Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
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이 문서에서 설명 하는 x 선 회절 실험은 캐나다 재단 혁신, 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다에 대 한 지원, 캐나다 광원에서 08-ID와 08-BM beamlines를 사용 하 여 수행 했다는 서스캐처원 대학, 서스캐처원 정부, 서쪽 경제 다양화 캐나다, 국가 연구 위원회 캐나다 건강 연구의 캐나다 학회. 우리는 ITC는 및 씨 계기에 대 한 액세스에 대 한 구조 및 생물 핵심 시설, 병원 아픈 어린이 위한 인정 하 고 싶습니다. J.E.O.에 의해 밴팅 박사 친목 BPF-144483 건강 연구의 캐나다 학회에서 지원 되었다. T.S.는의 캐나다 대학원 장학금 석사 받는 보너스와 건강 연구의 캐나다 학회에서 Vanier 캐나다 대학원 장학금. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에서 부여 PJT 148811 (제이-P.J.)를 운영 하 여 지원 했다. 이 연구는 캐나다 연구의 자 프로그램 (제이-P.J.)에서 자금 지원 덕분에, 부분적으로, 착수 했다.

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

막 고정 glycoproteins 세포 기능에 대 한 중요 하 고 매력적인 치료 대상. 여기, 우리 모두 혼자 하 고 작은 분자 ligands 복잡 한 막 glycoproteins, ECD의 구조 및 생물 특성에 대 한 프로토콜을 제시 하 고 놀라 우 파편. 성공적으로 인간의 CD2228, B 셀 체크79에 체액 성 면역을 유지에 관련 된 중요 한 공동 수용 체의 세포 외 액의 3 개의 N-터미널-대부분 Ig 도메인의 결정 구조를 결정 하기 위해이 프로토콜을 사용 했습니다. 우리는 자연 ligand α2 6 sialyllactose CD22의 바인딩 사이트 특징 또한 있고 인간의 CD22 향해 치료 항 체의 인식 모드를 정의. B 세포 및 분자 로드맵 발전 새로운 CD22 대상된 작은 분자의 항 체 기반으로 식을 제한 했다 Siglecs 가족의 중요 한 일원의 구조-기능 관계에 대 한 통찰력을 제공 하는 이러한 결과 치료제입니다. 이 프로토콜은 Ig 포함 된 B 세포 수용 체에 대 한 성공적으로 사용 되었다, 하는 동안 우리는 별개의 도메인 조직과 어떤 막 당단백질의 구조 및 생물 특성에 대 한 우리의 접근을 적용할 수 있는 제안 합니다. 이러한 경우에 설계 및 조합 N 연결 glycan 돌연변이 (Gln 또는 중 Ala) 구문을 결정 성장 및 고해상도 회절에 적합 찾을 수 계산 수를 생성 합니다.
균질 하 고 순수한 당단백질 샘플을 얻는 것은 결정 성장 및 x 선 회절, 뿐만 아니라 류의 생물 특성에 대 한 중요 한 중요성의. N 연결 된 glycans glycoproteins에 본질적으로 다른 유형의 그리고 크리스탈 형성을 막을 수 있는 당단백질 내 구조적 및 화학이 발생할 수 있습니다. 이 마이크로-이 줄이기 위해, 전략 항구 N 연결 glycans, 또는 뒤에 endoglycosidases (EndoH) 같은 치료 돌연변이 세포 라인 (HEK293S) 등을 사용 하 여 예측 하는 Asn 잔류물을 제거 하려면 포인트 변이 소개 하는 상당히 수 있습니다. 결정 화 성공15,,2122향상. 이 프로토콜을 수용 성 glycoproteins 및 셀 표면에 뜨는에 분 비 된 팹의 정화를 다루겠습니다. 당단백질 분 비 세포 세포의 용 해에 대 한 필요성 또는 가혹한 화학 제품 또는 세제의 추가 없이 순으로 비교적 간단한 경로 제공합니다. 세포 표면에 뜨는, 얻은 다음 셀 수확 다음 열 (예를 들어, Ni NTA 태그 그의 glycoproteins 또는 Fab 조각에 대 한 LC 선호도) 관심사의 단백질에 대 한 선호도 통해 직접 실행 됩니다. 그러나, 사용 열 셀 표면에 뜨는 (예, pH)의 조건에 따라 열에 관심사의 단백질의 바인딩 기능 수 있습니다 영향을 받을. 이 경우 그것은 집중 하 고 버퍼 교환 표면에 뜨는 셀 열에 바인딩 개선 하기 위해 필요할 수 있습니다. 또한, 단백질 순도 평가할 수 있도록 정화 하는 동안 품질 관리 단계를 고용 하는 것이 좋습니다. SDS 페이지 젤 또는 (이전, 도중 및 정화 단계 후)는 모든 샘플의 서쪽 오 점 실행 제안 된 정화 계획은 관심사의 단백질에 대 한 적합 여부에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 오염 밴드 SDS 페이지에 표시 되는 경우 또는 여러 종의 정화 하는 동안 가져온 경우 (예를 들어, 크기 배제에 여러 봉우리), 추가 정화 단계 고려해 야 합니다, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 얻을 수 다운스트림 결정 화80의 순도 증가 기회
