Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Рентгеновской дифракции эксперименты, описанные в этом документе были проведены с использованием излучение 08-ID и 08-BM в канадской источник света, который поддерживается Канадский фонд для инноваций, естественных наук и инженерных исследований Совета Канады, Саскачеванский университет, правительство Саскачевана, Западной экономической диверсификации Канады, Национальный исследовательский совет Канады и канадской институтов медицинских исследований. Мы хотели бы признать структурных и биофизических Core объекта, больница для больных детей, для доступа к документам, ЦМТ и BLI. J.E.O. поддержал, Banting докторантура стипендий БНФ-144483 от канадской институтов медицинских исследований. Т.с. является получателем из Канады выпускник стипендию магистра премии и Ванье Канада выпускник стипендию от канадской институтов медицинских исследований. Эта работа была поддержана действующих грантов PJT-148811 (J.-P.J.) из канадского институтов здравоохранения исследования. Это исследование было проведено, в частности, благодаря финансированию из Канады научно-исследовательскими кафедрами программы (J.-P.J.).

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Якорь мембранных гликопротеинов имеют решающее значение для функции клеток и привлекательным терапевтических целей. Здесь мы представляем протокол для структурного и биофизические характеристики ECD мембранных гликопротеинов, как самостоятельно, так и в комплексе с малых молекул лигандов и Fab фрагментов. Мы успешно использовали этот протокол для определения кристаллической структуре трех доменов N-терминал большинство Ig внеклеточного части человеческого CD2228, критических ко-рецептор на B клеток, участвующих в поддержании гуморального иммунитета в проверить79. Мы также характеризуется сайт связывания CD22 с его естественным ligand α2-6 sialyllactose и определен режим распознавания терапевтических антител к человеческой CD22. Эти результаты обеспечивают понимание структуры функция отношения ключевым членом семьи Siglecs, которая ограничила выражение B клеток и молекулярные дорожную карту к развитию новых CD22 целевых малые молекулы и на основе антител терапии. Хотя этот протокол был успешно использован для Ig содержащих B-клеточный рецептор, мы предлагаем, что наш подход может быть применен для структурного и биофизические характеристики любого мембраны гликопротеин с собственный домен организации. В таких случаях Постройте дизайн и комбинаторные N-связаны glycan мутации (либо Gln или Ала) может оцениваться найти конструкция подходит для роста кристаллов и высоким разрешением дифракции.
Получение однородной и чистой гликопротеина образец имеет решающее значение для роста кристаллов и дифракции рентгеновских лучей, а также ниже по течению биофизические характеристики. N-связаны гликанов на гликопротеинов неразрывно разнородные и может вызвать конформационные и химической неоднородности в пределах гликопротеин, который может сдерживать формирования кристалла. Чтобы уменьшить этот микро неоднородность, стратегии, которые вводят точечные мутации для удаления остатков Asn, предсказал гавань гликанов N-связаны, или с помощью мутант клеточных линий (например, HEK293S) следуют лечение с endoglycosidases (например, Эндо) может значительно улучшить кристаллизации успех15,21,22. В этом протоколе мы обсуждаем очистки растворимых гликопротеинов и фабрики, которые сделаны секретным в ячейку супернатант. Гликопротеин секрецию обеспечивает сравнительно простой маршрут к чистоте, без необходимости для лизиса клеток или добавления агрессивных химикатов или моющие средства. Клетки супернатанта, полученные следующие ячейки уборки затем запускается непосредственно над столбцом, который имеет сродство для протеина интереса (например, Ni-НТА для его меткой гликопротеинов, или LC сродство для Fab фрагментов). Однако в зависимости от столбце использования и условий супернатанта ячейки (например, рН), возможность привязки протеина интереса к столбцу могут быть затронуты. Если это так, это может быть необходимо сосредоточиться и буфера обмена ячейки супернатанта улучшить привязки к столбцу. Кроме того настоятельно рекомендуется, что меры контроля качества во время очистки использоваться чтобы помочь оценить чистоту белка. Запуск геля SDS-PAGE или западную помарку всех образцов (до, во время и после очистки шагов) может дать понимание того, подходит ли схема предлагаемой очистки для протеина интереса. Если загрязняющие полос видны на SDS-PAGE, или если несколько видов получаются во время очистки (например, несколько пиков на размер исключения), следует рассмотреть шаги дополнительной очистки, например, ионообменной хроматографии, чтобы получить в чистоту и увеличить шансы течению кристаллизации80.
