Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

X-ray Diffraksjon eksperimenter beskrevet i dette dokumentet ble utført med beamlines 08-ID og 08-BM på den kanadiske lyskilde, som støttes av Canada grunnlaget for innovasjon og naturvitenskap Engineering Research Council of Canada, den Universitetet i Saskatchewan, regjeringen i Saskatchewan, Vest økonomisk diversifisering Canada, National Research Council Canada og de kanadiske instituttene of Health Research. Vi ønsker å erkjenne den strukturelle og Biofysiske Core anlegget, The Hospital for syke barn for tilgang til ITC og BLI instrumenter. J.E.O. ble støttet av Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 fra kanadiske institutter for helseforskning. T.S. er en mottaker av en Canada Graduate Scholarship Master's Award og Vanier Canada Graduate stipend fra Canadian institutter for helseforskning. Dette arbeidet ble støttet av opererer stipend PJT-148811 (J.-PJ) fra den kanadiske institutter for helseforskning. Denne undersøkelsen ble foretatt, delvis takket være støtte fra Canada forskning stoler program (J.-PJ).

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Membranen-forankret glykoproteiner er viktig for celle funksjon og attraktive terapeutiske mål. Her presenterer vi en protokoll for strukturelle og Biofysiske karakterisering av ECD av membran glykoproteiner, både alene og i kompleks med små molekyl ligander og Fab fragmenter. Vi har brukt denne protokollen for å finne den krystall strukturen av tre N-terminal-mest Ig domener av den ekstracellulære delen av menneskelig CD2228, en kritisk co reseptor på B celler involvert i å holde humoral immunitet av79. Vi har også preget binding området av CD22 med sin naturlige ligand α2-6 sialyllactose og definert modus for anerkjennelse av en terapeutisk antistoff mot menneskelig CD22. Disse resultatene gi innsikt i struktur-funksjon forholdet mellom et sentralt medlem av den Siglecs familien som har begrenset uttrykk på B celler, og en molekylær veikart mot utviklingen av nye CD22 målrettet små molekyl og antistoff-basert Therapeutics. Mens denne protokollen ble brukt med hell i en Ig inneholder B-celle reseptor, foreslår vi at vår tilnærming kan brukes for strukturelle og Biofysiske karakterisering av en membran glykoprotein med en distinkt domene organisasjon. I slike tilfeller kan du lage design og kombinasjon N knyttet glycan mutasjoner (enten Gln eller Ala) kan vurderes for å finne en konstruksjon for krystall veksten og høy oppløsning Diffraksjon.
Å få en homogen og ren glykoprotein prøve er av avgjørende betydning for krystall veksten og X-ray Diffraksjon og nedstrøms Biofysiske karakterisering. N-koblede glykaner på glykoproteiner er iboende heterogene, og kan forårsake conformational og kjemiske heterogenitet i glykoprotein som kan avskrekke krystall-formasjonen. For å redusere denne mikro-heterogene, kan strategier som innføre punkt mutasjoner for å fjerne Asn rester spådd for å havn N-koblede glykaner eller bruke mutant linjer (for eksempel HEK293S) etterfulgt av behandling med endoglycosidases (for eksempel EndoH) betydelig forbedre krystallisering suksess15,21,22. I denne protokollen diskutere vi rensing av løselig glykoproteiner og produksjonslokaler både som utskilles i celle supernatant. Glykoprotein sekresjon gir en relativt enkel rute mot renhet, uten behovet for cellen lysis eller tillegg av sterke kjemikalier eller rengjøringsmidler. Kjør deretter cellen supernatant, fått følgende cellen høsting direkte over en kolonne som har affinitet for protein av interesse (f.eks Ni-NTA for hans-merket glykoproteiner eller LC affinitet for Fab fragmenter). Imidlertid avhengig av kolonnen og forholdene i cellen supernatant (f.eks pH) kan bindende evnen av protein av interesse for kolonnen påvirkes. Hvis dette er tilfelle, kan det være nødvendig å konsentrere seg og buffer exchange cellen supernatant for å forbedre binding til kolonnen. Videre er det sterkt anbefalt at kvalitetskontroll trinnene under renselsen brukes til å vurdere protein renhet. Kjører en SDS side gel eller Western blot av alle prøver (før, under og etter rensing skritt) kan gi innsikt i om foreslåtte rensing ordningen er egnet for protein av interesse. Hvis forurensende band vises på SDS-side, eller hvis flere arter er innhentet under renselsen (f.eks flere topper på størrelse utelukkelse), ekstra rensing trinnene bør vurderes, f.eks ionebytte Ture, å få i renhet og øke sjansene for nedstrøms krystallisering80.
