה פונקציה של חבר מפתח של משפחת Siglecs בעל מוגבלת ביטוי בתאי B, ואת מפת דרכים מולקולרי לקראת הפיתוח של מולקולה חדשה CD22 יישוב קטן, מבוסס על נוגדן הרפוי. בעוד פרוטוקול זה שימש בהצלחה קולטן תא B המכילות איג, אנו מציעים כי הגישה שלנו יכול להיות מיושם עבור biophysical מבניים אפיון כל גליקופרוטאין קרום עם ארגון תחומים ברורים. במקרים כאלה, לבנות עיצוב, glycan N-מקושרים קומבינטורית מוטציות (גם זאת שוב או Ala) ניתן להעריך למצוא מבנה מתאים הצמיחה קריסטל, עקיפה ברזולוציה גבוהה.
קבלת מדגם הומוגני וטהור גליקופרוטאין יש חשיבות קריטית קרני רנטגן וצמיחה של קריסטל, כמו גם עבור אפיון biophysical במורד הזרם. מקושרים-N glycans המצויים על glycoproteins הם מטבעם הטרוגנית, והוא יכול לגרום הטרוגניות הסתגלותי וכימיים בתוך גליקופרוטאין גורם התרעה מפני היווצרות הגביש. כדי לצמצם את זה המיקרו-הטרוגניות, אסטרטגיות להציג מוטציות נקודה כדי להסיר שאריות Asn חזו את הנמל glycans מקושרים-N, או באמצעות שורות תאים מוטציה (כגון HEK293S) ואחריו טיפול עם endoglycosidases (כגון EndoH) יכול במידה ניכרת לשפר את התגבשות הצלחה15,21,22. ב פרוטוקול זה, נדון הטיהור של glycoproteins מסיסים, פאבס המופרשים לתוך התא supernatant. הפרשת גליקופרוטאין מספק דרך פשוטה יחסית לכיוון טוהר, ללא הצורך פירוק התא או התוספת של כימיקלים קשים או בדטרגנטים. לאחר מכן להפעיל את התא supernatant, שהושג הבאים קציר תאים ישירות על עמודה בעלת זיקה חזקה החלבון עניין (למשל, Ni-נ שלו מתויג glycoproteins, או LC אהדה שברי Fab). עם זאת, בהתאם העמודה השימוש ואת התנאים של התא supernatant (למשל, pH), היכולת מחייב של החלבון לעניין העמודה עשויה להיות מושפעת. אם זה המצב, ייתכן צורך להתרכז, מאגר exchange התא supernatant כדי לשפר את איגוד לעמודה. יתר על כן, מומלץ מאוד כי צעדים בקרת איכות במהלך טיהור להיות מועסק כדי לסייע להעריך חלבון טוהר. פועל למען חברה דמוקרטית-דף ג'ל או תספיג של כל הדגימות (לפני, במהלך ואחרי טיהור צעדים) של יכולות להניב תובנות אם ערכת טיהור המוצע מתאים החלבון עניין. אם להקות מזהמים גלויים בדף-מרחביות, או אם מספר מינים מתקבלים במהלך טיהור (למשל, מספר פסגות על גודל הדרה), שלבי טיהור נוסף צריך להיחשב, למשל, יונים כרומטוגרפיה, כדי לזכות בטוהר, ולהגביר את סיכויי התגבשות במורד הזרם80.
על התגבשות macromolecular, לעתים קרובות קריטי להשגת תשואות גבוהות של החלבון עניין כדי לאפשר להקרנה של מספר רב של מצבים פוטנציאליים התגבשות בריכוזים חלבון גבוהה למצוא להיטים קריסטל מתאימים. באופן כללי, HEK293 תא הקווים שנדונו כאן (HEK293F ו- HEK293S) הן מערכות ביטוי חזקים, ניתן בקלות לשנות לייצר יותר מדגם לפי הצורך. עם זאת, ייתכן כי החלבון עניין עשוי לא לבטא מספיק בתוך שורות תאים אלה. במקרים אלה, שורות תאים אחרים, כגון תאים Expi29381,82, נמצאו כדי להציג רמות גבוהות של חלבון ביטוי ויש להתייחס כחלופה.
