Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Röntgendiffraktion experiment som beskrivs i denna uppsats utfördes med linjer 08-ID och 08-BM på den kanadensiska ljuskällan, som stöds av stiftelsen Kanada för Innovation, naturliga vetenskaper och Engineering Research Council of Canada, den University of Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, västra ekonomisk diversifiering Kanada, Kanadas National Research rådets och de kanadensiska instituten av hälsoforskning. Vi skulle vilja erkänna de strukturella & biofysiska Core Facility, sjukhuset för sjuka barn, för tillgång till instrument som ITC och BLI. J.E.O. stöddes av Banting postdoc Fellowship BPF-144483 av kanadensiska institut för hälsa forskning. T.S. är mottagare av en Kanada Graduate stipendium Master Award och Vanier Kanada Graduate stipendium av kanadensiska institut för hälsa forskning. Detta arbete stöds av löpande bidrag PJT-148811 (J.-P.J.) av kanadensiska institut för hälsa forskning. Denna forskning utfördes, delvis tack vare finansiering från programmet Kanada forskning stolar (J.-P.J.).

Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.

Membran-förankrade glykoproteiner är avgörande för cellens funktion och attraktiva terapeutiska mål. Här presenterar vi ett protokoll för strukturella och biofysiska karakterisering av direktivet om elektronisk handel av membran glykoproteiner, både ensam och i komplex med liten molekyl ligander och Fab fragment. Vi har framgångsrikt använt detta protokoll för att bestämma kristallstrukturen av de tre N-terminal-mest Ig domänerna i den extracellulära delen av mänskliga CD2228, en kritisk samtidig receptor på B-celler som är involverade i att hålla humorala immuniteten i kontrollera79. Vi har också kännetecknas bindande platsen för CD22 med dess naturliga ligand α2-6 sialyllactose och definitionen av erkännande terapeutiska antikroppar mot mänskliga CD22. Dessa resultat ger insikter om relationen struktur och funktion av en viktig medlem av familjen Siglecs som har begränsat uttryck på B-celler och en molekylär färdplan för utvecklingen av nya CD22 riktade liten molekyl och antikroppsbaserade Therapeutics. Medan detta protokoll användes framgångsrikt för en Ig-innehållande B-cells receptor, föreslår vi att vår strategi kan tillämpas för strukturella och biofysiska karakterisering av någon membran glykoprotein med en distinkt domän organisation. I sådana fall konstruera design och kombinatoriska N-länkade glycan mutationer (antingen till Gln eller Ala) kan utvärderas för att hitta en konstruktion passar crystal tillväxt och högupplösta diffraktion.
Att erhålla en homogen och ren glykoprotein prov är av avgörande betydelse för crystal tillväxt och röntgendiffraktion, liksom för nedströms biofysiska karakterisering. N-länkade glycans närvarande på glykoproteiner är till sin natur heterogen och kan orsaka konfirmerande och kemiska heterogenitet inom den glykoprotein som kan avskräcka crystal bildandet. För att minska denna mikro-heterogenitet, kan strategier som införa punktmutationer ta bort Asn rester förutspådde för att hysa N-länkade glycans, eller använda muterade cellinjer (såsom HEK293S) följt av behandling med endoglycosidases (till exempel EndoH) avsevärt förbättra kristallisering framgång15,21,22. I detta protokoll diskuterar vi rening av lösliga glykoproteiner och Folkesson som utsöndras in i cellen supernatant. Glykoprotein sekretion ger en relativt enkel rutt mot renhet, utan behovet av cellys eller tillägg av starka kemikalier eller rengöringsmedel. Cell supernatanten, erhåller följande cell skörd körs sedan direkt över en kolumn som har affinitet för proteinet av intresse (t.ex., Ni-NTA för hans-taggade glykoproteiner eller LC affinitet för Fab fragment). Dock beroende på kolumnen i användning och cellens supernatant (t.ex. pH), kan bindande förmåga av proteinet av intresse för kolumnen påverkas. Om så är fallet, kan det vara nödvändigt att koncentrera sig och buffert exchange cellen supernatanten för att förbättra bindning till kolumnen. Dessutom rekommenderas att kvalitetskontroll steg under reningen användas för att bedöma protein renhet. Kör en SDS-PAGE gel eller Western blot av alla prover (före, under och efter reningssteg) kan ge insikter om föreslagna rening systemet är lämpligt för proteinet av intresse. Om kontaminerande band syns på SDS-PAGE, eller om flera arter erhålls under reningen (t.ex. flera toppar på storlek utslagning), ytterligare reningssteg bör övervägas, t.ex., jonbyteskromatografi, att få i renhet och öka chanserna för nedströms kristallisering80.