고분자의 결정 화에 대 한 잠재적인 결정 화 조건 높은 단백질 농도에서 다 수의 심사에 대 한 적합 한 크리스탈 안타를 찾을 수 있도록 관심사의 단백질의 높은 수익률을 얻기 위해 중요 한이. 일반적으로, HEK293 세포 라인 여기 논의 (HEK293F 및 HEK293S) 강력한 식 시스템을 필요에 따라 더 많은 샘플을 생산 하 쉽게 확장 될 수 있습니다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질이 세포 라인 내에서 충분히 표현 하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우에는에서 Expi293 셀81,82, 같은 다른 셀 라인, 단백질 식의 우수한 수준을 보여주 발견 되었습니다 하 고 대 안으로 고려해 야 합니다.
정돈, diffracting 크리스탈 얻지 못하면 다음의 고 순도도 불구 하 고 관심사의 단백질의 여러 구문 테스트, 크리스탈 형성을 촉진 하는 결정 화 기술을 확장 필요할 수 있습니다. 그것은 그 항 체 및 nanobodies의 팹 조각 우수한 결정 화 강화, 고 수 정돈된 크리스탈83,,8485포장 홍보 표시 되었습니다. 이 파편은 표현 고 동질성, 정화 고 결정 화를 촉진 하 관심사의 단백질을 가진 복합물에 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 제 10에 설명 된 대로 생산 팹 조각 비작동 LC 이합체86를 형성 하는 경향이 있을 수 있습니다. 이러한 이합체 오염 물질 고 정화 하는 동안 제거 한다. 그러나 우리의 경험에서 LC 이합체 종종 다른 보존 볼륨 크기 제외에 또는 이온 교환 크로마토그래피에 뚜렷한 피크로 elute 있고 따라서에서 제거할 수 있습니다 팹 정화-이것은 항상 사실이 아니다. 이러한 기술을 Fab 정화에서 LC 이합체를 제거 하기에 충분 하지 않으면, 추가 정화 방법, 단백질 G 친 화력 정화 등 순도 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.
대안 공동-complexation 놀라 우 파편을, 임의의 행렬 microseeding 같은 문서화 기법 정돈된 크리스탈63,70를 얻기의 기회를 높일 수 있습니다. 이 방법은 크리스탈 크리스탈 성장을 촉진 핵 제공 결정 화 조건에 짓 눌린, 차선의 결정의 작은 금액의 추가 포함 한다. 이 관심, 또는 유사한 도메인 아키텍처 및 3 차 구조에 그들의 단백질의 결정을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 혼자, 단백질을 구체화 하려고 또는 Fab 조각 또는 관심의 작은 분자와 복잡 한 임의 매트릭스 microseeding은 수행할 수 있습니다. Cryo 전자 현미경 검사 법의 최근 발전 또한 게이 기술을 적절 한 기능87,88와 분자에 대 한 고해상도 구조 정보를 얻기 위해 엑스레이 결정학에 매력적인 대안 89,,9091.
X 선 회절 데이터 집합의 단계적 씨에 의해 실패, 몸을 담글 하 변칙 분산 또는 isomorphous 교체 하 여 위상 문제를 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다. 단백질의 아미노산 시퀀스의 검사 하 derivatization, 바인딩에 대 한 최적의 pH를 포함 하 여에 대 한 전략에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 특히, 단백질 내 짝이 없는 시스테인 특히 하 화합물 수은 포함 하는 바인딩할 수 있습니다. HA 화합물과 기본 결정을 몸을 담글 최적의 하 화합물의 id, 그것의 농도 및 필요한 보육 시간을 결정 하는 반복 프로세스입니다. 초기 몸을 담글 시도 단계적 적합 하 포함 잘 diffracting 결정을 양보 하지, 그것은 HA 바인딩의 확률을 개선 하 여 비정상적인 신호를 개선 아미노를 함유한 산 성 대체를 소개 해야 있습니다. 그러나 예로 돌연변이 바인딩할 효율적으로 Hg, Au, Pt 식이나 Pb. 단백질의 변칙 단계적으로 조정, 광범위 하 게 사용 되는 대장균 에서 seleno-메티오닌 보충 미디어에 변칙 단계적 무료 시스테인 잔류물을 포함 하는 해당 시스템을 안정적으로 seleno-메티오닌 정지92,93, 포유류 세포를 위해 쉽게 사용할 수 있는 이며 미래 발달의 지역 이다.
