Name: characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

X-ışını kırınım deneyler Bu yazıda açıklanan gerçekleştirilen beamlines 08-ID ve 08-BM Kanada ışık yenilik, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada Kanada Vakfı tarafından desteklenen, kaynakta, kullanma Saskatchewan Üniversitesi, Saskatchewan, Kanada Batı ekonomik çeşitlendirme, Ulusal Araştırma Konseyi Kanada ve Kanada Sağlık araştırma enstitüleri hükümeti. Yapısal ve biyofiziksel çekirdek tesis, hastane hasta çocuklar için erişim ITC ve saçınıza aletler için kabul etmek istiyoruz. J.E.O. tarafından Banting doktora sonrası bursu BPF-144483 Kanada Sağlık araştırma enstitüleri desteklenmiştir. T.S. olduğunu bir alıcı bir Kanada Yüksek Lisans Burs Master'ın ödülü ve Kanada Sağlık araştırma enstitüleri Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs. Bu eser hibe Kanada Sağlık araştırma enstitüleri PJT-148811 (J.-P.J.) işletim tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma, kısmen, Kanada araştırma sandalye program (J.-P.J.)fon sayesinde yapılmıştır.

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.

Glikoproteinlerin membran bağlantılı hücre işlevi için kritik olan ve çekici tedavi hedefleridir. Burada, biz hem tek başına hem de karmaşık küçük molekül ligandlar ile bir protokol membran glikoproteinlerin, ECD yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonu için mevcut ve Fab parçaları. Üç N-terminal-çoğu IG etki alanları insan CD2228, kritik bir eş reseptör B hücreleri humoral bağışıklık onay79' tutmak için ilgili ekstraselüler bölümünün kristal yapısını belirlemek için bu iletişim kuralı başarıyla kullanmıştır. Ayrıca CD22 bağlama site onun doğal ligand α2-6 sialyllactose ile karakterize ve terapötik bir antikor insan CD22 doğru tanıma modu tanımlanır. Bu sonuçlar anahtar ifade B hücreleri ve yeni CD22 hedeflenen küçük molekül ve antikor tabanlı geliştirme doğru moleküler bir yol haritası üzerinde sınırlı sahip Siglecs ailesi üyesi yapısı-işlev ilişki içine anlayışlar sağlar tedavi. Bu iletişim kuralı başarıyla IG içeren B hücre reseptörü için kullanılan iken, bizim yaklaşım herhangi bir membran glikoprotein ayrı etki alanı organizasyon ile yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonu için uygulanabilir öneriyorum. Bu gibi durumlarda, tasarım ve kombinatorik glycan N bağlı mutasyonlar (ya Gln veya Ala) bir yapı kristal büyüme ve yüksek çözünürlüklü kırınımı için uygun bulmak için değerlendirilebilir oluşturmak.
Homojen ve saf glikoprotein örnek alma kristal büyüme ve x-ışını kırınım, yanı sıra aşağı akım biyofiziksel karakterizasyonu için kritik önem taşıyor. N bağlı glukanlardir glikoproteinlerin üzerinde mevcut doğal olarak heterojen ve konformasyon ve kimyasal heterojenite kristal oluşumu caydırmak olabilir glikoprotein içinde neden olabilir. Bu mikro-heterojenite azaltmak için nokta mutasyonlar N bağlı glukanlardir veya endoglycosidases (örneğin, EndoH) ile tedavi ardından mutant hücre hatları (örneğin, HEK293S) kullanarak liman tahmin Asn artıkları kaldırmak için tanıtmak stratejileri önemli ölçüde yapabilirsiniz kristalizasyon başarı15,21,22geliştirmek. Bu protokol için biz çözünür glikoproteinlerin ve süpernatant hücreye salgılanan Fabs arıtma tartışıyorlar. Glikoprotein salgı saflık, hücre lizis ihtiyacını veya sert kimyasallar veya deterjanlar ilavesi olmadan doğru nispeten basit bir yol sağlar. Hücre süpernatant olarak elde edilen aşağıdaki hücre hasat daha sonra doğrudan faiz (Örneğin, Ni-NTA glikoproteinlerin O'nun öğesini veya LC benzeşme Fab parçaları için) protein için ilgi olan bir sütun üzerinde çalıştırın. Ancak, kullanım ve hücre süpernatant (Örneğin, pH) koşullarının sütun bağlı olarak protein ilgi sütun bağlama özelliğiyle etkilenip etkilenmedikleri sınanmamıştır. Bu durumda ise, konsantre ve arabellek sütuna bağlama geliştirmek için exchange süpernatant hücre gerekli olabilir. Ayrıca, kalite kontrol adımları arıtma sırasında protein saflık değerlendirmek yardımcı olmak için istihdam edilmelidir önerilir. SDS-sayfa jel veya Western blot (önce sırasında ve sonrasında arıtma adımları) tüm örneklerinin çalışan önerilen arıtma düzeni faiz protein için uygun olup içine anlayışlar yol açabilir. Bulaşıcı bantları SDS-sayfasında görünür durumdaysa veya çeşitli türlerin arıtma sırasında aldıysanız (Örneğin, boyut dışlama üzerinde birkaç tepeler), ek arıtma adımları kabul edilmelidir, Örneğin, İyon Kromatografi elde etmek için saflık ve artış bir şansa aşağı akım kristalizasyon80.