Для высокомолекулярных кристаллизации часто решающее значение для получения высоких урожаев протеина интереса для скрининга большое количество потенциальных условий кристаллизации в концентрациях, высоким содержанием белка позволяет найти подходящие кристалл хитов. Как правило HEK293 клеточных линий, обсуждали здесь (HEK293F и HEK293S) являются надежной выражение систем и может быть легко масштабируется производить больше образца при необходимости. Однако вполне возможно, что протеин интереса не могут достаточно выразить в пределах этих клеточных линий. В этих случаях других клеточных линий, таких как клетки Expi293,8182, были найдены показать улучшенный уровень экспрессии белков и следует рассматривать как альтернативу.
Если упорядоченной, Дифрагирующая кристаллы не получаются после тестирования нескольких конструкций протеина интереса несмотря на высокой чистоты, это может быть необходимо расширить кристаллизации методов для поощрения формирования кристалла. Было показано, что Fab фрагментов антитела и nanobodies может быть отличным кристаллизации усилители и содействовать упорядоченной кристалл упаковки83,,8485. Эти фрагменты можно выразил и очищен до однородности и используется в комплексе с белками, представляющих интерес для поощрения кристаллизации. Важно отметить, что Fab фрагментов, как описано в разделе 10 может иметь тенденцию сформировать нефункциональные LC димеры86. Эти димеры являются и должны быть удалены во время очистки. В нашем опыте LC димеры часто имеют разные удержания тома на размер изоляции, или элюировать как собственный пик на ионообменной хроматографии и таким образом, могут быть удалены от Fab очистки -, однако это не всегда так. Если эти методы являются недостаточными для удаления димеры LC от Fab очистки, методы дополнительной очистки, такие как белок G очищение сродства, могут быть использованы для улучшения чистоты.
Альтернативой co комплексообразованию с Fab фрагментов, хорошо документированных методов, таких как случайная матрица microseeding может повысить шансы получения упорядоченного кристаллы63,70. Этот метод включает в себя добавление небольшое количество измельченных, субоптимальный кристаллов в состояние кристаллизации, обеспечивая кристалл nucleate для поощрения роста кристалла. Это можно выполнить с использованием кристаллов протеина интереса, или те, с аналогичными архитектуры и третичные структуры доменов. Кроме того случайная матрица microseeding может выполняться в попытках кристаллизации белка самостоятельно или в комплексе с Fab-фрагмент или малые молекулы интерес. Последние достижения в крио электронная микроскопия также делают эту технику привлекательной альтернативой рентгеноструктурного анализа для получения высокого разрешения структурной информации для молекул с соответствующей функции87,88, 89,,9091.
Когда поэтапного дифракции рентгеновских лучей наборов данных не удается, MR, замачивания ха может быть необходимо решить проблему этапа аномальных дисперсии или Изоморфное замены. Инспекция по аминокислотной последовательности белка может предоставить подсказки о стратегии для деривации га, в том числе оптимальный рН для привязки. В частности непарные которым внутри белка конкретно можно привязать HA соединений, содержащих ртуть. Замачивания родной кристаллы с ха соединений является итеративный процесс для определения личности оптимальный комплекс HA, его концентрация и время необходимые инкубации. Если первоначальные попытки замачивания не дают хорошо Дифрагирующая кристаллы, содержащие HA, подходящих для постепенного, это может быть необходимо ввести аминокислотных замен для повышения вероятности HA привязки и улучшения аномальных сигналов. Примеры включают мутации включить бесплатно хвоща остатков для эффективной привязки Hg, Au, Pt или Pb. экспрессия белков для аномального поэтапно селено метионина дополнены СМИ в E. coli широко используется для аномального поэтапного, однако Аналогичная система, которая надежно включает селено метионина не доступны для mammalian клеток в подвеска92,93и область будущего развития.
