Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
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我们感谢整个切尔诺夫实验室为本议定书的优化和验证作出贡献, 特别是玛丽亚 Radu 和加林娜 Semenova。我们还感谢安德烈 Efimov 在福克斯大通癌症中心的细胞成像设施。这项工作得到了 NIH (R01 CA148805) 授予 JC 的资助。

1. 解决方案的准备
<ol><li>准备固定液: 1x PBS 中的4% 多聚甲醛 (PFA)。对于10毫升, 采取2.5 毫升 16% PFA 和添加7.5 毫升 1x PBS。 危害:PFA 在低剂量下致癌。烟雾和皮肤接触是危险的。存储在-20 摄氏度。</li>
	<li>准备透化解决方案: 1x PBS 中的0.1% 海卫 X-100。对于100毫升的溶液, 添加100µL 的海卫 X-100 到100毫升 1x PBS。在室温下贮存 (RT)。</li>
	<li>准备洗涤缓冲液: 1x TBST。对于 1 L, 采取100毫升 10x t...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

我们发现在这个实验中使用玻璃腔玻片是很有用的, 因为它非常方便地进行了几个 (14-16) 细胞系的实验, 并且在显微分析过程中无需每次更换样品。可能会出现一些并发症, 如抗体交叉污染的风险增加。因此, 我们建议单独洗涤, 而不是使用 Coplin 罐, 尽管实验持续时间延长。此外, 去除硅胶插入物是一件微妙的事情, 必须小心和耐心地做。即使采用细致的技术, 在移除刀片后, 有时也可以看到少量的硅...

MST1/Hippo 信号的中断已连接到发育紊乱和癌变1。在哺乳动物中, 激酶 MST1 和 MST2 激活 (磷酸化) MOB1 和 LATS1/2, 后者随后 phosphorylates 和失活转录共同激活剂 Yes 相关蛋白 (叶)2。在其活性 (unphosphorylated) 形式中, 叶叶具有致癌活性, 增强细胞增殖基因的转录;反之, 当叶叶被河马通路灭活时, 细胞增殖被抑制, 凋亡提升3。在组织中, MST1 和 MST2 主要作为活性 homodimers 存在, 但致癌刺激可以增加 MST1/MST2 异的水平, 这种异是不活动的4。然而, MST1/MST2 heterodimerization 的监管方式仍然不甚了解。通过MST1 和 MST2 (称为萨拉域5) 之间的相互作用, 可以介导异和均质。本文用原位PLA 演示了 MST1/MST2 异在人雪旺细胞 (HSC) 和人胚肾细胞 (HEK-293) 中的存在。PLA 优于其他蛋白质/蛋白质相互作用检测方法, 因为它允许检测内源蛋白-蛋白质相互作用, 可以识别和量化, 无需转基因表达或使用表位标记6。
信号传导通路主要由成分蛋白的条件关联控制。例如, 大多数受体酪氨酸激酶的刺激导致他们的二聚和随后与其他细胞内信号蛋白的关联, 它们本身形成进一步的复合物。PLA 方法的目的是可视化细胞中蛋白质之间的接近, 只要蛋白质小于 30-40 nm。蛋白质接近通常是通过在不同的物种 (例如, 兔子和老鼠) 中培养出适当的原代抗体, 然后添加特定于物种的二次抗体, 来检测细胞,预耦合到短 DNA 探针。如果 dna 探针接近, 一个特定的链接 dna 寡核苷酸可以同时绑定这些探针, 形成一个平台, 通过原位PCR 或滚动循环机制进行放大。添加到扩增反应中的荧光标记允许可视化的相互作用的蛋白质, 它显示为荧光点, 可以很容易地量化和本地化到单元格7,8中的特定区域,9,10。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