Makromoleküllerin kristalizasyon için uygun kristal bulmak için çok sayıda potansiyel kristalizasyon koşullarında yüksek protein konsantrasyonları tarama için izin ilgi protein yüksek verim elde etmek için önemlidir. Genel olarak, burada ele HEK293 hücre hatları (HEK293F ve HEK293S) güçlü ifade sistemlerdir ve kolayca daha fazla örnek gerekli üretmek için ölçeklendirilebilir. Ancak, faiz protein yeterince bu hücre satırları içinde ifade değil mümkündür. Bu durumda Expi293 hücreleri81,82gibi diğer hücre hatları protein ifade üstün düzeyde göstermek için bulduk ve alternatif olarak düşünülmelidir.
İyi, diffracting kristalleri protein yüksek saflıkta rağmen ilgi çeşitli yapıları, test takip elde değil, kristal oluşumu tanıtmak için kristalizasyon teknikleri genişletmek için gerekli olabilir. Bu antikorlar ve nanobodies Fab parçaları mükemmel kristalizasyon arttırıcılar olması ve iyi sipariş edilen Kristal83,84,85ambalaj teşvik gösterilmiştir. Bu parçaları dile getirdi ve homojenliği için saflaştırılmış ve protein ilgi ile birlikte kristalizasyon tanıtmak için kullanılır. Önemlisi, Bölüm 10'açıklandığı gibi üretilen Fab parçaları işlevsel olmayan LC dimer86oluşturmak için bir eğilim olabilir. Bu dimer kirletici vardır ve arıtma sırasında kaldırılmalıdır. Bizim deneyim, LC dimer kez farklı saklama birimi boyutu dışlama üzerinde veya İyon Kromatografi üzerinde farklı bir zirve olarak elute ve bu her zaman böyle değildir ancak Fab arıtma - böylece kaldırılabilir. Bu teknikler LC dimer Fab arıtma kaldırmak yetersiz ise, Protein G benzeşme arıtma gibi ek arıtma yöntemleri saflık geliştirmek için istihdam edilebilir.
Seçimli-e doğru co-complexation Fab parçaları ile rastgele matrix microseeding gibi iyi belgelenmiş teknikleri iyi kristalleri63,70elde etme şansını artırabilir. Bu yöntem, ezilmiş, suboptimal kristalleri az miktarda ek bir kristal kristal büyümeyi desteklemek için nucleate sağlayan kristalizasyon durum içine içerir. Bu ilgi, ya da olanlar benzer etki alanı mimarisi ve üçüncül yapısı ile protein kristalleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, rasgele matris microseeding yalnız protein kristalize girişimlerini veya karmaşık bir Fab parçası veya ilgi küçük molekül ile gerçekleştirilebilir. Cryo-elektron mikroskobu son gelişmeler de bu tekniği uygun özellikleri87,88moleküller için yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi elde etmek için x-ışını kristalografisi için cazip bir alternatif yapmak, 89,90,91.
X-ışını kırınım datasets phasing Bay tarafından başarısız olduğunda, iliklerine kadar HA faz sorunu çözmek için anormal dağılım veya isomorphous yedek tarafından gerekli olabilir. Proteinin amino asit dizisi incelenmesi HA derivatization, bağlama için optimum pH da dahil olmak üzere için strateji hakkında ipuçları sağlar. Özellikle, protein içinde unpaired katıldı özellikle cıva içeren HA bileşikler bağlayabilirsiniz. HA bileşikler ile yerel kristalleri iliklerine kadar en iyi HA bileşik kimliğinin, onun konsantrasyonu ve gerekli kuluçka zamanı belirlemek için yinelemeli bir işlemdir. İlk iliklerine girişimleri iyi diffracting kristalleri HA phasing için uygun içeren pes ediyor musun, amino asit oyuncu değişikliği HA bağlama olasılığı geliştirmek ve anormal sinyal artırmak için tanıtmak için gerekli olabilir. Örnek verilebilir mutasyonlar için kapsamlı bir şekilde anormal phasing için kullanılıyor anormal E. coli seleno-metiyonin desteklenen medyada phasing Hg, Au, Pt veya ifade Pb. proteinlerin verimli bir şekilde bağlamak için ücretsiz sistein kalıntıları içerir ancak bir güvenilir seleno-metionin içerir eşdeğer sistem süspansiyon92,93memeli hücrelerinde için değildir ve gelecekteki gelişme alanıdır.
