Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

ونحن نشكر المختبر تشيرنوف كامل للمساهمة في التحسين والتحقق من هذا البروتوكول، لا سيما رادو ماريا وغالينا سيمينوفا. ونشكر أيضا أندري افيموف مرفق التصوير الخلية في مركز فوكس تشيس للسرطان. وأيد هذا العمل بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (R01 CA148805) إلى جيمي كارتر.

1-إعداد الحلول
<ol><li>إعداد حل مثبت: بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x. 10 مل، تأخذ 2.5 مل من 16% منهاج عمل بيجين وإضافة 7.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. المخاطر: منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان في الجرعات المنخفضة. الأدخنة وتماس الجلد تعتبر خطرة. مخزن في-20 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد حل pe...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

وجدنا أنه من المفيد استخدام الشرائح الزجاجية الدائرة لهذه التجربة، كما أنها مريحة جداً لإجراء التجربة مع العديد من خطوط الخلايا (14-16)، وليس هناك حاجة تغيير النموذج كل مرة أثناء التحليل المجهري. قد تنشأ مضاعفات قليلة، مثل خطر متزايد للتلوث عبر مع الأجسام المضادة. ولذلك، فإننا نقترح الغسيل ?...

تم ربط تعطل إشارات MST1/فرس النهر إلى اضطرابات النمو والتسرطن1. في الثدييات، وتنشيط مؤنزم MST1 و MST2 (فوسفوريلاتي) MOB1 و LATS1/2، هذه الأخيرة التي ثم فوسفوريلاتيس ويحللها المنشط المشارك النسخي البروتين المرتبط بنعم (ياب)2. في شكله النشط (أونفوسفوريلاتيد)، وقد ياب النمطان النشاط، تعزيز النسخ من خلية انتشار الجينات؛ على العكس من ذلك، عندما يتم إلغاء تنشيطه ياب بالمسار فرس النهر، ويتم منع انتشار الخلايا وشجعت المبرمج3. في الأنسجة، MST1 و MST2 موجودة أساسا ك homodimers النشطة، ولكن النمطان المحفزات يمكن أن تزيد من مستويات heterodimers MST1/MST2، وهذه هيتيروديميرس هي غير نشط4. ولكن كيف ينظم هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 ما زالت غير مفهومة. كل إنسان-وهيتيروديميرس بالوساطة عن طريق التفاعلات بين مناطق لفائف ملفوف ج-الطرفية MST1 و MST2 المعروفة باسم سارة المجالات5. استخدام في الموقع أثبت جيش التحرير الشعبي الصيني في هذه المقالة، نحن إظهار وجود heterodimers MST1/MST2 في الخلايا خلايا شوان البشرية (HSC) و "الكلي الجنينية البشرية" (HEK-293). جيش التحرير الشعبي الصيني لديه ميزة على أخرى أساليب الكشف عن التفاعل البروتين/البروتين لأنه يسمح بالكشف عن تفاعلات البروتين البروتين الذاتية، التي يمكن تحديدها وقياسها كمياً دون الحاجة للتعبير التحوير أو استخدام العلامات حانمه 6.
إرسال الإشارات تنبيغ مسارات هي تسيطر إلى حد كبير في الرابطة الشرطية من البروتينات المكون. على سبيل المثال، يؤدي تنشيط مستقبلات معظم تيروسين مؤنزم ثنائي هومو أو المتغايرة ورابطة اللاحقة مع إضافية البروتينات الإشارات داخل الخلايا، وهي نفسها شكل مجمعات أخرى. وغرض أسلوب جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التقارب بين البروتينات في الخلايا، شريطة أن البروتينات أقل من 30-40 نانومتر وبصرف النظر. عادة ما يتم الكشف عن قرب البروتين بأول حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة (على سبيل المثال. وارنب وفار) ضد كل من البروتين المتفاعلة، ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية إبلاغها، يسبر الحمض النووي قبل المقرونة بالقصير. إذا المسابير الحمض النووي على مقربة، في نفس الوقت ربط اليغنوكليوتيد الحمض النووي محددة تربط بين كلا من هذه التحقيقات، تشكل منبرا للتضخيم في الموقع PCR أو المتداول إليه دائرة. تسمح العلامات الفلورية إضافة إلى رد فعل التضخيم التصور البروتينات المتفاعلة، والتي تظهر كنيون النقاط التي يمكن قياسها كمياً والمترجمة إلى مناطق معينة في الخلية7،8، سهولة 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