För makromolekylära kristallisering är det ofta avgörande för att få hög avkastning av proteinet av intresse att tillåta för screening av ett stort antal potentiella kristallisering villkor vid hög proteinhalt koncentrationer att hitta lämplig crystal hits. Generellt, de HEK293 cellinjer diskuteras här (HEK293F och HEK293S) är robust uttryck system, och kan skalas enkelt för att producera fler prov som behövs. Det är dock möjligt att proteinet av intresse inte kan uttrycka tillräckligt inom dessa cellinjer. I dessa fall andra cellinjer, såsom Expi293 celler81,82, har befunnits Visa överlägsna nivåer av proteinuttryck och bör betraktas som ett alternativ.
Om välordnade, diffracting kristaller inte erhålls efter provning av flera konstruktioner av proteinet av intresse trots hög renhet, kan det vara nödvändigt att utöka kristallisering tekniker för att främja crystal bildandet. Det har visat att Fab fragment av antikroppar och nanobodies kan vara utmärkta kristallisering smakförstärkare och främja välordnad crystal packning83,84,85. Dessa fragment kan vara uttryckt renas till homogenitet och används i ett komplex med proteinet av intresse för att främja kristallisering. Ännu viktigare, kan Fab fragment producerade som beskrivs i avsnitt 10 ha en tendens att bilda icke-funktionella LC dimerer86. Dessa dimerer föroreningar och bör tas bort under reningen. I vår erfarenhet, LC dimerer ofta har en annan lagring volym på storlek utslagning, eller eluera som en distinkt topp på jonbyteskromatografi och således kan tas bort från Fab rening - men detta inte är alltid fallet. Om dessa metoder är otillräckliga för att ta bort LC dimerer från Fab rening, kan ytterligare reningsmetoder, såsom Protein G affinitet rening, användas för att förbättra branschrenheten.
Alternativ till co-komplexering med Fab fragment, väldokumenterade tekniker såsom slumpmässiga matrix microseeding kan förbättra chanserna att få välordnad kristaller63,70. Denna metod innebär tillsats av små mängder av krossade, suboptimal kristaller till kristallisation villkoret, som ger en kristall nucleate att främja crystal tillväxt. Detta kan utföras med kristaller av proteinet av intresse, eller de med liknande domän arkitektur och tertiär struktur. Dessutom kan slumpmässiga matrix microseeding utföras i försök att kristallisera proteinet ensam eller i komplex med en Fab-fragment eller liten molekyl av intresse. Senaste framstegen inom cryo-elektronmikroskopi gör också denna teknik ett attraktivt alternativ till röntgenkristallografi för att erhålla högupplöst strukturell information för molekyler med lämpliga funktioner87,88, 89,90,91.
När utfasningen av röntgendiffraktion datamängder misslyckas av herr, kan HA blötläggning behövas på fas problemet genom avvikande spridning eller isomorft utbyte. Inspektion av den amino syra ordnar av protein kan ge ledtrådar om strategin för HA derivatisering, inklusive optimalt pH för bindning. I synnerhet kan oparade cysteines inom proteinet specifikt binda HA föreningar som innehåller kvicksilver. Blötläggning infödda kristaller med HA föreningar är en iterativ process för att fastställa identiteten för optimal HA föreningen, dess koncentration och krävs inkubationstiden. Om inledande blötläggning försök inte ger väl diffracting kristaller innehållande en HA lämplig för avveckling, kan det nödvändigt att införa aminosyra substitutioner för att förbättra sannolikheten att HA bindande och förbättra avvikande signal. Exempel är mutationer för att inkludera en gratis cysteinrest för att effektivt binda Hg, Au, Pt eller Pb. redovisning av proteiner för avvikande fasa i en seleno-metionin kompletteras media i E. coli används flitigt för att avvikande fasa, men en likvärdigt system som på ett tillförlitligt sätt innehåller seleno-metionin är inte lätt tillgängliga för däggdjursceller i suspension92,93, och är ett område för framtida utveckling.