Faiz glikoprotein unliganded yapısını alındıktan sonra küçük molekül ligandlar kristallerle iliklerine bağışıklık reseptör-ligand kompleks bir yapı elde etmek için gerçekleştirilebilir. Bu veriler bir plan küçük molekül tedavi kullanılabilir yanı sıra yüksek çözünürlüklü anlayışlar glikoprotein biyolojik fonksiyonu sağlar daha belirli ve yüksek-benzeşme ligandlar rasyonel tasarım sağlar. Küçük molekül ligandlar ilgi kristallerle glikoprotein emmek çalışırken, unliganded kristal yapısı incelenmesi iliklerine kadar mümkün olup olmayacağını belirtebilirsiniz. Eğer yakın kristal ambalaj kişiler ligand bağlayıcı sitenin etrafında bulunur veya konformasyon değişiklikleri ligand bağlayıcı üzerine geçmesi beklenen bölgeler muhtemelen iliklerine kadar sorunlu. Bu durumda, eş kristalizasyon protein-ligand kompleks gibi diğer yöntemleri uygulanmalıdır.

Yüzey proteinleri hücresel işlevinde önemli rol oynarlar. Ekstrasellüler etki alanları, bu zar proteinleri hücre-hücre etkileşimleri, adezyon, taşıma ve1,2sinyal modüle. Bu proteinler hücre dışı lokalizasyonu onları hastalıkları, kanser ve otoimmün hastalıklar3,4,5 de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede tedavisinde therapeutics gelişimi için çekici hedefler yapar , 6 , 7. insan membran protein ectodomains en yaygın kıvrımları biridir yedi veya daha fazla β-iplikçikleri iki β-sayfa8,9içine düzenlenmiş tarafından kurulan immünglobulin benzeri (Ig) kat. Genellikle, Ig içeren glikoproteinlerin membran proteini10ekstraselüler kısmı üzerinde sırayla düzenlenmiş IG etki alanlarıyla çoklu etki alanı yapılardır. Özellikle N ve O bağlı glikozilasyon, bu hücre yüzeyine proteinlerin translasyonel modifikasyonlar katlama, salgı ve işlev11onların Yönetmelikte gerekli rolleri oynamak için gösterilmiştir. Teknikleri anlayışımız işlevlerine ve onları hedef olabilir daha iyi tasarım tedavi geliştirmek için gerekli olan detaylı onların Moleküler Karakterizasyonu için izin. Burada, Biyofizik için izin teknikleri bir arada mevcut (biolayer Interferometry (BLI) ve izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)) ve yapısal (x-ışını kristalografisi) IG içeren hücre dışı etki karakterizasyonu membran glikoproteinlerin, yalnız ve karmaşık biyolojik ilgili ligandlar ve terapötik molekülleri (Şekil 1).
N bağlı glikozilasyon memeli proteinler üzerinde en yaygın sonrası çeviri değişiklikler biridir ve endoplazmik retikulum ve Golgi12,13içinde protein olgunlaşma sırasında ortaya çıkar. Gibi insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri, hücre hatları glikozile memeli proteinler14,15büyük miktarlarda rekombinant ifade için geliştirilmiştir. Bu hücre kültürünü protein üretim yapisan hücre hatları ile karşılaştırıldığında daha büyük miktarlar için yukarı ölçekleme kolaylığı sağlar bir süspansiyon biçimde geliştirilmiştir. Burada, biz iki HEK293 hücre satır kullanmaktadır: HEK293F ve HEK293 Gnt ben N-acetylglucosaminyl transferaz yokluğunda tarafından ben farklı- / - (HEK293S), (Gnt ben) ikinci. Buna karşılık, karmaşık glukanlardir (olarak görülen HEK293F) üretimi mümkün değildir ve bunun yerine yüksek mannoz tipi glukanlardir (ağırlıklı olarak Man5GlcNAc2) glycan N bağlantılı siteler18,19,,20 ikamet . Bu iki hücre satırları paralel olarak kullanarak glycan boyut ve karmaşıklık etkisi biyolojik fonksiyon ve terapötik hedefleme üzerine eğitim sağlar. Gerçekten, HEK293F hücrelerinde üretilen glikoproteinlerin HEK293S hücrelerinde üretilen aynı glikoprotein kıyasla daha büyük, daha karmaşık glukanlardir olacaktır. HEK293S hücrelerinde üretilen glikoproteinlerin azaltılmış kimyasal ve konformasyon heterojenite onların N bağlı glukanlardir nedeniyle daha kristalizasyon için mükellef bulunmaktadır. Crystallizability daha da geliştirmek için HEK293S (ama değil HEK293F) hücrelerinde üretilen glikoproteinlerin enzim endoglycosidase H (Endo H), yüksek mannoz glukanlardir bir bölünme gibi sonuçları ile tedavi edilebilir sadece bir tek N-peptidoglikan (GlcNAc) yan her N bağlı glikozilasyon sitesi21,22, kalır. Diğer yöntemler de N-glycan işleme glycosyltransferase inhibitörleri eklenmesi sırasında kifunensine23içeren glikoprotein ifadeler gibi hücre içinde sınırlandırmak için kullanılabilir. Alternatif yaklaşımlar (HEK293F hücrelerdeki) yerel glikoproteinlerin ifade peptid N-glycosidase F (PNGaseF) kullanarak tekrar tekrar enzimatik deglycosylation tarafından takip gerektirir. Ancak, deglycosylation PNGaseF ile yerel koşullar ve artar toplama bazı proteinlerde altında daha az etkili olduğu gösterilmiştir; protein kullanımdan sonra çözünür kaldığında durumlarda bu aspartik asit24, deamidation asparagine kalıntısı nedeniyle yüzeyinde negatif ücretleri hangi onun kristalizasyon için zararlı olabilir satın aldı. Tahmin edilen N-glikozilasyon siteler de, en sık alanin veya glutamin artıkları için N bağlı glikozilasyon bu sitelerdeki engellemek ve yüksek homojenliği glikoprotein örnekleri oluşturmak için mutasyona uğramış. Alternatif olarak, glikoproteinlerin mantar, böcek ve bitki sistemlerinde veya Çince hamster yumurtalık (CHO) hücreleri16,17gibi diğer memeli hücre satırları da dahil olmak üzere diğer ökaryotik hücre kültürlerinde üretilebilir.