관심의 당단백질의 unliganded 구조를 얻은 작은 분자 ligands와 결정을 몸을 담글 면역 수용 체 ligand 복합물의 구조를 얻기 위해 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터는 당단백질의 생물학적 기능에 높은 해상도 통찰력을 제공 뿐만 아니라 작은 분자 치료제로 사용 될 수 있는 더 구체적이 고 높은 선호도 ligands의 합리적인 디자인에 대 한 청사진을 제공 합니다. 관심의 작은 분자 ligands과 당단백질 결정을 할 때 unliganded 크리스탈 구조의 검사 해야 하는지 여부를 몸을 담글 수 나타낼 수 있습니다. 만약 가까운 크리스탈 포장 연락처 ligand 바인딩 사이트 발견 또는 ligand 바인딩 시 구조적 변화를 받을 것으로 예상 하는 지역, 주변 문제가 될 가능성이 몸을 담근 채. 이 경우에, 단백질-리간드 복합체의 공동 화 등 다른 방법은 수행 되어야 한다.

표면 단백질 세포 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 그들의 세포 외 도메인을 통해이 막 단백질 세포 세포 상호 작용, 접착, 전송 및1,2신호를 조절 수 있습니다. 이 단백질의 extracellular 지역화는 그들에 게 다양 한 질병, 암 및 면역 질환3,,45 등의 치료에 대 한 치료제의 개발에 대 한 매력적인 대상 , 6 , 7. 인간의 막 단백질 ectodomains의 가장 일반적인 주름 중 하나는 7 개 이상의 β 물가 2 개의 β-시트8,9으로 배열에 의해 형성 되는 면역 글로불린 같은 (Ig) 배. 일반적으로, glycoproteins Ig를 포함 하는 세포 외 막 단백질10부분에 순차적으로 정렬 된 서 도메인 멀티 도메인 구조. 포스트 번역 상 수정이 세포 표면 단백질, 특히 N-및 O-연결 된 glycosylation의 그들의 레 귤 레이 션, 접이식, 분 비 및 기능11에 필수적인 역할을 보여왔다. 그들의 기능은 그들을 타겟팅 할 수 있습니다 더 나은 디자인 치료제를 우리의 이해를 개선, 기술 하는 필요를 그들의 상세한 분자 특성에 대 한 허용. 여기, 우리는 생물을 허용 하는 기술의 조합을 제시 (biolayer 간섭계 (BLI) 및 등온선 적정 열 량 (ITC)) 및 포함 하는 Ig의 세포 외 도메인의 구조 (x-선 결정학) 특성화 막 glycoproteins, 혼자이 고, 단지 그들의 생물학 관련 ligands와 치료 분자 (그림 1)에서
N 연결 glycosylation 포유류 단백질에서 가장 일반적인 번역 후 수정 중 이며 바인딩과 그물 및 골12,13내 단백질 성숙 하는 동안 발생 합니다. 셀 라인 (HEK) 인간 미 발달 신장 293 세포, 등 대량의 당화 포유류 단백질14,15의 재조합 형 식에 대 한 개발 되었습니다. 이 셀 라인 부착 세포 라인에 비해 대량 단백질 생산 확장의 용이성을 위해 수 있는 서 스 펜 션 형식으로 개발 되었습니다. 여기, 우리 두 HEK293 세포 라인 활용: HEK293F 및 HEK293 Gnt 나-/- (HEK293S), N-acetylglucosaminyl 전이 효소의 부재에 의해 차이가 나는 (Gnt 나) 후자에. 차례로, (에서 본된 HEK293F)으로 복잡 한 glycans의 생산은 불가능 하 고 대신 높은 노 오 스-타입 glycans (주로 남자5GlcNAc2) N 연결 glycan 사이트18,19,20에서 거주 . 동시에이 두 셀 라인을 사용 하 여 생물 학적 기능 및 치료 대상에 glycan 크기와 복잡성의 효과 공부 하 고 있습니다. 실제로, HEK293F 세포에서 생산 하는 glycoproteins HEK293S 세포에서 생산 하는 동일한 당단백질에 비해 더 크고, 더 복잡 한 glycans를 있을 것 이다. Glycoproteins HEK293S 세포에서 생산 되는 그들의 N-연결 된 glycans의 감소 된 화학 및 구조적이 더 많은 의무가 결정, 됩니다. 