For macromolecular krystallisering er det ofte avgjørende å få høy avkastning av protein av interesse å tillate screening av et stort antall potensielle krystallisering forhold ved høye protein konsentrasjoner å finne egnet krystall treff. Vanligvis HEK293 celle linjene diskutert her (HEK293F og HEK293S) er robust uttrykk systemer, og kan enkelt skaleres for å produsere flere eksempler som nødvendig. Det er imidlertid mulig at protein rundt ikke kan uttrykke tilstrekkelig i disse linjer. I disse tilfellene andre linjer, for eksempel Expi293 celler81,82, har blitt funnet for å vise overlegne nivåer av protein uttrykk og bør betraktes som et alternativ.
Hvis velorganisert, diffracting krystaller ikke får etter testing av flere konstruksjoner av protein av interesse til tross for høy renhet, kan det være nødvendig å utvide krystallisering teknikker for å fremme dannelse av krystaller. Det har vist at Fab fragmenter av antistoffer og nanobodies kan være utmerket krystallisering enhancers og fremme velordnet krystall pakking83,84,85. Disse fragmentene kan være uttrykt renset til homogenitet og brukt i et kompleks med protein av interesse for å fremme krystallisering. Viktigere, kan Fab fragmenter produsert som beskrevet i paragraf 10 ha en tendens til ikke-fungerende LC dimers86. Disse dimers er forurensning, og bør fjernes under renselsen. I vår erfaring, LC dimers ofte har forskjellige oppbevaring på størrelse eksklusjon, eller elute som en distinkt peak på ionebytte Ture, og dermed kan fjernes fra Fab rensing - men dette ikke er alltid tilfelle. Hvis disse teknikkene er ikke nok å fjerne LC dimers av Fab rensing, kan ekstra rensing metoder, for eksempel Protein G affinitet rensing, brukes til å forbedre renhet.
Alternativ til co-complexation med Fab fragmenter, veldokumenterte teknikker som tilfeldige matriser microseeding kan øke sjansene for å oppnå velordnet krystaller63,70. Denne metoden innebærer tillegg av små mengder knust, suboptimal krystaller i den krystallisering tilstanden, gir en krystall nucleate å fremme krystall veksten. Dette kan utføres med krystaller av proteinet severdigheter, eller de med lignende arkitektur og tertiær domenestruktur. Videre kan tilfeldige matriser microseeding utføres i forsøk på å utkrystallisere protein alene eller i kompleks med en Fab fragment eller små molekyl av interesse. Nylige fremskritt innen cryo-elektronmikroskop også gjøre denne teknikken et attraktivt alternativ til Røntgenkrystallografi for å oppnå høy oppløsning strukturell informasjon for molekyler med aktuelle funksjonene87,88, 89,90,91.
Når utfasing av X-ray Diffraksjon datasett mislykkes av MR, kan HA soaking være nødvendig å løse fase problemet av unormalt spredning eller isomorphous erstatning. Inspeksjon av aminosyresekvens av proteinet kan gi hint om strategien for HA derivatization, inkludert optimal pH for bindingen. Spesielt kan kortet cysteinene i protein spesielt binde HA forbindelser som inneholder kvikksølv. Soaking innfødt krystaller med HA forbindelser er en iterativ prosess til å fastslå identiteten til den optimale HA sammensatt, sin konsentrasjon og nødvendige inkubasjon tiden. Hvis første soaking forsøk ikke gir godt diffracting crystals inneholder en HA egnet for innfasing, kan det hende det nødvendig å innføre aminosyre erstatninger for å forbedre sannsynligheten for HA bindende og forbedre uregelrett signal. Eksempler inkluderer mutasjoner med en gratis cystein rester å effektivt binde Hg, Au, Pt eller Pb. uttrykk for proteiner for uregelrett fase i en seleno-metionin supplert medier i E. coli er mye brukt for uregelrett innfasing, men en tilsvarende system som inkorporerer pålitelig seleno-metionin er ikke lett tilgjengelig for pattedyrceller i suspensjon92,93, og er et område av fremtidig utvikling.