PHLsec, dahil olmak üzere birçok memeli ifade vektörel çizimler, rekombinant glikoprotein ectodomains salgısı hücre orta25içine sağlar. Hücre lizis için gerek kalmadan hızlı ve kolay arıtma HEK293 hücrelerden glikoproteinlerin salgılanmasını sağlar. Arıtma Etiketler eklenmesi (Örneğin, O'nun etiketi, Strep-etiket, bayrak-etiket, Myc-etiket, HA-etiket) hedef N ve C terminus glikoprotein arıtma tek adım benzeşme Kromatografi tarafından sağlar. Daha sonra boyutu dışlama Kromatografi biyofiziksel ve yapısal karakterizasyon için monodisperse örnek verim için kullanılabilir.
Uygun koşullar altında son derece saf ve homojen glikoprotein örnek iyi diffracting kristaller neden olabilir. Bir kez tam x-ışını kırınım veri kümesi böyle kristalleri elde etti, ilk aşama glikoprotein elektron yoğunluğu hesaplamak için belirlenecek gerekir. Bir artan yapıları Protein veri Bankası (PDB) sayesinde, phasing için en sık kullanılan yöntem tarafından çok ilk aşama26elde etmek için ilgili protein yapısı kullanır moleküler değiştirme (MR), haline gelmiştir. Ancak, zaman zaman multi-IG etki alanı glikoproteinlerin27,28,29için olduğu gibi Bay faz sorunu çözmek başarısız olduğunda alternatif yöntemler gereklidir. Bu makalede, biz CD22 ectodomain28yapısını çözmek için gerekli ağır atomları (HA) kristallerle phasing için emmek için bir yöntem ayrıntı. Sağdaki HA phasing için tanımlayan belirli bir kristal kafes ve kristalizasyon çözüm30,31glikoprotein kullanılabilir atomlar HA reaktivite üzerinde bağlıdır yinelemeli bir işlemdir. Alternatif olarak, doğal kükürt atomlara sistein ve metionin artıkları varsa yeterince yüksek bir oranı, diğer atomlar için glikoprotein ve x-ışını kırınım veri yeterince yüksek artıklık32iletoplanan phasing için kullanılabilir, 33.
Membran glikoproteinlerin biyolojik işlev genellikle protein-protein etkileşimleri veya protein-ligand etkileşimleri, tarafından gibi karbonhidrat ile aracılık ettiği. Ligand glikoprotein bağlamanın sitesine kristal kafes içinde eriyik--dan yaygın küçük olduğunda, deneyler iliklerine ligand tanıma daha iyi anlamak için bir glikoprotein ligand Co kristal yapısı elde etmek için başarılı olabilir.