Получив unliganded структура гликопротеина интерес, замачивания кристаллы с малых молекул лигандов может выполняться для получения структура комплекса иммунной рецептор лиганд. Эти данные служат основой для рациональной разработки более конкретными и высокоспецифичные лиганды, которые могут использоваться как мелкомолекулярных терапии, а также обеспечивает высокое разрешение понимание биологической функции гликопротеина. При попытке отдохнуть гликопротеин кристаллы с малых молекул лигандов интерес, инспекции unliganded Кристаллическая структура может указывать ли замачивания должно быть возможным. Если закрыть кристалл упаковка контакты находятся вокруг лиганд привязки сайта или вокруг областей, пройти конформационные изменения после лигандом привязки, замачивание может быть проблематичным. В этом случае должны быть выполнены другие методы, такие как сопредседатель кристаллизации белка лиганд комплекса.

Поверхностные белки играют решающую роль в клеточных функций. Через их внеклеточных доменов эти мембранных белков может модулировать ячеек взаимодействий, адгезии, транспорта и сигнализации1,2. Внеклеточные локализации этих белков делает их привлекательной цели для развития терапии для лечения широкого спектра заболеваний, включая рак и аутоиммунные заболевания3,4,5 , 6 , 7. одним из наиболее распространенных складки человека мембранных белков ectodomains является иммуноглобулина как раз (Ig), который формируется семь или более β-стренги аранжированы в двух β-листы8,9. Как правило Ig содержащих гликопротеинов являются мульти доменных структур с доменами Ig, последовательно расположенных на внеклеточные часть мембранных белков10. Было показано, что столб-поступательные изменения этих белков клетк поверхности, особенно связанных с N и O гликозилирования, играть существенную роль в их регулирования, складывающиеся, секреции и функции11. Для улучшения нашего понимания их функции и лучше дизайн терапии, которые можно ориентировать их, требуются методы, позволяющие их подробные молекулярная характеристика. Здесь мы представляем сочетание методов, которые позволяют для биофизических (biolayer интерферометрии (BLI) и изотермические титрования калориметрии (ЦМТ)) и структурных (рентгеноструктурного) Характеристика внеклеточного домена Ig содержащих мембранных гликопротеинов, самостоятельно и в комплексе с их биологически соответствующих лигандов и терапевтические молекулы (рис. 1).
N-связаны гликозилирования является одним из наиболее распространенных изменения после перевода на млекопитающих белки и происходит во время созревания белка в эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи12,13. Клеточных линий, таких как 293 клеток человеческого эмбриона почек (ГЭС), были разработаны для рекомбинантных выражение большого количества гликозилированного млекопитающих белки14,15. Эта линия клетки был разработан в формате подвеска, который позволяет для удобства наращивания производства белок в больших количествах по сравнению с линии адэрентных клеток. Здесь, мы используем две линии клетки HEK293: HEK293F и HEK293 Gnt я- / - (HEK293S), которые отличаются отсутствием трансферазы N-acetylglucosaminyl I (Gnt я) в последнем. В свою очередь производство сложных гликанов (как увидено в HEK293F) не представляется возможным и вместо высоких маннозы тип гликанов (преимущественно человек5GlcNAc2) проживают в N-связаны glycan сайты18,19,20 . Использование этих двух клеточных линий параллельно позволяет изучать влияние glycan размера и сложности на биологические функции и терапевтические ориентации. Действительно гликопротеинов, производимых в HEK293F клетках будет иметь более крупных, более сложных гликаны, по сравнению с же гликопротеин, производимых в HEK293S клетках. Гликопротеины, производимых в HEK293S клетках больше поддаются кристаллизации, из-за сокращения химических и конформационные неоднородности их N-связаны гликанов. Для дальнейшего повышения crystallizability, гликопротеинов, производятся в HEK293S (но не HEK293F) клетки можно лечить с помощью фермента endoglycosidase Ч (Endo), что приводит к декольте высокой маннозы гликанов такие, что только один N-acetylglucosamine (GlcNAc) остаток остается на каждый сайт гликозилирования связанные N21,22. Другие методы также может использоваться для ограничения потребления ресурсов обработкой N-glycan внутри клетки, такие как добавление ингибиторов гликозилтрансферазы во время выражения гликопротеин, включая kifunensine23. Альтернативные подходы включают выражения родной гликопротеинов (в HEK293F клетках) на ферментативную deglycosylation, используя пептиды N-гликозидазы F (PNGaseF). Однако deglycosylation с PNGaseF было показано, быть менее эффективной в родной условиях и увеличивает агрегации в некоторых белков; в тех случаях, когда белок остается растворимых после лечения, он приобретает негативные расходы на его поверхности из-за deamidation аспарагин остаток аспарагиновой кислоты24, которая может быть пагубным для его кристаллизации. Предсказал N-гликозилирования сайты могут также быть мутировал, чаще всего аланина или глютамина остатков, для предотвращения связанных с N гликозилирования на этих сайтах и генерировать гликопротеина образцы высокой однородности. Кроме того гликопротеины может производиться в других эукариотических клеточных культурах, включая дрожжей, насекомое и систем растений или других млекопитающих клеточных линий, например китайского хомяка яичников (Чо) клетки16,17.