אם לא מסודר, diffracting קריסטלים בעקבות בדיקה של מספר מבנים של החלבון עניין למרות טוהר גבוהה, ייתכן צורך להרחיב התגבשות טכניקות כדי לקדם היווצרות הגביש. הוכח כי-Fab שברי נוגדנים, nanobodies יכול להיות משפרי התגבשות מעולה, לקדם את קריסטל ומסודרת אריזה83,84,85. קטעים אלה יכולים להיות הביע לטהר את ההומוגניות ו בשימוש מתחם עם החלבון עניין לקדם את התגבשות. חשוב, שברי Fab המיוצר כמתואר בסעיף 10 יכול להיות נטייה ליצור LC פונקציונלי הדימרים86. הדימרים הללו מזהמים, צריך להסירו במהלך טיהור. מניסיוננו, LC הדימרים לעיתים קרובות יש אמצעי אחסון שונים שמירה על גודל הדרה, או elute כמו לשיא ברורים על יונים כרומטוגרפיה, ובכך ניתן להסיר את טיהור Fab - אולם זה לא תמיד המקרה. אם שיטות אלה אינן מספיקות להסיר LC הדימרים הטיהור Fab, שיטות טיהור נוספים, כגון חלבון G זיקה טיהור, יכול להיות מועסק כדי לשפר את טוהר.
אלטרנטיבה co-complexation עם שברי Fab, טכניקות מתועדת היטב כגון microseeding מטריצה אקראית יכול לשפר את הסיכויים להשגת גבישי מסודר63,70. שיטה זו כרוכה התוספת של כמויות קטנות של גבישים כתוש, שיוצרת לתוך המצב התגבשות, מתן גביש nucleate כדי לקדם את הצמיחה קריסטל. זה יכול להתבצע באמצעות גבישים של החלבון מעניינים, או אלו עם מבנה שלישון ואדריכלות תחום דומה. יתר על כן, ניתן לבצע microseeding מטריצה אקראית בניסיונות להתגבש החלבון לבד, או במתחם עם מקטע Fab או מולקולה קטנה של עניין. התפתחויות אחרונות הקפאה-מיקרוסקופ גם לבצע טכניקה זו חלופה אטרקטיבית קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן להשגת המידע המבני ברזולוציה גבוהה עבור מולקולות עם תכונות מתאימות87,88, 89,90,91.
כאשר בהדרגה של קרני רנטגן datasets נכשלת מאת MR HA השריית עשוי להיות נחוץ כדי לפתור את בעיית שלב על ידי פיזור חריגה או החלפת isomorphous. בדיקה של רצף חומצות אמיניות של החלבון יכול לספק רמזים על האסטרטגיה עבור derivatization HA, כולל ה-pH האופטימלי עבור איגוד. בפרט, cysteines אינטראקצית בתוך החלבון במיוחד באפשרותך לאגוד HA תרכובות המכילות כספית. השריית קריסטלים מקורית עם תרכובות HA היא תהליך איטרטיבי כדי לקבוע את זהותו של המתחם HA אופטימלית, הריכוז שלו, זמן הדגירה הנדרש. אם נסיונות השריית הראשונית לא תשואה היטב diffracting גבישים המכילים של HA מתאים בהדרגה, ייתכן שצריך להציג החלפות חומצת אמינו כדי לשפר את ההסתברות של איגוד HA ולשפר את אות חריג. דוגמאות מוטציות לכלול משקע ציסטאין חינם להיקשר ביעילות Hg, Au, Pt או חמאת בוטנים. ביטוי של חלבונים עבור דיממו חריגה בתקשורת seleno-מתיונין בתוספת ב e. coli משמש בהרחבה עבור חריגה בהדרגה, עם זאת מערכת מקבילה המשלבת באופן אמין seleno-מתיונין אינה זמינה עבור תאים בתרבית של הבולם92,93, הוא אזור ההתפתחות בעתיד.
ברגע המבנה unliganded של גליקופרוטאין עניין מתקבל, לספוג את הקריסטלים עם מולקולה קטנה ליגנדים ניתן לבצע כדי לקבל מבנה של המתחם קולטן המערכת החיסונית-ליגנד. נתונים אלה מספקים תוכנית העיצוב רציונלית של ליגנדים יותר ספציפיים, זיקה גבוהה יכול לשמש הרפוי מולקולה קטנה, כמו גם מספק תובנות ברזולוציה גבוהה תפקוד ביולוגי גליקופרוטאין. כאשר מנסים להשרות גליקופרוטאין קריסטלים עם מולקולה קטנה ליגנדים עניין, בדיקה של המבנה קריסטל unliganded יכול לציין אם השריית צריך להיות אפשרי. אם קרוב קריסטל-אריזה אנשי קשר נמצאים סביב האתר ליגנד מחייב או סביב אזורים צפוי לעבור שינויים הסתגלותי על ליגנד מחייב, השריית צפויה להיות בעייתי. במקרה זה, צריכה להתבצע בשיטות אחרות כגון שיתוף התגבשות של המתחם חלבון-ליגנד.