더욱 개선 하기 위해 crystallizability, glycoproteins HEK293S (그러나 아닙니다 HEK293F) 세포에서 생산 효소 endoglycosidase H (엔도 H), 귀착되 고만 노 오 스 glycans의 분열 등으로 치료 될 수만 있는 단일 N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety 각 N 연결 glycosylation 사이트21,22에 남아 있다. 다른 방법 또한 당단백질 식, kifunensine23를 포함 하 여 동안 glycosyltransferase 억제제의 추가 같은 셀 내에서 N glycan 처리를 제한 사용할 수 있습니다. 대체 방법을 효소 deglycosylation 펩 티 드 N glycosidase F (PNGaseF)를 사용 하 여 다음 기본 glycoproteins (HEK293F 세포)에 식을 포함 한다. 그러나, PNGaseF와 deglycosylation 기본 조건 및 증가 집계 어떤 단백질;에 덜 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 경우에는 단백질 치료 후, 수용 성 유지 그것 가져옵니다 aspartic 산24, 아스파라긴 잔류물의 deamidation 때문에 표면에 음 전을 그것의 결정 화에 대 한 될 수 있습니다. 예측된 N glycosylation 사이트 수 또한 변경 될, 알라닌 또는 글루타민 잔류물,이 사이트에서 glycosylation N 연결을 방지 하 고 높은 동질성의 당단백질 샘플을 생성 하는 가장 자주. 또는, glycoproteins 효 모, 곤충, 및 공장 시스템, 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포16,17등 다른 포유류 세포 라인을 포함 하 여 다른 진 핵 세포 배양에서 생산 수 있습니다.
PHLsec를 포함 하 여 많은 포유류 식 벡터 셀 중간25에 재조합 당단백질 ectodomains의 분 비에 대 한 수 있습니다. HEK293 세포에서 glycoproteins의 분 비 세포 세포의 용 해에 대 한 필요 없이 신속 하 고 쉽게 정화 수 있습니다. 정화 태그의 추가 (예: 그의 태그, Strep 태그 플래그-태그, Myc-태그, 하-태그) 대상의 N 또는 C terminus 당단백질 단일 단계 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 있습니다. 그 후, 크기 배제 크로마토그래피는 생물 및 구조적 특성에 대 한 단 분산 예제를 사용할 수 있습니다.
적절 한 조건 하에서 매우 순수 하 고 균질 당단백질 샘플 잘 diffracting 결정에서 발생할 수 있습니다. 전체 x 선 회절 데이터 집합 같은 결정에서 얻은 되어, 초기 단계는 당단백질의 전자 밀도 계산 하기 위해 결정을 해야 합니다. 구조 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 이제까지 증가 수, 덕분에 단계적으로 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 지금까지 초기 단계26관련된 단백질 구조를 사용 하 여 분자 교체 (MR) 되고있다 합니다. 그러나, 때때로 멀티-Ig 도메인 glycoproteins27,,2829경우 되었습니다 미스터 위상 문제를 해결 하기 위해 실패 하면 다른 방법이 제시해 주셔야 합니다. 이 문서에서는, 우리 CD22 ectodomain28의 구조를 해결 하는 데 필요한 있던 단계적으로 조정, 무거운 원자 (HA)와 결정을 방법 선발. 단계적으로 조정 하는 권리를 식별 특정된 결정 격자와 결정 화 솔루션30,31당단백질에 사용할 수 있는 원자 하 반응에 의존 하는 반복적인 프로세스입니다. 또는, 시스테인과 메티오닌 잔류물에 자연 유황 원자 단계적으로 조정, 당단백질에 다른 원자에 충분히 높은 비율에 있는 경우 그리고 만약 충분히 높은 중복32, x 선 회절 데이터를 수집할 수 있습니다. 사용할 수 있습니다. 33.