Når unliganded strukturen av glykoprotein rundt er oppnådd, kan soaking krystaller med små molekyl ligander utføres for å få en struktur av immun reseptor-ligand komplekset. Disse dataene gir en blåkopi for rasjonell design av mer spesifikke og høy affinitet ligander som kan brukes som små molekyl therapeutics, samt gir høy oppløsning innsikt i biologisk funksjon av glykoprotein. Når du prøver å suge glykoprotein krystaller med små molekyl ligander rundt, kan inspeksjon av unliganded krystall strukturen indikere om soaking skal være mulig. Hvis nær krystall-pakking kontakter finnes rundt området ligand-bindende eller rundt områder skal gjennomgå conformational endringer på ligand binding, soaking vil sannsynligvis være problematisk. I dette tilfellet skal andre metoder som co-krystallisering av protein-ligand komplekset utføres.

Overflaten proteiner spille viktige roller i cellulære funksjoner. Gjennom det ekstracellulære domenen, kan disse membran proteiner modulerer celle-celle interaksjoner, vedheft, transport og signalisere1,2. Den ekstracellulære lokaliseringen av disse proteinene gjør dem attraktive mål for utviklingen av therapeutics for behandling av en rekke sykdommer, inkludert kreft og autoimmune sykdommer3,4,5 , 6 , 7. en av menneskelig membran proteiner ectodomains vanligste folder er immunglobulin-lignende (Ig) flippen, formet av sju eller flere β-tråder ordnet i to β-ark8,9. Ig-inneholder glykoproteiner er vanligvis flere domener strukturer med Ig domener sekvensielt arrangert på den ekstracellulære delen av membran protein10. Post-translasjonell modifikasjoner av disse celle-overflate proteiner, særlig N - og O-tilknyttet glykosylering, vist seg å spille viktige roller i deres regulering, folding, sekresjon og funksjonen11. For å forbedre vår forståelse av deres funksjon og bedre design legemiddelselskap som kan målrette dem, teknikker er nødvendig som gir mulighet for sine detaljerte molekylær karakterisering. Her presenterer vi en kombinasjon av teknikker som tillater for den Biofysiske (biolayer interferometry (BLI) og isotermiske titrering calorimetry (ITC)) og strukturelle (Røntgenkrystallografi) karakterisering av ekstracellulære domenet Ig inneholder membran glykoproteiner, alene og i kompleks med biologisk relevante ligander og terapeutiske molekyler (figur 1).