פני שטח חלבונים לשחק תפקידים חיוניים תפקוד התאים. דרך חזקותיה חוץ-תאית, חלבונים אלה קרום יכול לווסת תא-תא אינטראקציות, הדבקות, תחבורה, איתות1,2. לוקליזציה חוץ-תאי של חלבונים אלה גורם להם יעדים אטרקטיביים לפיתוח הרפוי לטיפול במגוון רחב של מחלות, כולל סרטן, מחלות אוטואימוניות3,4,5 , 6 , 7. אחד קפלי ממברנה האנושי חלבון ectodomains הנפוץ ביותר הוא הקיפול (Ig) דמוי נוגדן, אשר נוצרת על ידי שבעה או יותר β-גדילי המסודרות שני גליונות β8,9. לרוב, glycoproteins איג המכילים הן מרובות מבנים עם תחומים Ig מסודרים ברצף על החלק חוץ-תאי של חלבון ממברנה10. שינויים post-translational של חלבונים תא-פני אלה, במיוחד N-O-מקושרים גליקוזילציה, הוכחו ממלאים תפקידים חיוניים בתקנה שלהם, קיפול, הפרשת ו פונקציה11. כדי לשפר את ההבנה שלנו של הפונקציה שלהם וכדי הרפוי עיצוב טוב יותר שיכולות היעד אותם, נדרשות טכניקות המאפשרות אפיון מולקולרי מפורט שלהם. כאן, אנו מציגים שילוב של טכניקות לאפשר הביו-פיסיקלי (biolayer אינטרפרומטריה (בלי) ו calorimetry איזותרמי טיטור (ITC)) ואפיון מבנה (קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן) של התחום חוץ-תאי של המכילות איג קרום glycoproteins, לבד, במתחם עם ליגנדים ביולוגית רלוונטית שלהם הטיפוליות מולקולות (איור 1).
גליקוזילציה מקושרים-N הוא אחד השינויים שלאחר התרגום הנפוץ ביותר על יונקים חלבונים, מתרחשת במהלך ההבשלה חלבון בתוך רשתית תוך-פלזמית גולג'י12,13. שורות תאים, כגון תאים כליה אנושית עובריים (HEK) 293, פותחו עבור הביטוי רקומביננטי של כמויות גדולות של glycosylated בתרבית של חלבונים14,15. שורת תאים זו פותחה בתבנית ההשעיה, אשר מאפשר כדי להקל על שינוי קנה מידה את ייצור החלבון כדי כמויות גדולות יותר בהשוואה שורות תאים חסיד. כאן, אנו מנצלים את שתי שורות תאים HEK293: HEK293F, HEK293 אנשים אני- / - (HEK293S), להיות שונה בגלל היעדר N-acetylglucosaminyl טרנספראז (אנשים אני) בחודש האחרון. בתורו, הייצור של glycans מורכבים (כמו ב HEK293F) אינה אפשרית, glycans מסוג מנוז במקום גבוה (בעיקר אדם5GlcNAc2) שוכנים ב N-מקושרים glycan אתרים18,19,20 . באמצעות קווים אלה שני תאים במקביל מאפשרת ללמוד את ההשפעה של glycan גודלו ומורכבותו על תפקוד ביולוגי והיעדים טיפולית. אכן, glycoproteins המיוצר בתאי HEK293F יהיה glycans גדול יותר, מורכבים יותר בהשוואה את אותו גליקופרוטאין המיוצר בתאים HEK293S. Glycoproteins מיוצר בתאים HEK293S הם יותר בעניין. התגבשות, בשל הטרוגניות הסתגלותי כימיכאלים מופחתת של שלהם glycans מקושרים-N. לשפר עוד יותר crystallizability, glycoproteins המיוצר בתאי HEK293S (אך לא HEK293F) יכולים להיות מטופלים עם endoglycosidase האנזים H (אנדו H), אשר התוצאות המחשוף של glycans מנוז גבוה כזה רק יחיד N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety נשאר כל21,אתר מקושרים-N גליקוזילציה22. שיטות אחרות יכול לשמש גם כדי להגביל את N-glycan עיבוד בתוך התאים, כגון התוספת של מעכבי glycosyltransferase במהלך הביטוי גליקופרוטאין, kifunensine23. גישות אלטרנטיביות לערב את הביטוי של glycoproteins מקורי (בתאים HEK293F) ואחריו deglycosylation אנזימטי באמצעות פפטיד F N-glycosidase (PNGaseF). עם זאת, deglycosylation עם PNGaseF הוכח להיות יעיל פחות תחת תנאים מקומיים, מגדילה מצבור בחלבונים מסוימים; במקרים כאשר החלבון נשאר מסיס לאחר הטיפול, שהוא רוכש מטענים שליליים על פני השטח שלו עקב deamidation של השאריות אספרגין כדי חומצה אספרטית24, אשר עשוי להיות מזיקות עבור להתגבשותו. אתרים N-גליקוזילציה החזוי יכול גם להיות מוטציה, לרוב כדי שאריות אלנין או גלוטמין, כדי למנוע מקושרים-N גליקוזילציה באתרים אלה וכדי ליצור גליקופרוטאין דגימות של הומוגניות גבוהה. לחלופין, glycoproteins יכול להיות מיוצר, בתרבויות אחרות התאים האיקריוטים כולל שמרים, חרק, מערכות מפעל או קווים בתרבית של תאים אחרים כגון אוגר סיני השחלות (CHO) תאים16,17.