Burada sunulan iletişim kuralları da sentetik tedavi ligandlar34,35 ve antikor therapeutics36,37ile yüzey glikoproteinlerin etkileşimleri anlamak için ilgili. Yapısal bilgilerle birleştirildiğinde, kinetik ve termodinamik bağlama anlamak ve eylem kendi mekanizmaları geliştirmek için güçlü olabilir. Terapötik antikorlar bir glikoprotein bağlama kinetik analizi için izin veren bir BLI38,39tekniktir. Saçınıza biyosensörler sonuçta denge ayrışma sabiti (KD) belirleyen bir bağlama ortağı ile dernek ve ayrılma kinetik ölçmek için immobilize bir ligand ile kullanır. BLI değil çekici bir yaklaşım çünkü glikoproteinlerin küçük miktarlarda gereklidir (< 100 µg), deney zamanı hızlı (~ 10-15 dk başına), ve o-ebilmek var olmak otomatikleştirmek. ITC glikoproteinlerin ve bağlama ortakları40,41,42,43arasında benzeşim eğitimi için de yararlıdır. ITC daha fazla zaman ve reaktif yoğun olmakla birlikte, etkileşim (ΔG, ΔH, ΔS ve stoichiometry) Termodinamiğin ile ilgili değerli bilgiler elde edilebilir. ITC de çok sık sık ligandlar için yüzey glikoproteinlerin geçici bağlama ile ilişkili zayıf etkileşimler çalışmak için yararlıdır. Ayrıca, bu tekniklerin birlikte bağlama çeşitli yapıları, değerlendirmek ve farklı hücre hatlarında glikoprotein ifade elde farklı N bağlı glycoforms etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. HEK293F, HEK293S üretilen ve Endo H ile tedavi glikoproteinlerin ile saçınıza ve ITC performans glukanlardir rolünün ayrıntılı bir görünümünü biyolojik aktivite ve terapötik nişan sağlar.
Biz başarıyla uygulanan ekstrasellüler etki alanı (ECD) özelleştirmek için bu iletişim kuralları insan CD2228, B hücreli homeostazı44 bakımı için önemlidir sialik asit bağlama IG benzeri lektinlerinin (Siglecs) ailesinin bir glikoprotein üye . Kristalizasyon kolaylaştırmak için derinlemesine yapı tasarımı gerçekleştirilen ve Hg ile iliklerine HA X-ray DataSet'in aşamalı. Biz de onun ligand sialik bağışıklık reseptör-ligand kompleks bir yapı elde etmek için asit (α2-6 sialyllactose) kristallerle CD22 batırılmış ve böylece planları glycan mimetics45,46yapısı destekli tasarım için sağlanan. Buna ek olarak, biz anti-CD22 tedavi antikor epratuzumab - terapötik aday Şu anda Faz III klinik denemeler için non-Hodgkin Lenfoma47- parça antijen bağlayıcı (Fab) onun bağlama benzeşme BLI tarafından belirlemek için oluşturulan ve ITC differentially glikozile için CD22 ECD oluşturur. Bu çalışmalar epratuzumab nişan, N bağlı glikozilasyon için kritik bir rol işlevsiz B hücreleri üzerinde CD22 tanıma için potansiyel etkileri ile saptandı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">0.22 &#956;m Steritop filter</td>
			<td style="width:163px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:155px;">SCGPS02RE</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x glycobuffer 3</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td>Comes with Endo H reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10x Kinetics Buffer</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:155px;">18-1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">1 mL round bottom 96 well block</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">22 mm cover slip</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">96-3 well INTELLIPLATE&#160; low volume reservior</td>
			<td style="width:163px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:155px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Pure</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#196;KTA Start&#160;</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Auto-iTC200</td>
			<td style="width:163px;">Malvern</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR4-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Dry Bath</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660562EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Endo H</td>
			<td style="width:163px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:155px;">P0702S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP</td>
			<td>TriForest Labware</td>
			<td>FBC05000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>768180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Freestyle 293F cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R79007</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freestyle Expression medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12338001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Au</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-444</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Hg</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-446</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M1</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-448</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens M2</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-450</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Heavy Atom Screens Pt</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR2-442</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK 293S</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-3022</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisTrap Affinity Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17525501</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17545811</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17548211</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block</td>
			<td style="width:163px;">Anatrace</td>
			<td style="width:155px;">MCSG-4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Mercuric chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">1044170100</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:155px;">655209</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Minstrel DT UV</td>