N-tilknyttet glykosylering er en av de vanligste post oversettelse modifikasjonene på pattedyr proteiner, og oppstår under protein modning endoplasmatiske retikulum og Golgi12,13. Linjer, som menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, er utviklet for rekombinant uttrykk for store mengder glycosylated pattedyr proteiner14,15. Denne cellen linjen har blitt utviklet i suspensjon format, som tillater enkel skalere opp protein produksjon til større mengder i forhold til tilhenger linjer. Her vi benytter to HEK293 linjer: HEK293F og HEK293 Gnt jeg- / - (HEK293S), som forskjellig ved fravær av N-acetylglucosaminyl transferase jeg (Gnt jeg) i det siste. Igjen produksjon av komplekse glykaner (som sett i HEK293F) er ikke mulig og i stedet høy mannose-type glykaner (hovedsakelig mann5GlcNAc2) bor på N-koblede glycan nettsteder18,19,20 . Hvis du bruker disse to linjer i parallell kan studere effekten av glycan størrelsen og kompleksiteten på biologisk funksjon og terapeutiske mål. Faktisk har glykoproteiner produsert i HEK293F celler større, mer komplekse glykaner sammenlignet med den samme glykoprotein produsert i HEK293S celler. Glykoproteiner produsert i HEK293S celler er mer mottakelig for krystallisering, redusert kjemiske og conformational mangfold i sin N-tilknyttet glykaner. For ytterligere å forbedre crystallizability, glykoproteiner produsert i HEK293S (men ikke HEK293F) celler kan behandles med enzymet endoglycosidase H (Endo H), som resulterer i i spalting av høy mannose glykaner slik at bare en enkelt N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety forblir på hver N-tilknyttet glykosylering området21,22. Andre metoder kan også brukes til å begrense N-glycan behandling i cellene, som tillegg av glycosyltransferase hemmere under glykoprotein uttrykk, inkludert kifunensine23. Alternative tilnærminger involvere uttrykket av innfødte glykoproteiner (i HEK293F celler), etterfulgt av enzymatisk deglycosylation bruker peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Men har deglycosylation med PNGaseF vist seg å være mindre effektive under innfødt forhold og øker samling i noen proteiner; i tilfeller når protein er løselig etter behandling, får den negative avgifter på overflaten på grunn av deamidation av asparagine rester aspartic syre24, som kan være skadelig for sin krystallisering. Anslått N-glykosylering områder kan også være muterte, oftest til alanin eller glutamin rester, å forhindre N-tilknyttet glykosylering på disse stedene og generere glykoprotein prøver av høy homogenitet. Alternativt kan glykoproteiner produseres i andre eukaryote cellekulturer, inkludert gjær, insekt, og plante systemer eller andre pattedyr linjer som kinesiske hamster eggstokkene (CHO) celler16,17.
Mange pattedyr uttrykk vektorer, inkludert pHLsec, tillate utskillelsen av rekombinant glykoprotein ectodomains i celle middels25. Utskillelsen av glykoproteiner fra HEK293 cellene gir rask og enkel rensing uten behov for cellen lysis. Tillegg av rensing tags (f.eks hans-tag, Strep-tag, flagg-tag, Myc-tag, HA-tag) til N eller C endestasjonen til målet glykoprotein renser av en enkeltsteg affinitet kromatografi. Deretter kan størrelse utelukkelse kromatografi brukes til å gi et monodisperse eksempel for Biofysiske og strukturelle karakterisering.
Et svært rent og homogen glykoprotein utvalg under riktige forhold kan medføre godt diffracting krystaller. Når full X-ray Diffraksjon dataset er innhentet fra slike krystaller, må innledende fasene å beregne elektron tetthet av glykoprotein. Takket være et stadig økende antall strukturer i Protein databank (PDB) blitt langt den mest brukte metoden for innfasing molekylær erstatning (MR), som bruker en relaterte proteinstruktur for å få innledende fasene26. Men når MR ikke løse fase problemet, som noen ganger har vært tilfelle for multi-Ig domenet glykoproteiner27,28,29, er alternative metoder nødvendig. I denne artikkelen detalj vi en metode å suge krystaller med tunge atomer (HA) for innfasing, som var nødvendig for å løse strukturen i CD22 ectodomain28. Identifisere høyre HA for innfasing er en iterativ prosess avhengig HA reaktivitet, tilgjengelig atomer i glykoprotein i en gitt krystall gitter og krystallisering løsning30,31. Alternativt, naturlig svovel atomer i cystein og metionin rester kan brukes for innfasing hvis tilstede i høy nok forholdet til andre atomer i glykoprotein og X-ray Diffraksjon data kan hentes med høy nok redundans32, 33.
Biologiske funksjonen av membran glykoproteiner er ofte formidlet av protein-protein interaksjoner eller protein-ligand interaksjoner, som karbohydrater. Når ligand er liten nok å spre fra løsningen til glykoprotein bindende nettsted i crystal gitteret, kan soaking eksperimenter være vellykket å få en glykoprotein-ligand co krystallstruktur å forstå ligand anerkjennelse.