تفاعلات البروتين البروتين ينظم مبدأ توجيهيا لإحداث إشارات كثيرة، والكشف عن مثل هذه الأحداث عنصر هام في فهم كيفية تنظيم هذه المسارات وكيفية عملها. هناك العديد من الطرق للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا، ولكن عدد قليل نسبيا يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الذاتية. أحد هذه الأساليب، مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي)، له العديد من المزايا التوصية باستخدامها. مقارنة بالأساليب الأخرى الشائعة لتحليل التفاعل البروتين-بروتين، جيش التحرير الشعبي الصيني لديه حساسية عالية نسبيا وخصوصية، يمكن أن يؤديها بالتلاعب بالخلية الحد الأدنى، وفي البروتوكول الموضحة هنا، يتطلب اثنين فقط محددة الهدف الأجسام المضادة المستمدة من مختلف الأنواع (مثلاً.، من الماوس والارنب) وكاشف المتخصصة واحد: مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية التي هي النوكليوتيد مرتبط تساهميا محددة، عندما جلبت على مقربة من بعضها البعض، إنشاء منهاج أمبليفيابل في الموقع PCR أو المتداول دائرة التضخيم. في هذا العرض التقديمي، نعرض كيفية تطبيق تقنية جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التغييرات في قرب MST1 و MST2 في الخلايا الثابتة. الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة ينطبق خاصة لتحليل الخلايا مما يشير إلى دراسات.

قمنا باستخدام مقايسة جيش التحرير الشعبي الصيني لاختبار التفاعل بين MST1 و MST2 في HEK-293 وإيهسك. الخلايا الثابتة، بيرميبيليزيد، وملطخة بالأجسام المضادة المختلفة، تليها التضخيم في الموقع وفقا للبروتوكول بجيش التحرير الشعبي الصيني (الشكل 1). لتوثيق مستوى ه?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

هنا، نحن تظهر كيفية استخدام مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي) لتصور هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 في الخلايا الثابتة مع حساسية عالية.