			<td style="width:163px;">Formulatrix</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitron Pro shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>MP25-TA-CO2HB</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:345px;">Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">ND-2000</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Nanosep 3K Omega centrifugal device</td>
			<td style="width:163px;">PALL Life Science</td>
			<td style="width:155px;">OD003C33</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA biosensors</td>
			<td>PALL Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5102</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Octet RED96</td>
			<td style="width:163px;">PALL ForteBio</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Oryx 4 crystallizaiton robot</td>
			<td style="width:163px;">Douglas Instrument</td>
			<td style="width:155px;">ORY-4/1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Platinum chloride</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">520632-1g</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210006</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Coomassie Stain</td>
			<td>Protein Ark</td>
			<td>GEN-QC-STAIN-1L</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 &#181;m Millipore Express</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">28990944</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Superose 6 10/300 GL</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17517201</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Tantalum bromide cluster</td>
			<td style="width:163px;">Jena bioscience</td>
			<td style="width:155px;">PK-103</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Top96 Crystallization Screen</td>
			<td style="width:163px;">Rigaku Reagents</td>
			<td style="width:155px;">1009846</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryphan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">VDX 24-well with sealant</td>
			<td style="width:163px;">Hampton research</td>
			<td style="width:155px;">HR3-172</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#945;2-6 sialyllactose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A8556-1mg</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by x-ray crystallography and biophysical techniques

Hücre yüzeyinde glikoproteinlerin hücresel işlevde, sinyalizasyon, yapışma ve ulaşım dahil olmak üzere önemli rol oynarlar. Lökosit üzerinde bu glikoproteinlerin çeşitli immünglobulin (Ig) kıvrımlar sahip ve bağışıklık tanıma ve düzenleme için merkezi. Burada, tasarım, ifade ve insan B hücre reseptörü CD22 ekstrasellüler etki alanının biyofiziksel karakterizasyonu için bir platform mevcut. Önerdiğimiz bu yaklaşımlar geniş IG etki alanları içeren memeli glikoprotein ectodomains karakterizasyonu için geçerlidir. İki süspansiyon insan embriyonik böbrek (HEK) hücre hatları, HEK293F ve HEK293S, glukanlardir, karmaşık ve yüksek-mannoz sırasıyla barındırmaktan glikoproteinlerin ifade etmek için kullanılır. Bu rekombinant glikoproteinlerin farklı glycoforms ile glycan boyut ve ligand taşıması kompozisyona etkisini araştıran izin. Biz kinetik ve termodinamik glikoprotein bağlamanın biyolojik ilgili ligandlar ve terapötik antikor adayları için eğitim için protokol tartışıyorlar. Rekombinant glikoproteinlerin HEK293S hücrelerinde üretilen kristalizasyon glycan homojenizasyon, azaltılmış esneklik ve endoglycosidase H tedavi duyarlılık nedeniyle mükellef bulunmaktadır. Biz ağır atomlar ve faz belirlenmesi ve ligand taşıması, analizi için küçük moleküller glikoprotein kristallerle sırasıyla iliklerine için yöntemler mevcut. Tartışılan deneysel protokoller burada sözü işlevlerine fikir vermek ve tedavi hareket mekanizması araştırmak memeli glikoproteinlerin karakterizasyonu için tutun.

CD22 ECD olan birkaç yapılar başarılı bir şekilde pHLsec ifade vektör klonlanmış ve memeli HEK293F ve HEK293S hücre hatlarında (Şekil 2 ve 3A) overexpressed. Tüm yapıları boyutu homojenliği için boyut dışlama Kromatografi tarafından saf ve kristalizasyon çalışmalar (Şekil 3B ve 3 C) için son derece saf bir örnek vermiştir. HEK293S hücreleri, böyle sadece beş altı öngörülen N bağlı glikozilasyon sitelerin Asn Ala (N67A, N112A, N135A, N164A ve N231A), mutasyona uğramış d1-d3 kesme (artıkları 20-330), üretilen iyi diffracting kristal liderliğindeki CD22 yapısı yapıldı Glikozilasyon sitesi konumunda N101 muhafaza (bu yapıyı CD22 adlı20-330, 5A). Kristalleri MCSG-1 seyrek matris ekran çeşitli koşullarda elde edildi, ama en iyi kristaller bir durum içeren %30 (w/v) Polietilen glikol 4000, 0.2 M Lityum klorür ve 0.1 M Tris pH 8,5 vardı. Bu doğal kristaller 2.1 Å çözünürlük için diffracted; ilgili Siglec proteinlerin IG etki alanlarının bilinen yapıları kullanarak herhangi bir çözüm Bay aramalarında vermemiştir.
Aşamalı bilgi almak için yerel bir panel ha bileşik bir kuluçka süresi 5 dk dan 1 d (Şekil 4) için 1-20 mM arasında değişen konsantrasyonlarda Hg, Pt, işletim sistemi, Ta ve Br dahil HA bileşiklerin kristallerle batırılmış. Biz kristalleri morfoloji değişimler için izlenen ve bulundu kristalleri ile HA 20 mM bileşik batırılmış hızlı çatlama ve kristal eriterek sonuçlandı. Tantal bromür küme, platin klorür, cıva asetat ve Merkuris klorür ile sırılsıklam set kuluçka kez takip onların şekil muhafaza 63 kristalleri toplam dondu. Kristalleri Merkuris klorür 30 dk (Saskatoon, Kanada) Kanadalı ışık kaynağı (CLS) 08-BM beamline adlı bir floresan taramasında anormal sinyal gösterdi için 7 mM ile ıslatılmış ve çoklu dalga boyu anormal dağılımı tek bir x-ışını veri toplama için izin Kristal. Bu veri kümeleri bize CD22 Merkür altyapı çözmek izin ücretsiz bir sistein pozisyonda C308 bağlı ve sonuçta bize CD22 yapısını oluşturmak için izin tek Merkür atom ortaya20-330, 5A,20-330, 5A aşamalı içine AutoBuild78elektron yoğunluğu eşlem'i kullanma.