Многие векторы млекопитающих выражения, включая pHLsec, позволяют секрецию рекомбинантных гликопротеин ectodomains в клетки средних25. Секрецию гликопротеинов из HEK293 клеток позволяет для быстрой и легкой очистки без необходимости лизис клеток. Добавление тегов очистки (например, его тег, Strep тег, флаг тег, Myc-, ха тег) N или C конечной цели гликопротеина позволяет очистки хромотографией сродства пошагово. Впоследствии гель-проникающей хроматографии размера может использоваться для принести монодисперсных образца для биофизических и структурных характеристик.
Очень чистые и однородные гликопротеина образца при соответствующих условиях может привести к хорошо Дифрагирующая кристаллов. После получения набора данных полный дифракции рентгеновских лучей от таких кристаллов начальные этапы должны определяться для расчета плотности электронов гликопротеина. Благодаря все большее количество структур в банк данных белков (PDB) наиболее часто используемый метод для постепенного на сегодняшний день стала молекулярной замены (MR), который использует структуру соответствующих белков для получения начальных этапов26. Однако когда Мистер не удается решить проблему фазы, как иногда случае для мульти Ig домена гликопротеинов27,28,29, требуются альтернативные методы. В этой статье мы подробно метод замочить кристаллы с тяжелых атомов (HA) для постепенного, который необходим для решения структуры CD22 ectodomain28. Выявление право HA для постепенного это итеративный процесс, который зависит от реактивности HA, доступные атомов в гене гликопротеина в иной кристаллической решетки и кристаллизации раствора30,31. В качестве альтернативы атомы естественным серы в метионина и цистеина остатков может быть использован для поэтапного Если присутствующие на достаточно высокий коэффициент для других атомов в гене гликопротеина, и если рентгеновская дифрактометрия данные могут быть собраны с достаточно высокой избыточности32, 33.
Биологические функции мембранных гликопротеинов часто опосредовано белок белковых взаимодействий или взаимодействий протеин лиганд, такие как углеводы. Когда лигандом является достаточно небольшим, чтобы диффундируют из решения на сайт связывания гликопротеина в кристаллической решетке, замачивания экспериментов может быть успешным для получения совместного Кристаллическая структура гликопротеин лиганд лучше понять лигандом признание.