När den unliganded strukturen i glykoprotein sevärdheter erhålls, kan blötläggning kristallerna med liten molekyl ligander utföras för att erhålla en struktur av immun receptor-ligand komplexet. Dessa data ger en blåkopia för rationell utformning av mer specifika och hög affinitet ligander som kan användas som småmolekylär therapeutics samt ger hög upplösning insikter i den biologiska funktionen av glykoprotein. När du försöker att suga glykoprotein kristaller med liten molekyl ligander sevärdheter, kan inspektion av unliganded kristallstrukturen indikera om blötläggning ska vara möjligt. Om nära crystal-packning kontakter finns runt ligand-bindningsstället eller runt regioner förväntas genomgå konfirmerande förändringar vid ligand bindande, blötläggning kommer troligen vara problematiskt. I det här fallet, bör andra metoder såsom samtidig kristallisation av protein-ligand anläggningen utföras.

Ytproteiner spelar avgörande roller i cellulär funktion. Genom sin extracellulära domäner, kan dessa membranproteiner modulera cell-cell interaktioner, vidhäftning, transport och signalering1,2. Extracellulära lokaliseringen av dessa proteiner gör dem attraktiva mål för utveckling av läkemedel för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer och autoimmuna sjukdomar3,4,5 , 6 , 7. en av de vanligaste veck av mänskliga membran protein ectodomains är immunglobulin-liknande (Ig) luckan, som bildas av sju eller fler β-trådar ordnad in i två β-ark8,9. Ig-innehållande glykoproteiner är vanligtvis multi-domän strukturer med Ig domäner sekventiellt ordnade på den extracellulära delen av membran protein10. Post-translationella modifieringar av dessa cellytan proteiner, särskilt N - och O-länkade glycosylation, har visat att spela avgörande roller i deras reglering, vikning, sekretion och funktion11. För att förbättra vår förståelse av deras funktion och bättre design therapeutics som kan rikta dem, krävs tekniker som möjliggör deras detaljerade molekylär karakterisering. Här presenterar vi en kombination av tekniker som möjliggör de biofysiska (biolayer interferometry (BLI) och isotermiska titrering calorimetry (ITC)) och strukturella (röntgenkristallografi) karakterisering av det extracellulära området av Ig-innehållande membranet glykoproteiner, ensamma och i komplex med sin biologiskt relevanta ligander och terapeutiska molekyler (figur 1).