וקטורים ביטוי יונקים רבים, כולל pHLsec, מאפשרים הפרשת ectodomains גליקופרוטאין רקומביננטי לתוך תא בינוני25. הפרשת glycoproteins מתאי HEK293 מאפשר טיהור מהירה וקלה ללא צורך פירוק התא. תוספת של טיהור תגיות (למשל, לו תג, תג דלקת, דגל-תג, תג Myc, HA-תג) כדי הסופית N או C של המטרה גליקופרוטאין מאפשר טיהור באמצעות כרומטוגרפיית צעד אחר צעד. לאחר מכן, ניתן להשתמש בגודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה להניב מדגם monodisperse עבור אפיון biophysical ומבניים.
מדגם גליקופרוטאין וטהור מאוד הומוגנית תחת תנאים מתאימים עלולים לגרום גבישים diffracting היטב. לאחר dataset מלא עקיפה של קרני רנטגן התקבל מקריסטלים כזה, שלבים הראשונית צורך להיקבע לחישוב צפיפות אלקטרונים גליקופרוטאין. בזכות מספר גדל והולך של מבני נתונים הבנק חלבון (PDB), השיטה הנפוצה ביותר עבור בהדרגה הפך עד כה החלפת מולקולרית (MR), אשר משתמשת מבנה החלבון קשורים כדי לקבל שלבים הראשונית26. עם זאת, כאשר מר מצליח לפתור את בעיית הפאזה, לעתים כבר כתב הגנה רב-Ig תחום glycoproteins27,28,29, נדרשות שיטות אלטרנטיביות. במאמר זה, אנו מפרטים שיטה כדי להשרות קריסטלים עם אטומים כבדים (HA) בהדרגה, אשר נדרש עבור מבנה ectodomain CD2228. זיהוי הזכות HA עבור בהדרגה היא תהליך איטרטיבי התלוי תגובתיות HA, זמין האטומים גליקופרוטאין סריג הגביש נתון, התגבשות פתרון30,31. לחלופין, ניתן להשתמש אטומי גופרית טבעית שאריות ציסטאין ומתיונין עבור בהדרגה אם נוכח בבית יחס גבוה מספיק כדי אטומים אחרים גליקופרוטאין, ואם ניתן לאסוף נתונים קרני רנטגן עם יתירות מספיק גבוה32, 33.
תפקוד glycoproteins ממברנה ביולוגית לעיתים קרובות מתווך על ידי אינטראקציות חלבון-חלבון או אינטראקציות חלבון-ליגנד, כמו למשל עם פחמימות. כאשר ליגנד הוא קטן מספיק כדי לפזר מהפתרון לאתר איגוד גליקופרוטאין סריג הגביש, לספוג את הניסויים יכול להיות מוצלח כדי לקבל מבנה הגביש שיתוף גליקופרוטאין-ליגנד להבין טוב יותר את זיהוי ליגנד.