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

في الموقع القرب مقارنة Assay أو جيش التحرير الشعبى الصينى، هي تقنية قادرة على الكشف عن التفاعلات بين البروتينات والأنسجة الملصقة والخلايا. يمكن تحديد الروابط بين البروتينات وتحديدها كمياً دون الحاجة إلى التعبير المعدل وراثياً أو التكنولوجيا الإضافية. والشرط الوحيد هو توافر أجسام مضادة محددة عالية الكفاءة يمكن تعديلها باستخدام أليوغنوكليوتيدات الحمض النووي.في الأنسجة MST1 و MST2 موجودة أساسا كما هموديمير نشطة، ولكن المحفزات على الحساسية يمكن أن تزيد من مستوى MST1 MST2 heterodimers ومثل هذه هيتيروديمرات غير نشطة. بعد الحضانة مع أجسام مضادة التمهيدي محددة ضد البروتينات من الفائدة، يتم إضافة أجسام مضادة ثانوية محددة خاصة، كل إلى فريدة من نوعها، قصيرة، حبلا الحمض النووي مجانية تعلق عليه، إلى فتحة لربط الأجسام المضادة الأولية. إذا كانت البروتينات في الأسئلة هيترموديرized، كل من الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية ملزمة لهم سيكون على مقربة.في هذه الحالة، يمكن أن تتفاعل خيوط الحمض النووي المرفقة على الأجسام المضادة الثانية من خلال إضافة لاحقة من اثنين من أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الأخرى تشكيل دائرة. يمكن أن يحدث تكرار عدة مئات من دائرة الحمض النووي بعد تفاعل التضخيم ويتم إنشاء إشارة الفلوريسنس عن طريق مسابير أوليغونوكليوتيدات مجانية. لذلك، يتم تصور كل إشارة تم الكشف عنها كنقطة فلورية فردية يمكن تعيينها إلى موقع فرعي محدد استنادًا إلى صور المجهر.في اليوم السابق للتجربة، معطف 16 الشرائح جيدا الغرف بإضافة 50 إلى 100 ميكرولترات من الفأر أو بولي-L-ليسين واحتضان في 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة إزالة حل الباردة، وتقسيم الخلايا باستخدام تريبسين ولوحة 15، 000 إلى 25، 000 الخلايا في بئر إلى 16 الشريحة جيدا الغرف. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة 5٪ لمدة 24 ساعة.بعد 24 ساعة، قم بإزالة الوسط من الآبار وغسل الخلايا بلطف باستخدام PBS. استخدام micropipette لتقليل المخاطرة من العينة ثم التعرق في برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من 4٪ PFA في البئر واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. لا pipette الحل مباشرة على الخلايا، كما أن ذلك قد يؤدي إلى مفرزة من الخلايا.بعد التثبيت، وغسل الخلايا مع TBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل مع الانفعالات خفيفة. المقبل permeabilize الخلية واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. بعد اكتمال permeabilization، وغسل الخلايا مع TBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل مع الانفعالات.بعد إزالة TBST إضافة قطرة واحدة من حل حجب في كل بئر واحتضان الشرائح في غرفة الرطوبة مسخن مسبقا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. تمييع الأجسام المضادة الأولية. قم بإزالة حل الحجب باستخدام ميكروسيبيت ولكن لا تسمح بالجفاف.دوامة وإضافة 40 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة المخففة إلى الآبار المناسبة واحتضان العينات في 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة محمّاة مسبقا لمدة ساعة واحدة. أثناء الحضانة، تمييع اثنين من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى في تخفيف الأجسام المضادة. لكل عينة إعداد 40 ميكرولترات من تحقيق جيش التحرير الشعبي.بعد ساعة واحدة من الحضانة، التعرق حل الأجسام المضادة وغسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق مع TBST في درجة حرارة الغرفة. إزالة بلطف TBST من الشرائح وإضافة 40 ميكرولترات من حل التحقيق جيش التحرير الشعبى الصينى إلى كل بئر. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة محمّاة مسبقا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.دوامة وتمييع الكميات المطلوبة من المخزون الربط 1 إلى 5 في المياه عالية النقاء مباشرة قبل الاستخدام. مطلوب 40 ميكروليتر من حل الربط لكل بئر. بعد الحضانة، إزالة حل جيش التحرير الشعبى الصينى من الشرائح وغسلها مرتين في TBST لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات.استخدام كتلة تجميد عند إزالة ligase من الفريزر وقبل إضافته إلى الخلايا، دوامة وتمييع مع حل الربط. إزالة TBST من الشرائح وإضافة 40 ميكروليترات من الحل ربط ربط لكل بئر. يحتضن الشرائح في غرفة الرطوبة محمّاة مسبقا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.بعد الاحتضان الحل وغسل مرتين مع TBST لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات. تجنب تعريض البئر للضوء الساطع حيث أن الكواشف حساسة للضوء. خلال الغسيل الأخير، دوامة وتمييع حجم متطلبات محلول التضخيم في المياه عالية النقاء مباشرة قبل الاستخدام.الحفاظ على البوليميراز على الجليد أو في كتلة التبريد وقبل إضافته إلى دوامة الخلايا وتمييع مع حل التضخيم. استلهمي تبت من الآبار وأضف 40 ميكرولترات من محلول التضخيم لكل بئر. يحتضن الشرائح في غرفة الرطوبة المحمّاة داكنة لمدة 100 دقيقة في 37 درجة مئوية.بعد الحضانة، وpireate محلول البوليميراز تضخيم من الشرائح وغسل مرتين عشر دقائق كل في TBST في درجة حرارة الغرفة. إزالة الغرف والسيليكون حول الآبار من الشريحة تماما. كشط قبالة الخرز المتبقية من السيليكون مع شفرة حلاقة.رسم شبكة على الشريحة التي تفصل كل بئر. إضافة ما يقرب من 40 ميكرولترات من المتوسطة المتصاعدة مع DAPI، وضمان أن لا فقاعات الهواء أن يتم القبض تحت زلة الغطاء. استخدام طلاء الأظافر لإصلاح غطاء الزجاج.يمكن إجراء التحليل المجهري في 20 دقيقة بعد التثبيت ، ولكن في الممارسة العملية نجد أنه من الأكثر ملاءمة لإجراء تحليل الصور في اليوم التالي. لتحليل العينات، نستخدم لايكا SP8 تكوين مجهر المسح الضوئي بالليزر. تظهر هنا أمثلة على مقايسة الربط القربي في الموقع تصور القرب بين البروتينات MST 1 و MST2 في خلايا الكلى الجنينية البشرية في الألواح A through D، وخلايا Schwann الإنسان في الألواح E من خلال H.In جميع الألواح نواة الخلية ملطخة باللون الأزرق من قبل DAPI والنقاط الحمراء تشير إلى إشارات اختبار التقارب الإيجابي الناتجة عن القرب الوثيق بين البروتينات المشار إليها.لوحة أ يظهر القرب من MST1 و MST2 وتظهر لوحة B القرب من ERK وphosphoERK كما هي هذه الظهارات على نفس البروتين. يمثل C لوحة التحكم السلبي مثل هذه الخلايا مثل MST1 و MST2 و D يمثل التحكم السلبي الثاني ملطخة الأجسام المضادة ل MST1 و ERK التي لا يتوقع أن تكون على مقربة من بعضها البعض. لوحات E وF إظهار القرب من MST1 مع MST2 وERK مع phosphoERK في خلايا Schwann.اللوحة G و H هي الضوابط السلبية الملطخة فقط مع الأجسام المضادة MST1 أو مع الأجسام المضادة MST1 و ERK. ومن الضروري استخدام الأجسام المضادة الأولية غير التفاعلية التي ينبغي أن تعترف عضو واحد فقط من هيتيروديمر. كما أنه من المهم أن نتذكر لاستخدام نصائح مختلفة لتجنب التلوث عبر الأجسام المضادة الأولية والتحقيقات جيش التحرير الشعبي، لتجنب لمس الجزء السفلي من البئر، وتجنب الأنابيب مباشرة على العينات.بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام PLA في الموقع لدراسة تضاؤل البروتين في الخلايا الثابتة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...