N-länkade glycosylation är en av de vanligaste efter översättning ändringarna på protein från däggdjur, och uppstår under protein mognad inom endoplasmatiska retiklet och Golgi12,13. Cellinjer, såsom mänskliga embryonala (HEK) 293 njurceller, har utvecklats av rekombinant uttryck för stora mängder glykosylerat protein från däggdjur14,15. Denna cellinje har utvecklats i en suspension-format, vilket möjliggör enkel skala upp proteinproduktion till större mängder jämfört med vidhäftande cellinjer. Här, vi använder två HEK293 cellinjer: HEK293F och HEK293 Gnt jag- / - (HEK293S), som skiljer sig genom avsaknad av N-acetylglucosaminyl transferas jag (Gnt jag) i det senare. I sin produktion av komplexa glycans (som ses i HEK293F) är inte möjligt och istället hög mannos-typ glycans (huvudsakligen Man5GlcNAc2) bosatt i N-länkade glycan platser18,19,20 . När du använder dessa två cellinjer parallellt kan studera effekten av glycan storlek och komplexitet på biologisk funktion och terapeutisk inriktning. Faktiskt, glykoproteiner som produceras i HEK293F celler kommer att ha större och mer komplexa glycans jämfört med den samma glykoprotein som produceras i HEK293S celler. Glykoproteiner som produceras i HEK293S celler är mer mottagliga för kristallisering, på grund av sin N-länkade glycans minskade kemiska och konfirmerande heterogenitet. För att ytterligare förbättra crystallizability, glykoproteiner som produceras i HEK293S (men inte HEK293F) celler kan behandlas med det enzym endoglycosidase H (Endo H), vilket resulterar i klyvning av hög mannos glycans sådan att endast en enda N-acetylglukosamin (GlcNAc) biexponentiellt förblir varje N-länkade glycosylation webbplats21,22. Andra metoder kan också användas för att begränsa N-glycan bearbetning i cellerna, till exempel tillägg av glycosyltransferase-hämmare under glykoprotein uttryck, inklusive kifunensine23. Alternativa metoder innebär uttrycket av infödda glykoproteiner (i HEK293F celler) följt av enzymatisk deglycosylation med peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Dock har deglycosylation med PNGaseF visat sig vara mindre effektivt under inhemska förhållanden och ökar aggregation i vissa proteiner; i fall när proteinet förblir vattenlöslig efter behandling, förvärvar det negativa laddningar på ytan på grund av deamidation av aminosyran asparagin restmängd till asparaginsyra24, som kan vara till nackdel för dess kristallisering. Förutspådda N-glycosylation platser kan också vara muterade, oftast till alanin eller glutamin rester, att förhindra N-länkade glycosylation på dessa platser och att generera glykoprotein prover av hög homogenitet. Alternativt kan glykoproteiner produceras i andra eukaryota cellkulturer, inklusive jäst, insekt, och växt-system eller andra däggdjursceller linjer såsom kinesisk hamster cystor (CHO) celler16,17.
Många däggdjur uttryck vektorer, inklusive pHLsec, möjliggöra utsöndringen av rekombinant glykoprotein ectodomains in i cellen medium25. Utsöndringen av glykoproteiner från HEK293 celler möjliggör snabb och enkel rening utan behov av cellys. Tillägg av rening Taggar (t.ex. hans-tag, Strep-tag, flagg-tagg, Myc-tagg, HA-tag) till N eller C slutstationen för målet glykoprotein möjliggör rening av en enda steg affinitetskromatografi. Därefter kan storlek utslagning kromatografi användas för att ge en monodisperse prov för biofysiska och strukturell karaktärisering.
En mycket ren och homogen glykoprotein prov under lämpliga förhållanden kan resultera i väl diffracting kristaller. När en full röntgendiffraktion datamängd har erhållits från dessa kristaller, måste inledande faserna fastställas att beräkna elektrontätheten av glykoprotein. Tack vare ett ständigt ökande antal strukturer i Protein Data Bank (PDB) blivit den vanligaste metoden för att fasa överlägset molekylär ersättning (MR), som använder en relaterade proteinstruktur för att få inledande faserna26. När herr misslyckas på fas problemet, som ibland har varit fallet för multi-Ig domän glykoproteiner27,28,29, krävs dock alternativa metoder. I denna artikel detalj vi en metod att suga kristaller med tunga atomer (HA) för avvecklingen, som krävdes för att lösa strukturen CD22 ectodomain28. Identifiera rätt HA för utfasning är en iterativ process som beror på HA reaktivitet, tillgängliga atomer i glykoprotein i en given kristallgitter och kristallisering lösning30,31. Alternativt, naturligt svavel atomer i cystein och metionin restprodukter kan användas för att fasa om närvarande vid en tillräckligt hög i förhållande till andra atomer i glykoprotein och röntgendiffraktion kan samlas med tillräckligt hög redundans32, 33.
