Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Vi takker hele Chernoff laboratoriet for at bidrage til optimering og validering af denne protokol, navnlig Maria Radu og Galina Semenova. Vi takker også Andrey Efimov af celle Imaging facilitet på Fox Chase Cancer Center. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01 CA148805) at JC.

1. forberedelse af løsninger
<ol><li>Forberede Fikseringsvæske løsning: 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS. Til 10 mL, tage 2,5 mL af 16% PFA og tilsættes 7,5 mL af 1 x PBS. Farer: PFA er kræftfremkaldende ved lave doser. Dampe og hudkontakt er farlige. Opbevares ved-20 ° C.</li>
	<li>Forberede permeabilization opløsning: 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS. 100 mL af opløsningen, tilføje 100 µL af Triton X-100 i 100 mL 1 x PBS. Opbevares ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Forberede Wash Buffer: 1...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Vi har fundet det nyttigt at bruge glas kammer dias til dette eksperiment, da det er meget praktisk at udføre eksperimentet med flere (14-16) cellelinjer og der er ingen grund til at ændre prøven hver gang under mikroskopi analyse. Et par komplikationer kan opstå, såsom en øget risiko for krydskontaminering med antistoffer. Vi foreslår derfor, vask hver brønd individuelt i stedet for at bruge en Coplin krukke, trods øget varigheden af forsøget. Hertil kommer, fjernelse af silikone Indsæt er et delikat anliggen...

Afbrydelse af MST1/Hippo signalering har været tilsluttet udviklingsforstyrrelser og carcinogenese1. I pattedyr, aktivere kinaser MST1 og MST2 (phosphorylate) MOB1 og LATS1/2, hvor sidstnævnte derefter phosphorylates og inaktiverer transcriptional Co aktivator ja-forbundet protein (YAP)2. I sin aktive (unphosphorylated) form har YAP mutationer aktivitet, forbedre transskription af celle spredning gener; omvendt, når YAP er inaktiveret ved Hippo pathway, celledelingen er undertrykt og apoptose forfremmet3. I væv, MST1 og MST2 findes hovedsageligt som aktiv homodimers, men muterede stimuli kan øge niveauet af MST1/MST2 heterodimers og sådanne heterodimers er inaktive4. Men hvordan MST1/MST2 heterodimerization er reguleret forbliver dårligt forstået. Både homo- og heterodimers er medieret via interaktioner mellem C-terminale rullet coil regioner af MST1 og MST2 kendt som SARAH domæner5. Ved hjælp af en i situ demonstreret PLA i denne artikel vil vi vise tilstedeværelsen af MST1/MST2 heterodimers i menneskelige Schwann celler (HSC) og menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293). PLA har en fordel frem for andre protein/protein interaktion påvisningsmetoder, fordi det giver mulighed for påvisning af endogene protein-protein interaktioner, som kan identificeres og kvantificeres uden brug af transgenet udtryk eller brug af epitop tags 6.
Signaling transduktion veje er i vid udstrækning kontrolleret af sammenslutningen betinget af komponent proteiner. For eksempel, fører stimulering af de fleste receptor tyrosin kinaser til deres homo - eller hetero-dimerization og efterfølgende association med yderligere intracellulær signalering proteiner, der selv form yderligere komplekser. Formålet med metoden PLA er at visualisere nærhed mellem proteiner i cellerne, forudsat at proteinerne er mindre end 30-40 nm fra hinanden. Protein nærhed er normalt påvises ved første inkubere cellerne med passende primære antistoffer rejst i forskellige arter (fx., kanin og mus) mod hver interagerende protein, derefter tilføje artsspecifikke sekundære antistoffer, pre koblet til korte DNA sonder. Hvis DNA-sonder er tæt på, kan en specifik forbinder DNA oligonukleotid samtidigt binde begge disse sonder, danner en platform for forstærkning af i situ PCR eller rullende cirkel mekanisme. Fluorescerende tags tilføjet til forstærkning reaktion tillade visualisering af de interagerende proteiner, som vises som fluorescerende prikker, der let kan kvantificeres og lokaliseret til bestemte regioner i celle7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Reguleret protein-protein interaktioner er et ledende princip for mange signalering begivenheder, og påvisning af sådanne begivenheder er et vigtigt element i forståelsen af hvordan sådanne veje er organiseret og hvordan de fungerer. Der er mange metoder til at opdage protein-protein interaktioner i celler, men relativt få kan bruges til at registrere interaktioner mellem endogene proteiner. En sådan metode, nærhed ligatur assay (PLA), har flere fordele ved at anbefale dets anvendelse. Sammenlignet med andre almindelige metoder til analyse af protein-protein interaktion, PLA har relativt høj følsomhed og specificitet, kan udføres med minimal celle manipulation, og i den protokol, der er beskrevet heri, kræver kun to mål-specifikke antistoffer fremstillet af forskellige arter (fx., fra mus og kanin) og én specialiseret reagens: et sæt af sekundære antistoffer, der er kovalent knyttet til specifikke oligonukleotider, når bragt i umiddelbar nærhed af hinanden, skabe en amplifiable platform for i situ PCR eller rullende cirkel forstærkning. I denne præsentation viser vi hvordan du anvender PLA teknik til at visualisere ændringer i MST1 og MST2 nærhed i faste celler. Den teknik beskrevet i dette håndskrift er især relevante for analysen af celle signalering undersøgelser.