멤브레인 glycoproteins의 생물 학적 기능은 종종 탄수화물과 같은 단백질 단백질 상호 작용 또는 상호 작용 단백질-리간드, 중재. ligand는 결정 격자에 있는 당단백질 바인딩 사이트에 솔루션에서 확산, 실험을 몸을 담글 수 있습니다 리간드 인식을 이해 하기 당단백질 ligand 공동 결정 구조를 성공.
여기에 제시 된 프로토콜 합성 치료 ligands34,35 및 항 체 치료제36,37와 표면 glycoproteins의 상호 작용을 이해 관련이 있습니다. 결합 구조 정보, 활동 및 열역학을 바인딩 이해 하 고 그들의 행동의 메커니즘을 개선 하는 강력한 될 수 있습니다. 치료 항 체는 당단백질에 바인딩의 운동 분석을 허용 하는 1 개의 기술은 씨38,39이다. 라스 고정된 ligand와 바이오 센서를 사용 하 여 바인딩 파트너, 궁극적으로 결정 하는 평형 분리 상수 (KD) 협회 및 분리 속도 측정. Glycoproteins의 적은 양이 필요 하기 때문에 씨는 매력적인 방법입니다 (< 100 µ g), 실험 시간 빠릅니다 (10 ~ 15 실행 당 분), 그리고 자동화 될 수 있다. ITC는 또한 glycoproteins와 바인딩 파트너40,41,,4243사이의 선호도 공부 하 고 유용 합니다. ITC는 더 많은 시간과 집중 시 약, (ΔG, ΔH, ΔS, 및 산출할) 상호 작용의 열역학에 관한 귀중 한 정보를 얻을 수 있습니다. ITC는 또한 수시로 ligands에 표면 glycoproteins의 과도 바인딩 연관 된다 약한 상호 작용을 공부 하 고 매우 유용 합니다. 또한, 이러한 기법을 평가의 다양 한 구문 바인딩 다른 세포에서 당단백질 표현에서 얻은 다른 N-연결 된 glycoforms의 효과 평가 하는 함께에서 사용할 수 있습니다. Glycoproteins HEK293F, HEK293S에서에서 생산 하 고도 H로 치료와 씨와 ITC 수행 생물 활동 및 치료 참여에 glycans의 역할의 깊이 보기를 제공할 수 있습니다.
우리는 성공적으로 인간의 CD2228,44 B 세포 항상성 유지 하기 위한 필수적인 sialic acid 바인딩 Ig 같은 lectins (Siglecs) 가족의 당단백질 구성원의 세포 외 도메인 (ECD)의 특성을 이러한 프로토콜 적용 . 우리는 결정 화를 촉진 하기 위하여 심층 구조 설계를 수행 하 고 Hg에 몸을 담글 하 여 x-선 데이터 집합 위상. 우리는 또한 면역 수용 체 ligand 복합물의 구조를 그것의 ligand sialic 산 (α2-6 sialyllactose) CD22 결정을 젖 었 고 따라서 glycan mimetics45,46의 구조 기반 디자인에 대 한 청사진을 제공. 또한, 우리 생성 안티 CD22 치료 항 체 epratuzumab-현재 비-Hodgkin의 림프 종47단계 III 임상 시험에서에서 치료 후보-의 단편 항 원 바인딩 (팹) 씨에 의해 그것의 바인딩 선호도 결정 하 고 차동 당화를 ITC CD22 ECD를 생성합니다. 이러한 연구는 CD22 인식 역 기능 B 세포에 대 한 잠재적인 영향으로 epratuzumab 연계, glycosylation N 연결에 대 한 중요 한 역할을 계시 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Glycoproteins 세포의 표면에 접착 및 전송 신호를 포함 한 세포 기능에 중요 한 역할을 재생 합니다. 백혈구에이 glycoproteins의 여러 면역 글로불린 (Ig) 주름을 소유 하 고 면역 인식 및 규정은. 여기, 우리 디자인, 식 및 인간 B 세포 수용 체 CD22의 세포 외 도메인의 생물 특성에 대 한 플랫폼을 제시. 우리는 이러한 방식을 Ig 도메인을 포함 하는 포유 동물 당단백질 ectodomains의 특성에 광범위 하 게 적용 되는 것을 제안 합니다. 두 개의 서 스 펜 션 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀 라인, HEK293F 및 HEK293S, glycoproteins 각각 복잡 하 고 높은-만 노 오 스 glycans를 은닉을 표현 하는 데 사용 됩니다. 다른 glycoforms와 함께 이러한 재조합 glycoproteins glycan 크기와에 ligand 바인딩 구성의 효과 조사 하 고 있습니다. 우리 토론 활동 및 생물학 관련 ligands 및 치료 항 체 후보 당단백질 바인딩의 열역학 공부에 대 한 프로토콜. HEK293S 세포에서 생산 하는 재조합 glycoproteins glycan 동질성, 감소 유연성과 민감성 endoglycosidase H 치료에 대 한 결정 의무가 있습니다. 우리는 각각 당단백질 결정 무거운 원자 및 단계 결정과 ligand 바인딩의 분석에 대 한 작은 분자를 몸을 담글에 대 한 방법을 제시. 실험 프로토콜 논의 여기 그들의 기능에 대 한 통찰력을 제공 하 고 치료의 행동의 메커니즘을 조사에 포유류 glycoproteins 특성에 대 한 약속 잡으십시오.