Den biologiska funktionen av membran glykoproteiner är ofta medieras av protein-protein interaktioner eller protein-ligand interaktioner, såsom med kolhydrater. När liganden är tillräckligt liten för att sprida lösningen till glykoprotein bindningsstället i det crystal gallret, kan blötläggning experiment lyckas att få ett glykoprotein-ligand samtidig kristallen strukturerar för att bättre förstå ligand erkännande.
De protokoll som presenteras här är också relevant för att förstå samspelet mellan surface glykoproteiner med syntetiska terapeutiska ligander34,35 och antikropp therapeutics36,37. Kombination med strukturell information, kan bindande kinetik och termodynamik vara kraftfulla att förstå och förbättra deras verkningsmekanismer. En teknik som möjliggör den kinetiska analysen av terapeutiska antikroppar som binder till ett glykoprotein är BLI38,39. BLI använder biosensorer med en orörlig ligand för att mäta association och dissociation kinetik med en bindande partner, att slutligen bestämma en jämvikt dissociationskonstant (KD). BLI är en attraktiv metod eftersom små mängder av glykoproteiner krävs (< 100 µg), experiment tid är snabb (~ 10-15 min per körning), och det kan vara automatiserad. ITC är också användbart för att studera släktskap mellan glykoproteiner och bindande partner40,41,42,43. ITC är mer tid och reagens intensiv, kan värdefull information erhållas om termodynamik vid interaktionen (ΔG, ΔH, ΔS och stökiometri). ITC är också mycket användbart för att studera svaga interaktioner som ofta förknippas med övergående bindningen av surface glykoproteiner till ligander. Dessa tekniker kan dessutom användas i samband att utvärdera bindningen av olika konstruktioner och bedöma effekten av olika N-länkade glycoforms erhålls från att uttrycka glykoprotein i olika cellinjer. Utför BLI och ITC med glykoproteiner produceras i HEK293F, HEK293S och behandlade med Endo H kan ge en fördjupad bild av glycans roll i biologiska aktivitet och terapeutiska engagemang.
Vi tillämpat framgångsrikt dessa protokoll för att karakterisera den extracellulära domänen (ECD) av mänskliga CD2228, ett glykoprotein medlem av familjen sialic acid-bindande Ig-liknande lektiner (Siglecs) som är nödvändig för att upprätthålla B-cell homeostas44 . Vi utförde djupgående konstruktion konstruktion att underlätta kristallisation och fasas röntgen datamängden av HA blötläggning med Hg. Vi också indränkt CD22 kristaller med dess ligand sialic acid (α2-6 sialyllactose) att få en struktur av immun receptor-ligand komplexet och därmed enligt ritningarna struktur-guidad utformningen av glycan mimetika45,46. Dessutom genererade vi fragment antigen bindningen (Fab) av den anti-CD22 terapeutiska antikroppar epratuzumab - terapeutiska kandidat för närvarande i kliniska fas III-prövningar för non-Hodgkins lymfom47- för att avgöra dess affinitet av BLI och ITC till differentially glykosylerat CD22 ECD konstruktioner. Dessa studier visade en avgörande roll för N-länkade glycosylation i epratuzumab engagemang, med potentiella konsekvenser för CD22 erkännande på dysfunktionella B-celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Glykoproteiner på ytan av celler spelar avgörande roller i cellulär funktion, inklusive signalering, vidhäftning och transport. På leukocyter, flera av dessa glykoproteiner äger immunglobulin (Ig) veck och är central för immun erkännande och förordning. Här presenterar vi en plattform för design, uttryck och biofysiska karakterisering av det extracellulära området av mänsklig B cell receptor CD22. Vi föreslår att dessa metoder är generellt tillämpliga på karakterisering av däggdjur glykoprotein ectodomains innehållande Ig domäner. Två suspension mänskliga embryonala njurar (HEK) cellinjer, HEK293F och HEK293S, används för att uttrycka glykoproteiner hysande komplexa och hög-mannos glycans, respektive. Dessa rekombinanta glykoproteiner med olika glycoforms att undersöka effekten av glycan storlek och sammansättning på ligand bindande. Vi diskutera protokoll för att studera kinetik och termodynamik av glykoprotein bindningen till biologiskt relevanta ligander och terapeutiska antikroppar kandidater. Rekombinanta glykoproteiner produceras i HEK293S celler är mottagliga för kristallisering på grund av glycan homogenitet, minskad flexibilitet och känslighet för endoglycosidase H behandling. Vi presenterar metoder för blötläggning glykoprotein kristaller med tunga atomer och små molekyler för fas bestämning och analys av liganden bindande, respektive. De experimentella protokoll som diskuteras håll här löftet för karakterisering av däggdjur glykoproteiner att ge inblick i deras funktion och undersöka verkningsmekanismen av therapeutics.