Протоколы, представленные здесь также актуальны для понимания взаимодействия поверхностных гликопротеинов с синтетических лечебная лигандам34,35 и антитела терапии36,37. В сочетании с структурной информацией, привязка кинетика и термодинамика может быть мощным, чтобы понять и усовершенствовать их механизмы действий. Один метод, который позволяет для кинетического анализа терапевтических антител, привязка к гликопротеин — BLI38,39. BLI использует биодатчики с иммобилизованными лигандом для измерения кинетики ассоциации и диссоциации с партнером привязки, в конечном счете определить константу равновесия диссоциации (DK). BLI является привлекательным подход, потому что небольшое количество гликопротеинов требуются (< 100 мкг), эксперимент время быстро (~ 10-15 мин на запуск), и он может быть автоматизирован. ЦМТ также полезна для изучения сходства между гликопротеинов и привязки партнеров40,,4142,43. Хотя ЦМТ больше времени и реагента интенсивный, можно получить ценную информацию относительно Термодинамика взаимодействия (ΔG, ΔH, ΔS и стехиометрии). ЦМТ также очень полезно для изучения слабых взаимодействий, которые часто связаны с временной привязкой поверхностных гликопротеинов с лигандами. Кроме того эти методы можно использоваться совместно оценить привязки различных конструкций и оценить эффект различных связанных с N glycoforms, полученные от выражения гликопротеина в различных клеточных линий. Выполнение BLI и МТЦ с гликопротеинами производится в HEK293F, HEK293S и относились с Endo H может обеспечить углубленный обзор роли гликанов в биологической активности и терапевтические взаимодействия.
Мы успешно применяются эти протоколы характеризовать внеклеточного домена (ECD) человека CD2228, гликопротеин, членом семьи лектинов (Siglecs) Ig подобных сиаловая кислота привязки, который необходим для поддержания гомеостаза B-клеточной44 . Мы выступали углубленного конструкция конструкция для облегчения кристаллизации и постепенно рентгеновского dataset путем замачивания с Hg HA. Мы также пропитанной CD22 кристаллы с его лиганда сиаловая кислота (α2-6 sialyllactose) для получения структура комплекса иммунной рецептор лиганд и таким образом обеспечили чертежи для разработки структуры руководствуясь glycan mimetics45,46. Кроме того, мы создали связывание антигена фрагмент (ФАБ) epratuzumab терапевтических антител анти CD22 - терапевтические кандидат в настоящее время фазы III клинических испытаний для неходжкинской лимфомы47- определить его сродство к BLI и ЦМТ дифференциально гликозилированного CD22 ECD конструкции. Эти исследования выявили важную роль для N-связаны гликозилирования в epratuzumab взаимодействия, потенциальные последствия для распознавания CD22 на неблагополучных клетки B.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Гликопротеинов на поверхности клеток играют решающую роль в клеточных функций, включая сигнализации, адгезии и транспорта. На лейкоциты некоторые из этих гликопротеинов обладают складки иммуноглобулина (Ig) и центральную роль иммунного распознавания и регулирование. Здесь мы представляем платформу для дизайна, выражения и биофизические характеристики внеклеточного домена рецептора CD22 B клеток человека. Мы предлагаем, что эти подходы широко применяются для характеризации ectodomains млекопитающих гликопротеин, содержащий Ig доменов. Два подвеска человеческих эмбриональных почек (ГЭС) клеточных линий, HEK293F и HEK293S, используются для выражения гликопротеинов, укрывательство комплекс и высокой маннозы гликаны, соответственно. Эти рекомбинантных гликопротеинов с различными glycoforms позволяют расследования эффект glycan размера и состава на Связывание лиганда. Мы обсуждаем протоколы для изучения кинетика и термодинамика гликопротеина привязки биологически соответствующих лигандов и терапевтических антител кандидатов. Рекомбинантных гликопротеинов, производимых в HEK293S клетках поддаются кристаллизации вследствие однородности glycan, снижение гибкость и восприимчивость к endoglycosidase H лечения. Мы представляем методы для замачивания гликопротеина кристаллы с тяжелых атомов и малых молекул для этапа определения и анализа Связывание лиганда, соответственно. Экспериментальные протоколы обсудили здесь перспективны для характеристики млекопитающих гликопротеинов дать проницательность в их функции и исследовать механизм действия терапевтических средств.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Мы представляем подходы для биофизических и структурные характеристики гликопротеины с складке иммуноглобулина biolayer интерферометрии, изотермические титрования калориметрии и рентгеноструктурного анализа.

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

Liquids, Solids, and Intermolecular Forces

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Визуализация рецепторов эстрогена в колонах мышей с TNBS-индуцированной болезнью Крона с использованием иммунофлюоресценции

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

Автоматизированные кристаллографические трубопроводы на заводе EMBL HTX в Гренобле

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...