CD22 ECD의 여러 구문은 pHLsec 식 벡터에 복제 성공적으로 되었고 overexpressed 포유류 HEK293F 및 HEK293S 셀 라인에서 (그림 2 , 3A). 모든 구문 크기 배제 크로마토그래피에 의해 크기 동질성을 순화 되었고 결정 화 연구 (그림 3B 와 3c) 매우 순수한 예제를 굴복. CD22 구문을 잘 diffracting 결정을 주도 했다 d1 d3 잘림 (잔류물 20-330), Ala (N67A, N112A, N135A, N164A 및 N231A), Asn에서 돌연변이 6 예측된 N 연결 glycosylation 사이트의 5 등만 HEK293S 세포에서 생산 위치 N101 유지 되었다 glycosylation 사이트 (이 구문을 CD22 라는20-330, 5A). 크리스탈 MCSG 1 스파스 매트릭스 스크린의 여러 조건에서 가져온 하지만 최고의 결정 pH 8.5 30% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 4000, 0.2 M 리튬 염화 물 및 0.1 M 트리를 포함 하는 상태에서 했다. 이 기본 결정 2.1 Å 해상도; diffracted 관련된 Siglec 단백질의 Ig 도메인의 알려진된 구조를 사용 하 여 미스터 검색에 어떤 해결책 든 지 생성 하지 않았다.
위상 정보를 취득, 우리 하는 보육 시간 1 d (그림 4)을 5 분에서에 대 한 화합물의 1-20 m m에서 배열 하는 농도에서 Hg, Pt, 운영 체제, Ta, 및 Br 포함 하 화합물의 패널 기본 결정을 젖 었. 우리는 크리스탈 형태학에 있는 변화를 모니터링 하 고 발견 결정 하 20 m m 컴파운드와 배어 귀착되 었 다 급속 한 균열 및 결정의 용 해. 우리 63 탄탈 브 로마 이드 클러스터, 백 금 염화 물, mercuric 아세테이트와 mercuric 염화 젖 었 했다 설정된 부 화 시간을 다음과 같은 그들의 모양을 유지 하는의 총을 동결. 크리스탈 7 m 30 분 캐나다 빛 소스 (CLS) 08-BM beamline (새스커툰, 캐나다)에 형광 스캔에 변칙 신호를 보여준 mercuric 염화의 흠뻑 젖 고 다 파장 변칙 분산 단일 x-선 데이터 컬렉션에 대 한 허용 크리스탈입니다. 이러한 데이터 세트 허용 CD22의 수은 하위 구조를 해결 하기 위해 우리20-330, 5A, 단일 수은 원자 위치 C308 무료 시스테인에 바인딩된 및 궁극적으로 봐도 CD22의 구조를 구축 공개는 단계적으로20-330, 5A 전자 밀도 지도 사용 하 여 빌드78.