Vi brugte PLA analysen for at teste samspillet mellem MST1 og MST2 i HEK-293 og iHSC. Cellerne var fast, permeabilized og farves med forskellige antistoffer, efterfulgt af i situ forstærkning efter PLA protokol (figur 1). For at dokumentere niveau af MST1/MST2 heterodimerization, blev celler plettet af MST1 og MST2 antistoffer (figur 1A, 1 C og 1 G). Som positiv kontrol, vi brugte også ERK og kvikke an...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Vi viser her, hvordan en nærhed ligatur Assay (PLA) til at visualisere MST1/MST2 heterodimerization i faste celler med høj følsomhed.

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

In situ Proximity Ligation Assay eller PLA, er en teknologi, der kan detektere interaktioner mellem proteiner, anbragt væv og celler. Forholdet mellem proteiner kan identificeres og kvantificeres uden behov for transgene udtryk eller yderligere teknologi. Det eneste krav er tilgængeligheden af specifikke højeffektive antistoffer, der kan ændres med DNA oligonukleotider.I væv mst1 og MST2 findes hovedsageligt som aktive homodimerer, men onkogen stimuli kan øge niveauet af MST1 MST2 heterodimerer og sådanne heterodimerer er inaktive. Efter inkubation med specifikke primer antistoffer mod proteiner af interesse, særlige specifikke sekundære antistoffer, hver knyttet til en unik, kort, gratis DNA-streng knyttet til det, er føjet til slot til at binde sig til de primære antistoffer. Hvis proteinerne i spørgsmål er heterodimerized, både de primære antistoffer og sekundære antistoffer bundet til dem vil være i umiddelbar nærhed.I denne tilstand kan de vedlagte DNA-strenge på de anden antistoffer interagere gennem en efterfølgende tilføjelse af to andre cirkeldannende DNA-oligonukleotider. Flere hundredegange replikation af DNA-cirkel kan forekomme efter en forstærkning reaktion og en fluorescens signal genereres af nivelleret gratis oligonukleotid sonder. Derfor visualiseres hvert registreret signal som en individuel fluorescerende prik, som kan tildeles til en bestemt undercelleplacering baseret på mikroskopbilleder.Dagen før eksperimentet, pels 16 godt chambered dias ved at tilføje 50 til 100 mikroliter af mus laminin eller poly-L-lysin og inkubere ved 37 grader Celsius. Efter 30 minutter fjerne kold opløsning, opdele cellerne ved hjælp af Trypsin og plade 15, 000 til 25, 000 celler pr godt i 16 godt chambered dias. Inkuber celler ved 37 grader Celsius i en befugtet 5% kuldioxid inkubator i 24 timer.Efter 24 timer fjernes mediet fra brøndene, og cellerne vaskes forsigtigt med PBS. Brug en mikropipette til at minimere risikotagning af prøven, og inspirer derefter PBS og ret cellerne ved at tilsætte 50 mikroliter på 4% PFA pr. brønd og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur uden omrøring. Opløsningen må ikke pipettes direkte på cellerne, da det kan resultere i løsrivelse af cellerne.Efter fikseringen vaskes cellerne med TBST tre gange i fem minutter hver med mild omrøring. Næste permeabilize cellerne og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur uden omrøring. Efter permeabilisering er færdig, vaskes cellerne med TBST tre gange i fem minutter pr vask med omrøring.Efter fjernelse TBST tilføje en dråbe blokerende løsning i hver brønd og inkubere dias i en forvarmet luftfugtighed kammer i en time ved 37 grader Celsius. Fortyndet primære antistoffer. Fjern blokeringsopløsningen ved hjælp af en mikropipette, men lad ikke objektglas tørre.Vortex og tilsæt 40 mikroliter af den fortyndede antistofopløsning til de relevante brønde og inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i et forvarmet fugtighedskammer i en time. Under inkubationen fortyndes de to PLA-sonder i antistoffortyndingsmiddel. For hver prøve forberede 40 mikroliter PLA sonde.Efter en times inkubation aspirere antistofopløsningen ogglassene to gange i fem minutter med TBST ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt TBST fra objektglassene, og tilsæt 40 mikroliter af PLA-sondeopløsningen til hver brønd. Inkuber diasene i et forvarmet fugtighedskammer i en time ved 37 grader Celsius.Vortex og fortynde de nødvendige mængder af ligationsmassen 1 til 5 i vand med høj renhed umiddelbart før brug. 40 mikroliter af ligationsopløsningen er nødvendig for hver brønd. Efter inkubationen fjernes PLA-opløsningen fra objektglassene, og den vaskes to gange i TBST i fem minutter ved stuetemperatur ved omrøring.Brug en frysende blok, når du fjerner ligase fra fryseren og lige før du tilføjer det til cellerne, vortex og fortyndes det med ligationen løsning. Fjern TBST fra dias og tilsæt 40 mikroliter af ligation ligse opløsning til hver brønd. Inkuber dias i et forvarmet fugtighedskammer i 30 minutter ved 37 grader Celsius.Efter inkubationen aspirere opløsningen og vask to gange med TBST i fem minutter ved stuetemperatur ved omrøring. Undgå at udsætte brønden for stærkt lys, da reagenserne er lysfølsomme. Under den sidste vask, vortex og fortynde krav mængder af forstærkningsopløsning i høj renhed vand umiddelbart før brug.Opbevar polymerase på is eller i en køleblok, og lige før du tilføjer den til cellerne vortex og fortyndes med forstærkningsopløsningen. Aspirere TBST fra brøndene og tilsæt 40 mikroliter forstærkningsopløsning til hver brønd. Inkuber dias i et mørkt forvarmet fugtighedskammer i 100 minutter ved 37 grader Celsius.Efter inkubationen aspirere forstærkningspolymeraseopløsningen fra objektglassene og vaskes to gange ti minutter hver i TBST ved stuetemperatur. Fjern kamrene og silikonen rundt om brøndene helt fra rutsjebanen. Skrab de resterende perler af silikone med en barbermaskine.Tegn et gitter på sliden, der adskiller hver brønd. Tilsæt ca. 40 mikroliter af monteringsmediet med DAPI, hvilket sikrer, at ingen luftbobler bliver fanget under dækslet. Brug neglelak til at fastsætte dække glas.Mikroskopisk analyse kan udføres i 20 minutter efter fiksering, men i praksis finder vi det mest bekvemt at udføre billedanalyse den følgende dag. For at analysere prøverne bruger vi et Leica SP8-konfigurationsmikroskop til laserscanning. Vist her er eksempler på in situ nærhed ligation assay visualisere nærhed mellem MST 1 og MST2 proteiner i menneskelige embryonale nyreceller i paneler A til D, og Human Schwann celler i paneler E gennem H.In alle paneler cellekerner er farves blå af DAPI og røde prikker indikerer positiv nærhed ligation assay signaler som følge af nærhed mellem de angivne proteiner.Panel A viser nærhed af MST1 og MST2 og panel B viser nærhed af ERK og fosfor, da disse epitoper er på samme protein. Panel C repræsenterer en negativ kontrol, da disse celler som MST1 og MST2 og Panel D repræsenterer en anden negativ kontrol plettet med antistoffer for MST1 og ERK, som ikke forventes at være i nærheden af hinanden. Paneler E og F viser nærhed af MST1 med MST2 og ERK med fosfork i Schwann celler.Panel G og H er negative kontroller, der kun farves med MST1-antistoffer eller med MST1- og ERK-antistoffer. Det er bydende nødvendigt at bruge ikke cross-reaktive primære antistoffer, at det bør genkende kun ét medlem af heterodimer. Det er også vigtigt at huske at bruge forskellige tips til at undgå krydskontaminering af primære antistoffer og PLA-sonder, for at undgå at røre bunden af brønden og for at undgå pipettering direkte på prøver.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man bruger in situ PLA til at studere protein dimerization i faste celler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillær elektroforese Adskillelse af monoklonalt antistof Isoformer med en neutral kapillær

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering af protein-protein interaktion i nukleare og Cytoplasmiske Brøker af Co-immunopræcipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligeringsassayet

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...