Protokollene som presenteres her er også relevant for å forstå samspillet av overflate glykoproteiner med syntetisk terapeutiske ligander34,35 og antistoff therapeutics36,37. Kombinert med strukturinformasjon, kan bindende kinetics og termodynamikk være kraftig til å forstå og forbedre deres virkningsmekanismer. En teknikk som gir kinetisk analyse av terapeutiske antistoffer binding til en glykoprotein er BLI38,39. BLI bruker biosensors med en immobilisert ligand for å måle association og dissosiasjon kinetics med bindende partner, til slutt å avgjøre en likevekt dissosiasjon konstant (KD). BLI er en attraktiv fordi små mengder glykoproteiner kreves (< 100 µg), eksperimentet er rask (~ 10-15 minutter per kjørt), og det kan automatiseres. ITC er også nyttig for å studere slektskap mellom glykoproteiner og bindende, partnere,40,,41,,42,,43. Mens ITC er mer tid og reagens intensiv, kan verdifull informasjon fås om termodynamikken for samhandlingen (ΔG, ΔH, ΔS og støkiometri). ITC er også svært nyttig for å studere svake interaksjoner som er ofte forbundet med forbigående binding av overflate glykoproteiner til ligander. Videre kan disse teknikkene brukes sammen til å evaluere binding av ulike konstruksjoner og evaluere effekten av ulike N-tilknyttet glycoforms innhentet fra uttrykke glykoprotein i forskjellige linjer. Utføre BLI og ITC med glykoproteiner produsert i HEK293F, HEK293S og behandlet med Endo H, gir en detaljert visning av rollen glykaner i biologiske aktivitet og terapeutiske engasjement.
Vi brukt har disse protokollene betegner den ekstracellulære domenet (ECD) til menneskelig CD2228medlem glykoprotein Noctuinae sialic acid-bindende Ig-lignende lectins (Siglecs) som er nødvendig for å opprettholde B-celle homeostase44 . Vi utført detaljert konstruere design for å lette krystallisering og faset X-ray datasettet av HA soaking med Hg. Vi også gjennomvåt CD22 krystaller med sin ligand sialic syre (α2-6 sialyllactose) å få en struktur av immun reseptor-ligand komplekset og dermed gitt blåkopier for struktur-guidede utformingen av glycan mimetics45,46. I tillegg vi generert fragment antigen binding (Fab) av anti-CD22 terapeutiske antistoff epratuzumab - en terapeutisk kandidat i fase III kliniske studier for non-Hodgkins lymfom47- for å finne sin forpliktende tilhørighet av BLI og ITC til ulikt glycosylated CD22 ECD lager. Disse studiene viste en avgjørende rolle for N-tilknyttet glykosylering i epratuzumab engasjement, med mulige konsekvenser for CD22 anerkjennelse på dysfunksjonelle B celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Glykoproteiner på overflaten av cellene spille viktige roller i cellulære funksjoner, inkludert signalisere, vedheft og transport. På leukocytter, flere av disse glykoproteiner har immunglobulin (Ig) folder og er sentralt immun anerkjennelse og regulering. Her presenterer vi en plattform for design, uttrykk og Biofysiske karakteristikk av den ekstracellulære domenet av menneskelig B celle reseptor CD22. Vi foreslår at disse tilnærmingene lag gjelder karakterisering av pattedyr glykoprotein ectodomains som inneholder Ig domener. To suspensjon menneskelige embryonale nyre (HEK) cellelinjer, HEK293F og HEK293S, brukes til å uttrykke glykoproteiner harbouring komplekse og høy-mannose glykaner, henholdsvis. Disse rekombinant glykoproteiner med forskjellige glycoforms kan undersøke effekten av glycan størrelse og sammensetning ligand bindingen. Vi diskutere protokoller for studere kinetics og termodynamikk av glykoprotein binding til biologisk relevante ligander og terapeutiske antistoff kandidater. Rekombinant glykoproteiner produsert i HEK293S celler er mottakelig for krystallisering glycan homogenitet, redusert fleksibilitet og mottakelighet for endoglycosidase H behandling. Vi presenterer metoder for bløtlegging glykoprotein krystaller med tunge atomer og små molekyler for fase besluttsomhet og analyse av ligand binding, henholdsvis. Eksperimentell protokollene diskutert avholde her Love for karakterisering av pattedyr glykoproteiner å gi innsikt i deres funksjon og undersøke virkningsmekanismen av therapeutics.