הפרוטוקולים המובאים כאן הם גם רלוונטי להבנת פעולת הגומלין בין משטח glycoproteins עם ליגנדים טיפולית סינתטי34,35 ו נוגדן הרפוי36,37. בשילוב עם מידע מבניים, איגוד קינטיקה ו תרמודינמיקה יכול להיות חזק כדי להבין ולשפר את מנגנון פעולה. טכניקה אחת המאפשרת לניתוח קינטי של נוגדנים טיפולית איגוד גליקופרוטאין הוא38,מתה על39. מתה על משתמש ביולוגיים עם ליגנד קיבוע כדי למדוד את קינטיקה דיסוציאציה וארגון עם שותף מחייב, קביעת בסופו של דבר קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל (דK). מתה על היא גישה אטרקטיבית בגלל כמויות קטנות של glycoproteins נדרשים (< 100 µg), זמן הניסוי הוא מהיר (~ 10-15 דקות לכל הפעלה), ואת זה יכול להיות אוטומטי. ITC שימושי גם לימוד הזיקות בין glycoproteins לבין האיגוד שותפים40,41,42,43. בעוד ITC יותר זמן, ריאגנט אינטנסיבית, ניתן לקבל מידע רב ערך לגבי התרמודינמיקה של האינטראקציה (ΔG, ΔH, ΔS וסטויכיומטריה). המרכז לטניס בישראל הוא גם מאוד שימושי עבור לימוד אינטראקציות חלשות הקשורים לעתים קרובות עם הכריכה ארעית של פני השטח glycoproteins כדי ליגנדים. יתר על כן, שיטות אלה ניתן להשתמש בשיתוף כדי להעריך את הכריכה של מבנים שונים, להעריך את השפעת שונים מקושרים-N glycoforms המתקבל לבטא את גליקופרוטאין בשורות תאים שונים. מבצע מתה על המרכז לטניס בישראל עם glycoproteins מיוצר HEK293F, HEK293S ו שטופלו אנדו H יכול לספק מבט מעמיק על התפקיד של glycans פעילות ביולוגית, מעורבות טיפולית.
אנחנו הוחלו בהצלחה פרוטוקולים אלה כדי לאפיין את התחום חוץ-תאית (ECD) של האדם CD2228, חבר גליקופרוטאין של משפחת לקטינים (Siglecs) Ig כמו חומצה sialic מחייב כי הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס B-cell44 . אנו לבצע עיצוב לבנות מעמיק כדי להקל על התגבשות, בהדרגה את ערכת הנתונים רנטגן מאת HA השריה עם כספית. אנו גם ספוג CD22 קריסטלים בחומצה sialic שלה ליגנד (α2-6 sialyllactose) כדי לקבל מבנה של המתחם קולטן המערכת החיסונית-ליגנד, ובכך סיפק את השרטוטים על עיצוב מונחה מבנה של glycan מימטיקה45,46. בנוסף, יצרנו הכריכה אנטיגן פרגמנט (Fab) של epratuzumab טיפולית נוגדן anti-CD22 - מועמד טיפולית כעת בשלב III בניסויים קליניים עבור לימפומה הודג'קין47- כדי לקבוע שלו זיקה מחייבת מאת רבנות בלי ו המרכז לטניס בישראל כדי באופן שונה glycosylated CD22 ECD בונה. מחקרים אלה חשף תפקיד קריטי עבור N-מקושרים גליקוזילציה ב epratuzumab אירוסין, עם השלכות פוטנציאליות להכרה CD22 על תאי B לא מתפקדת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Glycoproteins על פני השטח של תאים לשחק תפקידים חיוניים תפקוד התאים, לרבות איתות, אדהזיה ותעבורה. על לויקוציטים, כמה glycoproteins האלה מחזיקים בנוגדנים (Ig) מתקפל, הן גורם מרכזי זיהוי מערכת החיסון ורגולציה. כאן, אנו מציגים פלטפורמה עבור עיצוב, ביטוי ואפיון ביופיזיקלי של התחום חוץ-תאי של תא B האנושי קולטן CD22. אנו מציעים כי הגישות הללו חלים בהרחבה אפיון גליקופרוטאין בתרבית של ectodomains המכילה Ig תחומים. שני ההשעיה כליה אנושית עובריים (HEK) שורות תאים, HEK293F, HEK293S, משמשים כדי לבטא glycoproteins יקולל glycans מורכבים ולא גבוהה-מנוז, בהתאמה. אלה glycoproteins רקומביננטי עם glycoforms שונים מאפשרים לחקור את ההשפעה של glycan גודל והרכב על איגוד ליגנד. נדון פרוטוקולים ללמוד קינטיקה של התרמודינמיקה של קשירה גליקופרוטאין ליגנדים ביולוגית רלוונטית ומועמדים נוגדן טיפולית. Glycoproteins רקומביננטי המיוצר בתאי HEK293S נתונות התגבשות glycan הומוגניות, גמישות מופחתת וכתוצאה רגישות לטיפול endoglycosidase H. אנו מציגים שיטות שישכיחו גליקופרוטאין קריסטלים עם כבדים אטומים ומולקולות קטנות עבור שלב קביעת וניתוח של ליגנד הכריכה בהתאמה. הפרוטוקולים ניסיוני דנו הנה תחזיקי את ההבטחה של אפיון glycoproteins בתרבית של לתת תובנות תפקידם ולחקור את מנגנון הפעולה של הרפוי.