Flera konstruktioner av CD22 ECD var framgångsrikt klonade in pHLsec uttryck vektorn och i ökad utsträckning hos däggdjur HEK293F och HEK293S cellinjer (figur 2 och 3A). Alla konstruktioner var renas till storlek homogenitet av storlek utslagning kromatografi och gav ett högt rena prov för kristallisering studier (figur 3B och 3 C). Den CD22-konstruktion som ledde till väl diffracting kristaller var d1-d3 trunkering (rester 20-330), med fem av de sex förutspådda N-länkade glycosylation webbplatser muterat från Asn ALA (N67A, N112A, N135A, N164A och N231A), som produceras i HEK293S celler, så att endast webbplatsen glycosylation på position N101 behölls (denna konstruktion heter CD2220-330, 5A). Kristaller erhölls i flera villkor på skärmen MCSG-1 gles matris, men bästa kristallerna var från ett villkor som innehåller 30% (w/v) polyetylenglykol 4000, 0,2 M litium klorid och 0,1 M Tris, pH 8.5. Dessa infödda kristaller bombarderas 2.1 Å resolution; med hjälp av kända strukturer av Ig domänerna i relaterade Siglec proteiner ger inte några lösningar i herr sökningar.
För att förvärva fasa information, indränkt vi infödda kristaller med en panel av HA föreningar som inkluderade Hg, Pt, Os, Ta och Br vid koncentrationer från 1-20 mM ha förening för en inkubationstid från 5 min till 1 d (figur 4). Vi övervakas kristaller för ändringar i morfologi, och fann att kristaller indränkt med HA förening vid 20 mM resulterade i snabb sprickbildning och upplösning av kristallen. Vi frös sammanlagt 63 kristaller som behållit sin form efter set inkubationstider som var genomdränkt med tantal bromid kluster, platina klorid, kvicksilver acetat och Kvicksilverklorid. Kristaller indränkt med 7 mM av merkuriklorid i 30 min visade avvikande signal på en fluorescens scan på den kanadensiska ljus källa (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Kanada) och tillåtet för flera våglängder avvikande dispersion röntgen datainsamling på en enda Crystal. Dessa datamängder tillät oss att lösa kvicksilver underkonstruktionen i CD2220-330, 5A, som avslöjade en enda kvicksilver atom bunden till en gratis cystein vid position C308 och slutligen tillät oss att bygga struktur CD2220-330, 5A i den stegvis elektronen täthet kartan med AutoBuild78.
När unliganded struktur var löst, var vi intresserade av att lösa strukturen på CD22 bunden till dess ligand, α2-6 siallylactose. Vi beräknas först CD22 affinitet mot α2-6 sialyllactose med ITC för att karakterisera bindande termodynamiken av interaktionen. Vi observerade en affinitet ~ 280 µm och används denna information för att identifiera en initial koncentration (~ 100 x KD) av ligand ska användas för blötläggning av våra infödda CD2220-330, 5A kristaller. Vi indränkt CD2220-330, 5A kristallerna med 25 mM siallylactose för 5 min, 5 d, 40 h, 2 h och 14 h och övervakas för ändringar i crystal morfologi. Sammanlagt ~ 75 kristaller var fryst från olika tidpunkter och sände till CLS synkrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Kanada) för remote data collection. Sammanlagt sex röntgen datamängder samlades in från väl diffracting kristaller. Strukturen från varje röntgen datamängd löstes genom herr med unliganded CD2220-330, 5A struktur som en första sökning modell. Resulterande elektrontätheten för alla datamängder inspekterades sedan för positiva densitet i Fo-Fc kartan som skulle motsvara bunden α2-6 sialyllactose inom bindningsstället på CD22. Anmärkningsvärt, alla datamängder samlas in, även de från kristaller indränkt efter endast 5 min av inkubationstiden, innehöll positiva täthet motsvarande liganden i bindningsstället. Övergripande strukturer av unliganded och liganded CD22 var mycket likartade med minimal konfirmerande förändringar, som kan förklara framgången för blötläggning experiment med α2-6 sialyllactose.