调控蛋白质-蛋白质相互作用是许多信号事件的指导原则, 而检测此类事件是了解这些途径是如何组织和如何运作的重要因素。在细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法很多, 但相对较少的人可以用来检测内源蛋白之间的相互作用。一个这样的方法, 近距离结扎法 (PLA), 有几个优点, 建议使用它。与其他常用的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法相比, PLA 具有较高的灵敏度和特异性, 可以用最小的细胞操作进行, 并且, 在本文所述的协议中, 只需要两个目标特定的来自不同物种 (例如, 从老鼠和兔子) 和一个专门试剂的抗体: 一组与特定的寡核苷酸共价连接的二次抗体, 当彼此靠近时, 产生一个扩增原位PCR 或滚动圆扩增的平台。在本演示中, 我们展示了如何应用 PLA 技术来可视化固定细胞中 MST1 和 MST2 接近的变化。本手稿中描述的技术特别适用于细胞信号研究的分析。

我们使用 PLA 测定法测试 HEK-293 和 iHSC 中 MST1 与 MST2 的相互作用。细胞固定, 透化, 染色与各种抗体, 其次是原位扩增根据 PLA 协议 (图 1)。为了记录 MST1/MST2 heterodimerization 的水平, 细胞被 MST1 和 MST2 抗体染色 (图 1A、1C 和 1G)。作为一个积极的控制, 我们也使用 erk 和振作抗体, 预期是在细胞与激活的 ERK (<strong clas...