בונה מספר CD22 ECD בהצלחה משובטים לתוך הווקטור ביטוי pHLsec, overexpressed בקווים בתרבית של HEK293F ו- HEK293S תא (איור 2 ו 3 א). כל המבנים היו מטוהרת על הומוגניות גודל על-ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, הניב דוגמית טהורה ביותר ללימודי התגבשות (איור 3B ו- 3 C). הבונה CD22 שהובילו קריסטלים היטב diffracting היה העיגול d1-d3 (שאריות 20-330), עם חמישה אתרי גליקוזילציה מקושרים-N החזוי שישה מוטציה של Asn ל Ala (N67A, N112A, N135A, N164A ו N231A), המיוצר בתאי HEK293S, כאלה שרק האתר גליקוזילציה במיקום N101 נשמר (מבנה זה נקרא CD2220-330, 5A). קריסטלים התקבלו אצל מספר תנאים של המסך מטריצה דלילה MCSG-1, אך הקריסטלים הכי טוב ממצב המכיל 30% (w/v) פוליאתילן גליקול 4000, 0.2 מ' ליתיום כלוריד ו 0.1 M טריס, pH 8.5. גבישים אלו יליד diffracted לרזולוציה Å 2.1; באמצעות מבנים ידועים של Ig תחומים של חלבונים הקשורים Siglec לא נכנע פתרונות מר בחיפושים.
לרכוש מידע בהדרגה, אנחנו ספוג קריסטלים מקורית עם פאנל של תרכובות HA שכלל Hg Pt, Os, ת א, Br בריכוזים הנע בין 1-20 מ מ הא מתחם למשך זמן דגירה מ- 5 דקות עד 1 ד (איור 4). אנחנו במעקב קריסטלים לשינויים במורפולוגיה, ומצא כי גבישים ספוגה HA תרכובת-20 מ מ הביא את הסדיקה מהירה, המסת של הגביש. . הקפאנו סך של גבישים 63 שמר את צורתם בעקבות הדגירה קבוע שלעתים היו ספוגים עם אשכול ברומיד טנטלום, כלוריד פלטינה, mercuric אצטט mercuric כלוריד הקריסטלים ספוגה 7 מ מ של כלוריד mercuric למשך 30 דקות הראה אות חריג על סריקת קרינה פלואורסצנטית ב מקור האור קנדי (CLS) 08-מוניטור הפרעות לקרן החלקיקים (קנדה), מותר עבור פיזור חריגה גל רב רנטגן איסוף נתונים על יחיד קריסטל. אלה נתונים (datasets) אפשרה לנו לפתור את המבנה התחתי כספית של CD2220-330, 5A, אשר חשף אטום כספית יחיד מאוגדים של ציסטאין חינם במיקום C308, בסופו של דבר מותר לנו לבנות את המבנה של CD225A 20-330, לתוך מדורג מפת צפיפות אלקטרונים באמצעות AutoBuild78.
ברגע המבנה unliganded נפתרה, היינו מעוניינים בפתרון המבנה של CD22 קשורה ליגנד שלה, α2-6 siallylactose. אנחנו לחשב קודם את זיקתו של CD22 לכיוון sialyllactose α2-6 באמצעות המרכז לטניס בישראל כדי לאפיין את התרמודינמיקה איגוד של האינטראקציה. נצפתה זיקה של מיקרומטר ~ 280 ואנו להשתמש במידע זה כדי לזהות של הריכוז ההתחלתי (~ 100 x KD) של ליגנד להשתמש שישכיחו הקריסטלים שלנו יליד CD2220-330, 5A . אנו ספוג CD2220-330, 5A הקריסטלים עם 25 מ מ siallylactose במשך 5 דקות, 2 h. 14 h, 40 h ו- 5 d, פיקוח לשינויים במורפולוגיה קריסטל. סך של ~ 75 גבישי קפוא מן נקודות זמן שונות ושלח למזהה CLS סינכרוטרון הפרעות לקרן החלקיקים 08-(קנדה) לאיסוף נתונים מרחוק. סכום כולל של 6 רנטגן datasets נאספו מקריסטלים היטב diffracting. המבנה של כל ערכת נתונים רנטגן נפתרה על-ידי מר באמצעות את unliganded CD2220-330, 5A מבנה כמודל החיפוש הראשוני. צפיפות אלקטרונים שנוצר עבור כל datasets היה אז בדק צפיפות חיובית במפת Fo-Fc התואמים כרוך α2-6 sialyllactose בתוך אתר איגוד של CD22. למרבה הפלא, כל datasets אסף, אפילו אלה מקריסטלים ספוג אחרי רק 5 דקות של זמן הדגירה, הכיל צפיפות חיובית המקביל ליגנד באתר האיגוד. מבנים הכולל של unliganded, liganded CD22 היו מאוד דומים בשינויים הסתגלותי מינימלי, אשר עשוי להסביר את ההצלחה של השריית ניסויים α2-6 sialyllactose.