Vi kännetecknas nästa antigena ytan av CD22 erkända av terapeutiska antikroppar epratuzumab i BLI och ITC experiment (figur 5). Kinetik och termodynamik profiler av epratuzumab Fab bindningen till CD22 konstruktioner med olika glycoforms visade en ökande affinitet till CD22 med reducerad N-länkade glycan storlek, med upp till en 14-faldigt förbättring i affinitet för mindre glycans (327 nM vs 24 nM i BLI; 188 nM vs 58 nM i ITC). CD22 N-länkade glycan begränsa tillgång av antikropp till dess epitop identifierades genom BLI använda enpunkts-mutanter av CD22 och lösa epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 samtidig kristall struktur28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figur 1 . Översikt över glykoprotein karakterisering från construct design till biofysiska och strukturell karaktärisering. (1) primär sekvensanalys av representativa glykoprotein. I grått, den extracellulära domänen (ECD); i grönt, det transmembrana (TM)-segmentet; och i blått, cytosoliska domänen för glykoprotein. Förutspådda N-länkade glycans är märkta. (2) kloning ECD konstruktioner. (3) uttrycket av ECD konstruktioner i däggdjursceller. (4) glykoprotein rening. Medan proteiner som uttrycks i HEK293F kommer att innehålla komplexa glycans, har proteiner som uttrycks i HEK293S hög mannos glycans. Enzymatisk behandling av glykoproteiner producerade i HEK293S celler med Endo H resulterar i glykoproteiner med endast en GlcNAc del på N-länkade glycosylation platser. (5a) glykoproteiner testas för deras bindning till antikroppar av biolayer interferometry (BLI) och isotermiska titrering calorimetry (ITC). Affinitet till små ligander kan också mätas med ITC. (5b) kristallisation prövningar av glykoproteiner med homogena N-länkade glycans, såsom de uttrycks i HEK293S och deglycosylated med Endo H. (6) i vissa fall mutation av N-länkade glycosylation platser är nödvändigt att få kristaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figur 2 . Utformningen av CD22 ectodomain DNA konstruerar för uttryck i däggdjursceller. A) Representation av pHLsec plasmiden används för övergående transfection CD22 ECD konstruktioner. AgeI och KpnI webbplatser som används för kloning indikeras med röda rutor. B) The CD22 ECD innehåller sju Ig domäner (d1-d7) och 12 förutspådda N-länkade glycosylation platser (i blått). Fyra konstruktioner utformades från den CD22 ECD. C) 1% agarosgel visar PCR-amplikoner av CD22 ECD konstruerar för kloning i pHLsec däggdjur uttryck vektorn. Första lane innehåller 1 kb DNA-markör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figur 3 . Uttryck och rening av glykoproteiner. (A) effekten av cell densiteten på uttrycket avkastning. Glykoprotein uttryck i småskaliga 25 mL kultur av HEK293F suspension celler transfekterade med tre olika start tätheter av cellerna (0,5 x 106 celler mL-1, 1,0 x 106 celler mL-1och 1,5 x 106 celler mL -1). Kvantifiering utförs genom densitometry från SDS-PAGE i vänstra panelen och kvantitativa BLI i högra panelen. Värdena är representativa för ett glykoprotein preparat. B) kromatogrammet för den första reningssteg för konstruera CD2220-330, 5A från 600 mL av supernatanten med en Ni-NTA affinitet kolonn. Glykoprotein var elueras med en gradient av Imidazol (grå linje), där 100% motsvarar eluering bufferten, vilket innehåller 500 mM Imidazol. Poolade fraktionerna skildras med vertikala linjer. C) storlek-utslagning kromatogrammet för konstruera CD2220-330, 5A med en högpresterande gel filtrering kolumn. Poolade fraktioner från eluering toppen skildras med vertikala linjer. Infällt: Coomassie-färgade SDS-PAGE gel visar renheten av glykoprotein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figur 