Unliganded 구조 해결 되었다, 일단 그것의 ligand, α2-6 siallylactose에 바인딩된 CD22의 구조를 해결에 관심이 있었습니다. 우리는 먼저 α2 6 sialyllactose ITC를 사용 하 여 상호 작용의 바인딩 열역학 특성으로 CD22의 선호도 계산. 우리는 ~ 280 μ M의 선호도 관찰 하 고 초기 농도 식별 하기 위해이 정보를 사용 (~ KDx 100) 우리의 네이티브 CD2220-330, 5A 결정의 적시에 사용할 ligand의. 우리 5 분, 2 시간, 14 h, 40 h 및 5 d 25 m m siallylactose와 CD2220-330, 5A 결정 젖 었 고 크리스탈 형태학에 있는 변화 모니터링. ~ 75 결정의 총 다양 한 시간 포인트에서 동결 되었고 CLS 싱크 로트 론 beamline 08-ID (새스커툰, 캐나다) 원격 데이터 수집에 대 한 전송. 6 x-선 데이터 집합의 총은 잘 diffracting 결정에서 수집 되었다. 각 x-선 데이터 집합에서 구조 unliganded CD2220-330, 5A 구조를 사용 하 여 초기 검색 모델로 서 씨에 의해 해결 되었다. 모든 데이터 집합에 대 한 결과 전자 밀도 CD22의 바인딩 사이트 내에서 α2 6 sialyllactose에 대응할 Fo Fc 지도에 긍정적인 밀도 대 한 다음 검사 했다. 놀랍게도, 모든 데이터 집합 수집, 심지어 그 후 부 화 시간, 5 분만 포함 된 ligand 바인딩 사이트에서에 해당 하는 긍정적인 밀도 젖 었 하는 결정에서. Unliganded 및 liganded CD22의 전반적인 구조 α2 6 sialyllactose와 몸을 담글 실험의 성공을 설명할 수 있는 최소한의 구조적 변화, 매우 유사 했다.
우리는 다음 CD22 치료 항 체 epratuzumab 씨 및 ITC 실험 (그림 5)에 의해 인식의 항 원 표면 특징. 다른 glycoforms와 CD22 구문에 epratuzumab 팹 바인딩의 활동 및 열역학 프로필 작은 glycans (327 nM 대 24 nM에 대 한 선호도에 14-fold 개선까지 함께 감소 N 연결 glycan 크기 증가 선호도 CD22 공개 에 라스; 188 nM 대 58 nM ITC에). CD22의 단일-지점 돌연변이 사용 하 여 씨와 epratuzumab 팹 CD22 d1 d3 공동 결정 구조28해결 glycan CD22 N 연결 제한 액세스 하는 epitope 항 체의 확인 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> 그림 1 . 생물 및 구조적 특성을 구문 디자인에서 당단백질 특성 개요. (1) 기본 시퀀스 대표 당단백질의 분석. 회색, 세포 외 도메인 (ECD); 녹색, 막 횡단 (TM) 세그먼트; 그리고 파란색으로 당단백질의 cytosolic 도메인. 예측된 N 연결 glycans로 표시 됩니다. ECD 구문 (2) 복제입니다. (ECD의 표현 3) 포유류 세포에서 생성합니다. (4) 당단백질 정화입니다. HEK293F에 표현 된 단백질 복잡 한 glycans 포함 됩니다, 하는 동안 HEK293S에 표현 된 단백질 높은 노 오 스 glycans가 있을 것 이다. Glycoproteins의 효소 처리 glycosylation N 연결 된 사이트에만 GlcNAc moiety와 glycoproteins에도 H 결과 HEK293S 세포에서 생산. (5a) Glycoproteins 항 체 바인딩을 위한 biolayer 간섭계 (BLI) 및 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 테스트 됩니다. 작은 ligands 선호도 또한 ITC에 의해 측정할 수 있습니다. 어떤 경우에도 헤 (6) HEK293S와 deglycosylated에 표현 등 균질 N 연결 된 glycans와 glycoproteins의 (5b) 결정 화 실험 돌연변이 glycosylation N 연결 사이트의 결정을 얻을 필요가 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> 그림 2 . CD22 ectodomain DNA 포유류 세포에서 식에 대 한 구성의 디자인. A) pHLsec 플라스 미드 과도 transfection CD22 ECD 구문에 대 한 사용의 표현. 복제에 사용 되는 AgeI 및 KpnI 사이트는 빨간 상자에 표시 됩니다. B) The CD22 ECD 포함 7 Ig 도메인 (d1-d7) 및 12 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 (파란색). 4 구조 CD22 ECD에서 설계 되었습니다. C) 1 %agarose 젤 CD22 ECD의 PCR amplicons 보여주는 pHLsec 포유류 식 벡터에 클로닝을 위한 구성. 