אנחנו הבא מאופיין השטח antigenic של CD22 מוכר על ידי נוגדנים טיפולית epratuzumab בניסויים רבנות בלי ו- ITC (איור 5). פרופילים קינטיקה, תרמודינמיקה של קשירה ללונג epratuzumab CD22 בונה עם glycoforms שונים חשף זיקה הגוברת כדי CD22 עם גודל glycan N-מקושרים מופחתת, עם עד הטבה 14-fold אהדה עבור glycans קטנים יותר (327 nM לעומת 24 nM ברבנות בלי; 188 nM לעומת 58 nM, ITC). מקושרים-CD22 N glycan הגבלת הגישה של הנוגדן ל epitope שלה זוהה על ידי רבנות בלי באמצעות מוטציות נקודה אחת של CD22 על ידי פתרון epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 קריסטל שיתוף מבנה28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> איור 1 . סקירה של אפיון גליקופרוטאין מעיצוב לבנות על אפיון biophysical ומבניים. (1) רצף הראשי ניתוח של נציג גליקופרוטאין. אפור, התחום חוץ-תאית (ECD); בירוק, הקטע (TM) transmembrane; בצבע כחול, תחום cytosolic של גליקופרוטאין. Glycans מקושרים-N החזוי מסומנות. שיבוט (2) של בונה ECD. (3) ביטוי ECD בונה בתאי יונקים. (4) גליקופרוטאין טיהור. בעוד חלבונים שבאה לידי ביטוי HEK293F יכיל glycans מורכבות, חלבונים שבאה לידי ביטוי HEK293S יהיה מנוז גבוהה glycans. טיפול אנזימטי של glycoproteins מיוצר בתאים HEK293S עם אנדו H תוצאות ב- glycoproteins עם רק GlcNAc moiety באתרים המקושרים N גליקוזילציה. Glycoproteins (5a) נבדקים לכריכה שלהם כדי נוגדנים על ידי אינטרפרומטריה biolayer (בלי) ו calorimetry איזותרמי טיטור (ITC). ניתן גם למדוד זיקה ליגנדים קטן ע י ITC. (5b) ניסויים התגבשות של glycoproteins עם הומוגניות מקושרים-N glycans, כגון אלה לידי ביטוי HEK293S ו- deglycosylated עם ה אנדו (6) במקרים מסוימים, מוטציה של אתרי גליקוזילציה מקושרים-N יש צורך להשיג קריסטלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> איור 2 . העיצוב של ectodomain CD22 DNA בונה עבור ביטוי בתאי יונקים. A) ייצוג פלסמיד pHLsec המשמש עבור תקנים ארעית של המבנים CD22 ECD. AgeI KpnI אתרים המשמשים שיבוט מסומנים עם התיבות האדומות. B) CD22 ECD מכיל Ig שבעה תחומים (d1-d7) ו- 12 אתרי גליקוזילציה מקושרים-N החזוי (בכחול). ארבעה מבנים תוכננו מן CD22 ECD. C) .1% ג'ל agarose מציג PCR amplicons של CD22 ECD בונה לקראת שיבוט לתוך הווקטור בתרבית של ביטוי pHLsec. ליין הראשון מכיל סמן הדנ א 1 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> איור 3 . ביטוי וטיהור של glycoproteins. A) השפעת צפיפות התאים על הביטוי התשואות. גליקופרוטאין ביטוי בתרבות מ"ל 25 בקנה מידה קטן של תאים הבולם HEK293F transfected באמצעות שלושה צפיפויות שונות ההתחלתי של תאים (0.5 x 106 תאים מ ל-1, 1.0 x 106 תאים מ ל-1ו- 1.5 x 106 תאים מ ל -1). כימות לבצע densitometry מדף-מרחביות בחלונית השמאלית ועל ידי רבנות בלי כמותיים בחלונית הנכון. ערכים הם נציג של הכנה גליקופרוטאין אחד. B) Chromatogram של טיהור השלב הראשון לבנות CD2220-330, 5A מ 600 מ של תגובת שיקוע באמצעות עמודת זיקה Ni-נ. ת. גליקופרוטאין היה eluted באמצעות שיפוע של imidazole (קו אפור), שבו 100% תואם למאגר • תנאי, אשר מכיל 500 מ מ imidazole. שברים במאגר מתוארים עם קווים אנכיים. C) גודל-הדרה chromatogram בשביל לבנות CD2220-330, 