4 . Crystal blötläggning med tunga atomer. (A) prov arbetsstation för blötläggning infödda kristaller med HA föreningar. Alla erforderliga verktyg är märkta. (B) steg följde för att suga kristaller av konstruera CD2220-330, 5A med HA föreningar. Steg 1, öppen brunn innehållande kristaller och överföring kristaller med en slinga till en 0,2 µL droppe på ett täckglas som innehåller HA lösning utspädd i villkoret kristallisering sådan att HA slutliga koncentration varierar från 1-10 mM. Steg 2, förseglar nedgången i kristallisering plattan och inkubera kristaller med HA förening för olika tidsperioder. Steg 3, montera blötläggas kristallen i slingan och back-blöt i 30 s i tre på varandra följande 0.2 µl droppar som innehåller mor sprit lösningen kompletteras med 20% (v/v) glycerol expedieras på ett täckglas. Steg4, flash frysa kristall monterad på en slinga med flytande kväve och placera den i en puck för leverans till den synkrotron beamline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figur 5 . Biolayer interferometri och isotermiska titrering kalorimetri mätningar. (A) företrädare BLI experiment. Övre panelen: exempel på plattan setup för en kinetik experiment, där följande är märkta: 1 x kinetik buffert (B), hans6 x-märkta glykoprotein lastning (L), representativa Fab koncentrationer (62,5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 mM regenerering buffert (R) och 1 x kinetik neutralisering buffert (B). Varje innehåller väl 200 µL lösning. Steg nummer för kinetik experimentet indikeras överst på plattan. Mitten panel: Representativa rådata BLI experiment utförs med Ni-NTA biosensorer och plattan beskrivs i övre panelen. Steg nummer motsvarar baslinjen (1),6 x glykoprotein lastning (2), baslinje (3), hans association i seriell utspädning av Fab (4) och dissociation (5). Regenerering steg är inte representerade (steg 6-7). Nedre panelen: Representativa analyserade data visar raw association och dissociation (blå linje) med motsvarande 1:1 passar (röda linjen). B) övre panelen: representativa plattan setup för en enda ITC kör på ett automatiserat ITC instrument med sju experiment i en 96-väl rund botten blockera. Varje experiment består av tre brunnar. Den första brunnen (röd) motsvarar prov för cellen (400 µL), den andra brunnen (grön) motsvarar till prov för sprutan (120 µL). Tredje lämnas väl Tom och blandat proverna kommer tillbaka till detta väl efter experimentet. Experiment 1, 2 och 7 är buffert i buffert kontroller. Experiment 3-5 representerar tre exemplar experiment med glykoprotein (P) i den cellen och Fab eller ligand (L) i sprutan. Experiment 6 representerar en ligand värme av utspädning kontroll och bör dras från experiment 3-5 under dataanalys. Nedre panelen: Representativa raw (överst) och bearbetade (nederst) ITC data visar Fab (epratuzumab) binder till CD22 ECD tillverkas i HEK293F celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Vi presenterar strategier för biofysiska och strukturella karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan genom biolayer interferometri, isotermiska titrering kalorimetri och röntgenkristallografi.

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

Liquids, Solids, and Intermolecular Forces

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Visualisering av östrogenreceptorer i kolon av möss med TNBS-inducerad Crohns sjukdom med immunfluorescens

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristallografi att studera oligomeric staten Övergång av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

De automatiserade kristallografiledningarna vid EMBL HTX-anläggningen i Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...