Flere konstruksjoner av CD22 ECD var vellykket klonet i pHLsec uttrykk vektor og overexpressed i pattedyr HEK293F og HEK293S linjer (figur 2 og 3A). Alle konstruksjoner var renset til størrelse homogenitet av størrelse utelukkelse kromatografi og gitt en svært ren prøve for krystallisering studier (figur 3B og 3 C). Den CD22 konstruksjonen som førte til godt diffracting krystaller var d1-d3 trunkering (rester 20-330), med fem av seks spådd N-tilknyttet glykosylering nettsteder mutert fra Asn til Ala (N67A, N112A, N135A, N164A og N231A), produsert i HEK293S celler, slik at bare webområdet glykosylering posisjonen N101 ble beholdt (denne konstruksjonen er oppkalt CD2220-330, 5A). Krystaller ble oppnådd i flere forhold av MCSG-1 spredt matrise skjermen, men de beste krystallene var fra en tilstand med 30% (w/v) polyetylenglykol 4000 og 0,2 M litium klorid 0.1 M Tris, pH 8.5. Disse innfødt krystaller diffracted 2.1 Å oppløsning; bruke kjente strukturer av Ig domener av relaterte Siglec proteiner ikke gi noen løsninger i MR søk.
For å erverve innfasing informasjon, gjennomvåt vi innfødte krystaller med en HA forbindelser som inkludert Hg, Pt, Os, Ta og Br konsentrasjonene varierer fra 1-20 mM HA sammensatte i inkubasjon tid fra 5 min 1 d (Figur 4). Vi overvåket krystaller for endringer i morfologi, og fant at krystaller fuktet med HA ved 20 mM resulterte i rask sprengning og oppløsning av krystall. Vi frøs totalt 63 krystaller som beholdt sin form etter angi inkubasjon ganger var dynket med Tantal bromide klynge, platina klorid, kvikksølvsalter acetate og mercuric chloride. Krystaller fuktet med 7 mM mercuric chloride i 30 min viste uregelrett signal på en fluorescens skanning på den kanadiske lys kilde (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) og tillatt for flere bølgelengde uregelrett spredning X-ray datainnsamling på en enkelt krystall. Disse datasett tillatt oss å løse kvikksølv underkonstruksjonen av CD2220-330, 5A, som viste en enkelt kvikksølv atom bundet til en gratis cystein posisjonen C308 og til slutt tillatt oss å bygge strukturen i CD2220-330, 5A i den gradvis elektron tetthet kart benytter AutoBuild78.
Når unliganded strukturen ble løst, var vi interessert i å løse strukturen til CD22 bundet til sin ligand, α2-6 siallylactose. Vi først beregnes slektskap av CD22 mot α2-6 sialyllactose med ITC for å karakterisere bindende termodynamikken for samhandlingen. Vi observerte en affinitet av ~ 280 µM og brukte denne informasjonen til å identifisere en innledende konsentrasjon (~ 100 x KD) av ligand til bruk for dryppende av våre innfødte CD2220-330, 5A krystaller. Vi gjennomvåt CD2220-330, 5A krystaller med 25 mM siallylactose for 5 min, 2 timer, 14 h, 40 h og 5 d og overvåkes for endringer i crystal morfologi. Totalt ~ 75 krystaller var frosset fra ulike tidspunkt og sendte CLS synchrotron beamline 08-IDen (Saskatoon, Canada) for ekstern datainnsamling. Totalt seks X-ray datasett ble Hentet fra godt diffracting krystaller. Strukturen fra hver X-ray datasett ble løst av MR bruker unliganded CD2220-330, 5A struktur som en første søket modell. Den resulterende elektron tettheten for alle datasett ble deretter inspisert for positiv tetthet i Fo-Fc kartet som ville svarer bundne α2-6 sialyllactose innen området binding av CD22. Bemerkelsesverdig, alle datasett samlet, selv de fra krystaller gjennomvåt etter bare 5 min incubation tid, inneholdt positiv tetthet tilsvarer ligand binding området. Generelle strukturer av unliganded og liganded CD22 var svært lik med minimal conformational endringer, som kan forklare suksessen til soaking eksperimenter med α2-6 sialyllactose.