Unliganded yapısı çözüldü sonra biz onun ligand α2-6 siallylactose bağlı CD22 yapısını çözmek için ilgi vardı. Biz ilk CD22 benzeşme α2-6 sialyllactose ITC etkileşim bağlama termodinamik karakterize etmek için kullanarak doğru hesaplanır. ~ 280 µM bir ilgi gözlenen ve bu bilgileri bir başlangıç konsantrasyonu tanımlamak için kullanılan (~ 100 KDx) ligand yerel bizim CD2220-330, 5A kristalleri iliklerine için kullanmak için bir. Biz 25 mM siallylactose 5 dk, 2 h, 14 h, 40 h ve 5 d için CD2220-330, 5A kristallerle batırılmış ve kristal morfoloji değişimler için izlenir. ~ 75 kristalleri toplam çeşitli zaman puan donmuş ve CLS sinkrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Kanada) uzaktan veri toplama için gönderdi. Toplam altı X-ray veri kümeleri iyi diffracting kristalleri toplanan. Her x-ışını veri kümesi yapısından bir ilk arama model olarak unliganded CD2220-330, 5A yapısı kullanarak MR tarafından çözüldü. Tüm veri kümeleri için elde edilen elektron yoğunluğu sonra olumlu yoğunluk α2-6 sialyllactose CD22 sitenin bağlama bağlı karşılık gelen Fo-Fc harita için kontrole tabi tutuldu. Dikkat çekici, tüm veri kümeleri toplanan, hatta sadece 5 dk kuluçka süresi, içerdiği sonra olumlu yoğunluğu ligand bağlayıcı sitedeki karşılık gelen batırılmış kristalleri dan. Unliganded ve liganded CD22 genel yapıları α2-6 sialyllactose ile iliklerine deneyler başarısını açıklayabilir en az konformasyon değişiklikleri ile çok benzer.
Biz sonraki terapötik antikor epratuzumab saçınıza ve ITC deneylerde (Şekil 5) tarafından tanınan CD22 antijenik yüzey ile karakterize. CD22 yapıları farklı glycoforms ile epratuzumab Fab bağlama kinetik ve Termodinamik profilleri ile azaltılmış N bağlı glycan büyüklük, CD22 için artan bir ilgi ile daha küçük glukanlardir (327 nM vs 24 nM için ilgi 14-fold bir düzelme kadar ortaya BLI; 188 nM vs 58 nM ITC içinde). Erişimi kısıtlama CD22 N bağlı glycan onun epitope için antikor, tek-noktaya mutantlar CD22, kullanarak saçınıza ve epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 Co kristal yapısı28çözme tarafından tespit edilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Resim 1 . Biyofiziksel ve yapısal karakterizasyon için yapı tasarım glikoprotein karakterizasyonu bakış. (1) temsilcisi glikoprotein birincil dizi analizi. Grey, ekstrasellüler etki alanı (ECD); yeşil transmembran (TM) kesimi; ve mavi, glikoprotein sitozolik etki. Tahmin edilen glukanlardir N bağlı olarak etiketlenmiştir. ECD yapıları, (2) klonlama. (3) ifade ECD memeli hücrelerinde oluşturur. (4) glikoprotein arıtma. Proteinlerin HEK293F içinde karmaşık glukanlardir içerirken, proteinlerin HEK293S içinde-ecek-si olmak yüksek mannoz glukanlardir. Enzimatik glikoproteinlerin tedavisinde HEK293S hücrelerde glikoproteinlerin ile sadece bir GlcNAc yan N bağlı glikozilasyon sitelerdeki sonuçlarında Endo H ile üretilen. (5a) glikoproteinlerin antikorlar için kendi bağlama için biolayer Interferometry (BLI) ve izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından test edilir. Küçük ligandlar benzeşimi da ITC tarafından ölçülebilir. (5b) kristalizasyon denemelerin glikoproteinlerin olanlar HEK293S ve deglycosylated bazı durumlarda, Endo H. (6) ile ifade gibi homojen N bağlı glukanlardir ile mutasyon N bağlı glikozilasyon sitelerin kristalleri elde etmek gereklidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Resim 2 . DNA yapıları ifade memeli hücrelerinde CD22 ectodomain tasarımını. A) CD22 ECD yapıları, geçici transfection için kullanılan pHLsec plazmid gösterimi. AgeI ve KpnI siteleri klonlama için kullanılan kırmızı kutuları ile gösterilir. B) CD22 ECD yedi IG etki alanları (d1-d7) ve 12 öngörülen N bağlı glikozilasyon siteleri (mavili) içerir. Dört yapıları CD22 ECD tasarlanmıştır. C) % 1'özel jel CD22 ECD PCR amplicons gösterilen oluşturur pHLsec memeli ifade vektör klonlama için. İlk lane 1 kb DNA işareti içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Şekil 3 . İfade ve glikoproteinlerin