첫 번째 레인 1 kb DNA 마커를 포함합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> 그림 3 . 식 하 고 glycoproteins의 정화입니다. A) 식 수익률에 셀 밀도의 효과. HEK293F 현 탁 액 셀의 소규모 25 mL 문화에서 당단백질 식 페 셀 (0.5 x 106 세포 mL-1, 106 세포 mL-1x 1.0 및 1.5 x 106 세포 mL 의 3 개의 다른 시작 밀도 사용 하 여 -1). 정량화와 오른쪽 패널에서 양적 라스 densitometry SDS 페이지에서 왼쪽된 패널에 의해 수행. 값은 한 당단백질 준비의 대표입니다. B) 첫 번째 정화 단계의 크로마 구성 CD2220-330, 5A에서 Ni NTA 선호도 열을 사용 하 여 상쾌한의 600 mL. 당단백질은 eluted 100 %500 m m 이미 포함 된 차입 버퍼에 해당 한 이미 (회색 선), 그라디언트를 사용 하 여. 풀링된 분수 수직 선으로 묘사 된다. C) 에 대 한 크기-배제 크로마 구성 CD2220-330, 5A는 고성능을 사용 하 여 젤 여과 열. 차입 피크에서 풀링된 분수 수직 선으로 묘사 된다. 삽입: Coomassie 스테인드 SDS 페이지 젤은 당단백질의 순도 보여주는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> 그림 4 . 크리스탈 무거운 원자를 가진 몸을 담글. HA 화합물과 기본 결정을 몸을 담글의 A) 샘플 워크스테이션 모든 도구는 레이블이 필요 합니다. B)의 결정을 따른 스텝 구성 CD2220-330, 5A 하 화합물. 1 단계, 잘 결정, HA 솔루션 HA의 최종 농도 1-10 mM에서 범위는 결정 화 조건에 희석을 포함 된 커버 슬립에는 0.2 µ L 루프를 사용 하 여 전송 결정을 포함 하는 오픈. 2 단계, 결정 화 접시에 방울을 봉인 하 고 다른 기간에 대 한 복합 HA와 크리스털을 품 어. 3 단계, 루프에서 젖된 크리스탈 탑재 및 백-담가 30에서 3 연속 0.2 µ l 20% (v/v) 글리세롤 커버 슬립에 적절 하 게 보충 어머니 주류 솔루션을 포함 하는 s. 4 단계, 플래시 동결 액체 질소로 루프에 장착 된 크리스탈 하 고 싱크 로트 론 beamline에 선적을 위한 퍽에 배치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> 그림 5 . Biolayer 간섭계와 등온 적정 열 량 측정 측량입니다. A) 대표 씨 실험. 상단 패널: 플레이트 설치 속도 실험, 다음 표시 됩니다에 대 한의 예: 1 x 속도 론 버퍼 (B), 그의6 x-태그 당단백질 로드 (L), 대표 팹 농도 (62.5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 m m 재생성 버퍼 (R), 그리고 속도 론 중화 x 1 버퍼 (B). 각 잘 솔루션의 200 µ L를 포함합니다. 동역학 실험 단계 번호는 접시의 위쪽에 표시 됩니다. 중간 패널: 대표 씨 실험 Ni NTA 바이오 센서를 사용 하 여 수행 및 상단 패널에 설명 된 접시의 원시 데이터입니다. 단계 번호 기준 (1), 그의6 x 당단백질 로드 (2), 초기 (3), 팹 (4) 및 (5) 분리의 직렬 희석에서 협회에 해당 합니다. 재생 단계 표현 (6-7 단계). 하단 패널: 원시 협회 및 해당 분리 (파란 선) 1: 1을 보여주는 대표적인 분석된 데이터 (레드 라인) 적합. B) 상위 패널: 단일 ITC에 대 한 대표적인 플레이트 설치 바닥 블록 라운드 96 잘에서 7 실험 자동된 ITC 악기에서 실행. 각 실험은 3 개의 우물의 구성 되어 있습니다. 셀 (400 µ L)에 대 한 샘플에 해당 하는 첫 번째 잘 (레드), 주사기 (120 µ L)에 대 한 샘플에 해당 하는 두 번째 잘 (녹색). 3 잘 남아 빈, 그리고 혼합된 샘플 잘 실험 완료 다음이 반환 될 것입니다. 실험 1, 2 및 7 버퍼 버퍼 컨트롤에 있습니다. 실험을 3-5 셀 및 팹 또는 주사기에 ligand (L)에서 당단백질 (P)와 triplicate 실험을 나타냅니다. 실험 6 희석 제어의 ligand 열을 나타내고 데이터 분석 중 실험 3-5에서에서 공제 한다. 하단 패널: 대표적인 원료 (맨 위) 및 가공된 (아래) ITC 데이터 CD22 ECD에 바인딩 팹 (epratuzumab)을 보여주는 HEK293F 세포에서 생산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

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Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...