Vi neste preget antigen overflaten av CD22 anerkjent av terapeutiske antistoff epratuzumab BLI og ITC eksperimenter (figur 5). Kinetics og termodynamikk profiler av epratuzumab Fab binding til CD22 konstruksjoner med forskjellige glycoforms viste en økende affinitet til CD22 med redusert N knyttet glycan størrelse, med opp til en 14-fold forbedring i affinitet for mindre glykaner (327 nM vs 24 nM i BLI; 188 nM vs 58 nM i ITC). CD22 N-koblede glycan begrense tilgangen for antistoffer mot sin epitope ble identifisert ved å BLI med ett-punkts mutanter av CD22 og løse epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co krystall struktur28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figur 1 . Oversikt over glykoprotein karakterisering fra konstruere design til Biofysiske og strukturelle karakterisering. (1) primære sekvens analyse av representant glykoprotein. Grå, den ekstracellulære domenet (ECD); i grønt, transmembrane (TM) segmentet; og i blått, glykoprotein cytosolic domenet. Anslått N-koblede glykaner er merket. (2) kloning av ECD konstruksjoner. (3) uttrykk for ECD konstruksjoner i pattedyrceller. (4) glykoprotein rensing. Mens proteiner i HEK293F vil inneholde komplekse glykaner, har proteiner i HEK293S høy mannose glykaner. Enzymatisk behandling av glykoproteiner produsert i HEK293S celler med Endo H gir glykoproteiner med bare GlcNAc moiety på N-tilknyttet glykosylering nettsteder. (5a) glykoproteiner er testet for sin binding til antistoffer av biolayer interferometry (BLI) og isotermiske titrering calorimetry (ITC). Affinitet til små ligander kan også måles ved ITC. (5b) krystallisering forsøk av glykoproteiner med homogen N-tilknyttet glykaner, som uttrykt i HEK293S og deglycosylated med Endo H. (6) i noen tilfeller mutasjon av N-tilknyttet glykosylering nettsteder er nødvendig for å oppnå krystaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figur 2 . Utformingen av CD22 ectodomain DNA konstruerer uttrykk i pattedyrceller. A) representasjon av pHLsec plasmider brukes til midlertidig transfection av CD22 ECD konstruksjoner. AgeI og KpnI områder brukes for kloning angis med røde bokser. B) The CD22 ECD inneholder syv Ig domener (d1-d7) og 12 spådd N-tilknyttet glykosylering steder (i blått). Fire konstruksjoner er utviklet CD22 ECD. C) 1% agarose gel viser PCR amplicons av CD22 ECD konstruerer for kloning i pHLsec pattedyr uttrykk vektor. Første lane inneholder 1 kb DNA markør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figur 3 . Uttrykket og rensing av glykoproteiner. A) effekten av cellen tetthet på uttrykk gir. Glykoprotein uttrykk i småskala 25 mL kultur HEK293F suspensjon celler transfekterte bruker tre ulike Start tettheter av celler (0.5 x 106 celler mL-11.0 x 106 celler mL-1og 1,5 x 106 celler mL -1). Kvantifisering utført av densitometry fra SDS-side i informasjonsvinduet og kvantitative BLI i høyre panel. Verdiene er representant for en glykoprotein forberedelse. B) Chromatogram av første rensing skritt for konstruere CD2220-330, 5A fra 600 mL av nedbryting bruker en Ni-NTA affinitet kolonne. Glykoprotein var elut ved hjelp av en gradient imidazole (grå linje), der 100% tilsvarer elueringsbufferen, som inneholder 500 mM imidazole. Grupperte fraksjoner er avbildet med loddrette linjer. C) størrelse-utestenging chromatogram for konstruere CD2220-330, 5A bruker en høy-ytelse gel filtrering kolonnen. Grupperte fraksjoner elueringsrør toppen er avbildet med loddrette linjer. Innfelt: Coomassie-farget SDS side gel viser renheten av glykoprotein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figur 4 . Crystal soaking med tunge