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

在这里, 我们展示了如何使用接近结扎法 (PLA) 在高灵敏度的固定细胞中可视化 MST1/MST2 heterodimerization。

原位近接结扎法检测蛋白异构体的 Heterodimerization

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

原位接近结扎分析或PLA，是一种能够检测蛋白质、附着组织和细胞之间的相互作用的技术。蛋白质之间的关联可以识别和量化，而无需转基因表达或额外的技术。唯一的要求是提供特定的高效抗体，可以使用DNA寡核苷酸进行修饰。在组织中，MST1 和 MST2 主要作为活性同质体存在，但原生刺激可增加 MST1 MST2 异质剂的水平，此类异质剂处于非活动状态。与感兴趣的蛋白质进行特定底基因抗体的孵育后，将特殊的特异性二级抗体添加到插槽中，与附着在该蛋白上的独特、短、免费DNA链相连，以结合初级抗体。如果问题中的蛋白质是异质化的，则与它们结合的初级抗体和二级抗体都将非常接近。在此状态下，第二个抗体上附加的DNA链可以通过随后添加另外两个形成圆的DNA寡核苷酸进行相互作用。在扩增反应和荧光信号通过水平的互补寡核苷酸探针产生荧光信号后，DNA圆可以进行几百倍的复制。因此，每个检测到的信号都可视化为单个荧光点，可以根据显微镜图像分配给特定的亚细胞位置。在实验前一天，通过加入50至100微升小鼠层胺或聚L-lysine，在37摄氏度下孵育，对16个密室良好的幻灯片进行涂装。30分钟后去除冷溶液，使用 Trypsin 和板 15，000 到 25，000 个细胞每井分成 16 个良好的腔滑梯。在37摄氏度的加湿5%二氧化碳培养箱中孵育细胞24小时。24 小时后，从井中取出介质，用 PBS 轻轻清洗细胞。使用微管，以尽量减少样品的风险，然后吸气PBS和修复细胞，通过添加50微升4%PFA每井和孵化10分钟室温没有搅拌。不要将溶液直接移液到细胞上，因为这可能导致细胞分离。固定后，用TBST清洗细胞三次，每次用轻度搅拌五分钟。接下来渗透细胞，在室温下孵育10分钟，无搅拌。渗透完成后，用TBST清洗细胞三次，每次搅拌洗涤五分钟。去除 TBST 后，将一滴阻尼溶液添加到每个孔中，并在预热湿度室中孵化幻灯片一小时，温度为 37 摄氏度。稀释原抗体。使用微管拆下阻塞溶液，但不允许滑轨干燥。Vortex 将稀释的抗体溶液的 40 微升添加到适当的孔中，并在预热湿度室中孵育样品在 37 摄氏度下一小时。在孵育过程中，用抗体稀释剂稀释两个PLA探针。每个样品准备40微升的PLA探头。孵育一小时后，吸出抗体溶液，并在室温下用TBST洗涤两次，用TBST清洗五分钟。从滑轨中轻轻取出 TBST，并在每个孔中加入 40 微升的 PLA 探针溶液。在37摄氏度的预热湿度室中孵育滑梯一小时。在使用前立即将连接液中所需的体积 1 至 5 中的涡流稀释。每井需要40微升的结扎溶液。孵育后，从幻灯片上取出PLA溶液，在TBST中清洗两次，在室温下搅拌五分钟。从冰柜中取出连体时，在将其添加到细胞中之前，使用冷冻块，用结扎溶液进行涡流和稀释。从幻灯片上取出 TBST，并将 40 微升的结扎连接溶液添加到每孔中。在37摄氏度的预热湿度室中孵育30分钟。孵育后吸气溶液，用TBST洗涤两次，在室温下搅拌五分钟。避免将井暴露在明亮的光线下，因为试剂对光敏感。在上次洗涤过程中，在使用前立即将高纯度水中的放大溶液的体积进行涡流和稀释。将聚合酶放在冰上或冷却块中，然后加入细胞漩涡，用扩增溶液稀释。从油井中吸出 TBST，并在每口油井中加入 40 微升的扩增溶液。在37摄氏度的黑暗预热湿度室中孵育100分钟。孵育后，从幻灯片中吸出扩增聚合酶溶液，并在室温下在TBST中各洗涤两次10分钟。从滑轨上完全拆下油井周围的腔室和硅胶。用剃须刀刮掉剩下的硅胶珠子。在幻灯片上绘制一个分隔每个井的网格。使用 DAPI 添加约 40 微升的安装介质，确保没有气泡在盖滑下被捕获。使用指甲油固定盖玻璃。固定后20分钟内即可进行显微分析，但在实践中我们发现第二天进行图像分析最方便。为了分析样品，我们使用 Leica SP8 配置激光扫描显微镜。此处显示的示例包括：在面板 A 至 D 中，将人类胚胎肾细胞中的 MST 1 和 MST2 蛋白质的接近性可视化，面板 E 到 H.In 中所有面板中的人类 Schwann 细胞被 DAPI 染成蓝色，红点表示指示的蛋白质之间的接近产生的正接近结扎检测信号。面板 A 显示 MST1 和 MST2 的接近性，面板 B 显示 ERK 和磷的接近性，因为这些表位位于同一蛋白质上。面板 C 表示负对，因为这些细胞（如 MST1 和 MST2）以及面板 D 表示沾染 MST1 和 ERK 抗体的第二次阴性对照，预计它们不会彼此接近。面板 E 和 F 显示 MST1 与 MST2 和 ERK 与 Schwann 细胞中磷磷的接近性。面板 G 和 H 是仅与 MST1 抗体或 MST1 和 ERK 抗体染色的阴性对比。必须使用非交叉反应原抗体，因为它应该只识别异质剂的一个成员。此外，重要的是要记住使用不同的提示，以避免初级抗体和PLA探针交叉污染，避免接触井底，并避免直接在样品上移液。看完这段视频后，你应该对如何使用原位PLA研究固定细胞中的蛋白质二化有了很好的了解。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

使用中性毛细管单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

科研

生物化学

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

通过免疫共沉淀在核质馏分蛋白质相互作用的可视化和<em&gt;原位</em&gt;接近结扎分析

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

原子力显微镜对单蛋白质分子的力谱

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

毛细管电聚焦法对蛋白质及其亚型的高灵敏度和定量检测

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

采用自动结晶耦合原位动态光散射的不同尺寸生长蛋白晶体

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

膜分馏和 gtpase-关联免疫吸附法检测小 gtpase 预基化和 gtp 结合

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...