saflaştırılması. A) hücre yoğunluğu ifade verim üzerine etkisi. Küçük ölçekli 25 mL kültür glikoprotein ifadede HEK293F süspansiyon hücre hücre (0.5 x 106 hücre mL-1, 106 hücre mL-1x 1.0 ve 1.5 x 106 hücre mL üç farklı başlangıç yoğunlukları kullanarak transfected -1). Miktar sol panelinde SDS-sayfasından Dansitometresi ve nicel BLI içinde doğru kapı aynası tarafından gerçekleştirilen. Bir glikoprotein hazırlık temsilcisi değerlerdir. B) için ilk arıtma adımının kromatografik inşa CD2220-330, 5A Ni-NTA benzeşme sütun kullanarak süpernatant 600 mL üzerinden. Glikoprotein % 100 500 mM imidazole içerir elüsyon arabelleğin kaynakçalara imidazole (gri hat), bir degrade kullanarak eluted. Havuza alınan kesirler dikey çizgiler ile tasvir edilir. C) boyutu-dışlama kromatografik için inşa CD22 yüksek performanslı kullanarak20-330, 5A jel filtrasyon sütun. Havuza alınan kesirler elüsyon pik üzerinden dikey çizgiler ile tasvir edilir. İç metin: glikoprotein saflığı gösterilen Coomassie lekeli SDS-sayfa jel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Şekil 4 . Kristal ile Ağır atomları iliklerine. A) örnek iş istasyonu yerel HA bileşikler kristallerle iliklerine için. Gerekli tüm araçları olarak etiketlenmiştir. B) adımları kristalleri emmek için takip inşa CD2220-330, 5A HA bileşikler ile. 1. adımda, aç de kristaller ve öyle ki HA son konsantrasyonu 1-10 mM arasında değişmektedir kristalizasyon durumda seyreltilmiş HA solüsyon içeren bir kapak notu üzerindeki bir 0.2 µL damla için bir döngü kullanarak transfer kristaller. 2. adımda, kristalizasyon plaka içinde belgili tanımlık damla mühür ve farklı süreler için bileşik HA kristallerle kuluçkaya. Adım 3, döngü sırılsıklam kristal dağ ve arka-emmek için 30 üç ardışık 0.2 µl damla bir kapak fişinde reçete %20 (v/v) gliserol ile takıma anne içki solüsyon içeren s. 4. adımda, flaş sıvı azot ile beraber bir döngü monte kristal dondurma ve sinkrotron beamline için sevkıyatın Pak yerleştirebilirsiniz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Şekil 5 . Biolayer Interferometry ve İzotermik titrasyon Kalorimetre ölçümleri. A) temsilcisi BLI deney. Üst panel: plaka kurulum nerede şu etiketlenir bir kinetik deney örneği: 1 x kinetik tampon (B), onun6 x-tagged glikoprotein (L) yükleme, temsilcisi Fab konsantrasyonları (500, 250, 125, 62.5 nM), PBS + 500 mM rejenerasyon tampon (B) arabellek (R) ve kinetik nötralizasyon x 1. Her şey 200 µL çözüm içerir. Adım numarası kinetik deney için plaka üst kısmında gösterilir. Orta paneli: Ni-NTA biyosensörler kullanılarak gerçekleştirilen BLI deney ve üst paneldeki açıklanan plaka temsilcisi ham veri. Adım sayılar temel (1),6 x glikoprotein (2) yükleme, temel (3), seri seyreltme Derneği Fab (4) ve ayrılma (5) için karşılık gelir. Yeniden oluşturma işlemi adımlar değildir (adım 6-7) temsil. Alt paneli: Temsilcisi analiz veri ham Derneği ve buna karşılık gelen ile ayrılma (mavi çizgi) gösterilen 1:1 (kırmızı çizgi) uygun. B) üst panel: temsilcisi plaka Kur'u tek bir ITC için otomatik bir ITC cihazda bir 96-kuyu alt blok yuvarlak yedi deneyler ile. Her deney üç kuyu oluşur. İlk kuyu (kırmızı) karşılık gelen hücre (400 µL) için örnek, örnek şırınga (120 µL) için ikinci iyi (yeşil) karşılık gelir. Üçüncü de boş bırakılır ve karma örnekleri için de deney tamamlanmasının ardından iade edilecektir. Deneyler 1, 2 ve 7 arabellek arabellek denetimlere uygulanır. Deney 3-5 onaylatılacak deneyler glikoprotein (P) ile hücre ve Fab veya ligand (L) içinde belgili tanımlık tenkıye temsil eder. Deney 6 bir ligand ısı seyreltme denetiminin temsil eder ve 3-5 deneylerden veri çözümlemesi sırasında düşülen. Alt paneli: Temsilcisi ham (üst) ve CD22 ECD için bağlama Fab (epratuzumab) gösterilen işlenmiş (alt) ITC verileri HEK293F hücrelerinde üretilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques at JoVE.com

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

Liquids, Solids, and Intermolecular Forces

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...