atomer. A) eksempel arbeidsstasjon for bløtlegging innfødt krystaller med HA forbindelser. Alle nødvendige verktøy er merket. B) trinn følges for å suge krystaller av konstruere CD2220-330, 5A med HA forbindelser. Trinn 1åpne godt som inneholder krystaller og overføre krystaller med en løkke til en 0,2 µL slipp på en cover slip som inneholder HA løsning utvannet krystallisering tilstanden slik at den endelige konsentrasjonen av HA varierer fra 1-10 mM. Trinn 2, seal fall i krystallisering platen og ruge krystaller med HA sammensatt for ulike perioder. Trinn 3, montere gjennomvåt krystall i ledd og rygg-suge for 30 s i tre påfølgende 0,2 µl dråper som inneholder mor brennevin løsningen med 20% (v/v) glyserol utlevert på en cover slip. Trinn 4, flash fryse krystall montert på en sløyfe med flytende nitrogen og plassere den i en puck for forsendelse til synchrotron beamline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figur 5 . Biolayer interferometry og isotermiske titrering calorimetry målinger. A) representant BLI eksperiment. Toppanelet: eksempel på plate oppsett for et kinetics eksperiment, der følgende merket: 1 x kinetics buffer (B), hans6 x-merket glykoprotein lasting (L), representant Fab konsentrasjoner (500, 250, 125, 62,5 nM), PBS + 500 mM gjenfødelse buffer (R) og 1 x kinetics nøytralisering bufferen (B). Hvert inneholder også 200 µL av løsning. Trinnummeret for kinetics eksperimentet angis på toppen av platen. Midt-panelet: Representant rådata om BLI eksperiment utført ved hjelp av Ni-NTA biosensors og plate beskrevet i toppanelet. Trinn tallene tilsvarer planlagt (1), hans6 x glykoprotein lasting (2), planlagte (3), association i seriell fortynning av Fab (4) og dissosiasjon (5). Gjenfødelse trinnene er ikke representert (trinn 6-7). Nedre panelet: Representant analysert data som viser rå association og dissosiasjon (blå linje) med tilhørende 1:1 passer (rød linje). B) toppanelet: representant plate oppsettet for en enkelt ITC kjøre på en automatisert ITC instrument med syv eksperimenter i en 96-brønns rundt nederst-blokker. Hvert eksperiment består av tre brønner. Den første brønnen (rød) tilsvarer utvalg for cellen (400 µL), andre brønnen (grønn) tilsvarer utvalg for sprøyten (120 µL). Tredje også er tomt, og blandet prøvene vil bli returnert til dette godt etter fullførelse av eksperimentet. Eksperimenter 1, 2 og 7 er buffer i bufferen kontroller. Eksperimenter 3-5 representerer tre eksemplarer eksperimenter med glykoprotein (P) i cellen og Fab eller ligand (L) i sprøyten. Eksperimentet 6 representerer en ligand varme fortynning kontroll og skal trekkes fra eksperimenter 3-5 under dataanalyse. Nedre panelet: Representant rå (øverst) og behandlet (nederst) ITC data viser Fab (epratuzumab) binding til CD22 ECD produsert i HEK293F celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Ved biolayer interferometry, isotermiske titrering calorimetry og Røntgenkrystallografi presenterer vi tilnærminger for Biofysiske og strukturelle karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin fold.

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

Liquids, Solids, and Intermolecular Forces

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Visualisering av østrogenreseptorer i kolon av mus med TNBS-indusert Crohns sykdom ved hjelp av immunofluorescens

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturell bestemmelse av et enzym:Substrat kompleks av seriell krystallografi i en allsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

De automatiserte krystallografirørledningene ved EMBL HTX-anlegget i Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...