5A באמצעות בעל ביצועים גבוהים ג'ל עמודה סינון. שברים במאגר מהשיא • תנאי מתוארים עם קווים אנכיים. שיבוץ: ג'ל שהוכתמו Coomassie מרחביות-דף מציג את טוהר גליקופרוטאין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> איור 4 . קריסטל השריה עם אטומים כבדים. א) תחנת עבודה שישכיחו קריסטלים מקורית עם HA תרכובות הדגימה. כל הנדרשים כלים מסומנות. B) צעדים ולאחר מכן להשרות גבישים של לבנות CD2220-330, 5A עם תרכובות HA. שלב 1, פתח טוב המכיל גבישים וקריסטלים העברה באמצעות לולאה לירידה 0.2 µL על תגית כיסוי המכיל HA הפתרון מדולל התגבשות מצב כזה כי הריכוז הסופי של HA נע בין 1-10 מ מ. שלב 2, לאטום הירידה בצלחת התגבשות, דגירה קריסטלים עם HA מתחם לפרקי זמן שונים. שלב 3, לעלות את הקריסטל רטובה בתוך המעגל על הגב-להשרות ב-30 s ב- 3 ברציפות 0.2 µl טיפות המכילות את הפתרון אלכוהול אמא בתוספת 20% (v/v) גליצרול ויתרו על מכסה. בשלב 4, פלאש להקפיא את הקריסטל רכוב על לולאה עם חנקן נוזלי ולמקם אותו דיסקית למשלוח הפרעות לקרן סינכרוטרון החלקיקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> איור 5 . Biolayer אינטרפרומטריה ועל איזותרמי טיטור calorimetry מדידות. A) נציג מתה על הניסוי. הדף פאנל: דוגמה של הצלחת ההתקנה עבור ניסוי קינטיקה, איפה מסומנות הבאות: מאגר קינטיקה x 1 (ב), שלו6 x-גליקופרוטאין מתויג טעינה (L), נציג ריכוזים Fab (500 250, 125, 62.5 ננומטר), PBS + 500 מ מ התחדשות מאגר (R), ו- 1 x קינטיקה ניטרול מאגר (B). ובכן, כל אחד מכיל 200 µL של פתרון. צעד מספר עבור הניסוי קינטיקה מסומן בחלק העליון של הלוח. התיכון לוח: נציג נתונים גולמיים של רבנות בלי הניסוי המבוצעת באמצעות ביולוגיים Ni-נ ו את הצלחת תיאר בחלונית העליונה. שלב המספרים תואמים בסיסית (1), שלו גליקופרוטאין6 x טעינה (2), בסיסית (3), האגודה ב טורי דילול של Fab (4), דיסוציאציה (5). התחדשות השלבים אינם מיוצגים (שלבים 6-7). פאנל התחתונה: נציג מידע מנותח מציג raw וארגון דיסוציאציה (קו כחול) עם המתאים 1:1 מתאים (הקו האדום). B) הדף פאנל: נציג את הצלחת ההתקנה עבור ITC יחיד להפעיל מכשיר ITC אוטומטית עם שבעה ניסויים ב 96-ובכן סביב הבלוק התחתון. ניסוי מורכב משלוש בארות. הבאר הראשונה (אדום) מקבילה מדגם של התא (400 µL), הבאר השנייה (ירוק) מקבילה מדגם עבור המזרק (120 µL). השלישי טוב שנשאר ריק, הדגימות מעורב יוחזרו לזה גם בעקבות השלמת הניסוי. ניסויים 1, 2 ו- 7 הם מאגר לפקדי מאגר. ניסויים 3-5 מייצגים triplicate ניסויים עם גליקופרוטאין (P) בתא, Fab או ליגנד (L) במזרק. ניסוי 6 מייצגת חום ליגנד השליטה דילול, צריך להיות מופחתים ניסויים 3-5 במהלך ניתוח נתונים. פאנל התחתונה: נציג raw (למעלה) ונתונים ITC מעובד (למטה) מציג Fab (epratuzumab) מחייב את CD22 ECD מיוצר בתאים HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אנו מציגים גישות עבור biophysical ומבניים אפיון glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים אינטרפרומטריה biolayer, calorimetry איזותרמי טיטור ו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן.

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

Liquids, Solids, and Intermolecular Forces

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...