Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Wij danken het hele Chernoff laboratorium voor het bijdragen tot de optimalisatie en validatie van dit protocol, met name Maria Radu en Galina Semenova. Wij danken ook Andrey Efimov van de cel Imaging faciliteit op Fox Chase Cancer Center. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01 CA148805) naar JC.

1. bereiding van de oplossingen
<ol><li>Bereid kleefpoeders oplossing: 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS. Neem voor 10 mL, 2,5 mL van 16% PFA en voeg 7,5 mL 1 x PBS. Risico's: PFA is kankerverwekkend zijn bij lage doseringen. Rook en contact met de huid zijn gevaarlijk. Winkel bij-20 ° C.</li>
	<li>Bereid permeabilization oplossing: 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS. Voeg 100 µL van Triton X-100 in 100 mL 1 x PBS voor 100 mL van de oplossing. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Bereiden was...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

We vonden het nuttig te gebruiken glas kamer dia's voor dit experiment, zoals het is erg handig voor het uitvoeren van experiment met verschillende cellijnen van (14-16) en er is geen behoefte om te veranderen van de steekproef telkens tijdens de microscopie analyse. Een paar complicaties voordoen, zoals een verhoogd risico op kruisbesmetting met antilichamen. Wij stellen daarom voor elke goed wassen individueel in plaats van met behulp van een Coplin pot, ondanks de toegenomen duur van het experiment. Daarnaast zijn de ...

Verstoring van het MST1/Hippo signalering is verbonden met ontwikkelingsstoornissen en carcinogenese1. Bij zoogdieren, activeren de kinases MST1 en MST2 (phosphorylate) MOB1 en LATS1/2, de laatste kinaseenzym en inactiveert de transcriptionele co activator ja-geassocieerde proteïne (YAP)2. In zijn actieve vorm (unphosphorylated) heeft YAP oncogene activiteit, verbetering van de transcriptie van cel proliferatie genen; omgekeerd, wanneer YAP wordt geïnactiveerd door het traject van Hippo, celproliferatie wordt onderdrukt en apoptosis bevorderd3. In de weefsels, MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimers, maar oncogene prikkels kunnen verhogen van MST1/MST2 heterodimers, en dergelijke heterodimers zijn inactief4. Het blijft echter slecht begrepen hoe MST1/MST2 heterodimerization wordt geregeld. Zowel homo- als heterodimers zijn gemedieerde via interacties tussen C-terminal spiraalsnoer-spoel regio's MST1 en MST2, bekend als SARAH domeinen5. Met behulp van een in situ PLA aangetoond in dit artikel tonen we de aanwezigheid van MST1/MST2 heterodimers in menselijke Schwann cellen (HSC) en menselijke embryonale nier cellen (HEK-293). PLA heeft een voordeel ten opzichte van andere proteïne/eiwit interactie detectiemethoden, omdat het mogelijk maakt het opsporen van endogene eiwit-eiwitinteractie, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgenic meningsuiting of het gebruik van epitoop tags 6.
Transductie signaalroutes worden grotendeels bepaald door de voorwaardelijke associatie van component eiwitten. Bijvoorbeeld, leidt stimulatie van de meeste receptor tyrosine kinases tot hun homo - of hetero-dimerisatie en latere vereniging met extra intracellulaire signalering eiwitten, die zelf vorm verder complexen. Het doel van de PLA-methode is om te visualiseren van de afstand tussen de eiwitten in cellen, mits de eiwitten minder dan 30-40 nm uit elkaar zijn. De nabijheid van het eiwit is meestal gedetecteerd door eerste het broeden van de cellen met passende primaire antilichamen groeide op in verschillende soorten (bv., konijn en muis) tegen elke interactie eiwit, vervolgens toe te voegen soortspecifieke secundaire antilichamen, vooraf gekoppelde naar kort DNA-sondes. Als de DNA-sondes in de nabijheid zijn, kunt gelijktijdig een specifieke oligonucleotide voor koppelen DNA binden, zowel van deze sondes, vorming van een platform voor amplificatie door in situ PCR of door het walsen van cirkel mechanisme. Fluorescerende tags toegevoegd aan de amplificatie reactie kun visualisatie van de interacterende eiwitten, die als tl stippen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd en gelokaliseerd op bepaalde regio's in de cel7,8 verschijnen,, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Gereglementeerde eiwit-eiwitinteractie zijn een leidend beginsel voor veel signalering gebeurtenissen, en de opsporing van dergelijke evenementen is een belangrijk element in het begrip van hoe dergelijke trajecten zijn georganiseerd en hoe zij functioneren. Er zijn vele methoden voor de opsporing van eiwit-eiwitinteractie in cellen, maar relatief weinig kunnen worden gebruikt voor het detecteren van interactie tussen endogene eiwitten. Een dergelijke methode, de nabijheid van afbinding assay (PLA), heeft verschillende voordelen aan het gebruik ervan. Vergeleken met andere gemeenschappelijke analysemethoden eiwit-eiwit interactie, PLA heeft relatief hoge gevoeligheid en specificiteit, met minimale cel manipulatie, en, in het protocol hierin beschreven kan worden uitgevoerd, slechts twee doelgroepen gerichte requires antistoffen afkomstig van verschillende soorten (bv., van muis en konijn) en één gespecialiseerde reagens: een aantal secundaire antilichamen die covalent gekoppeld aan specifieke oligonucleotides dat toen bracht in de nabijheid van elkaar, maken een amplifiable platform voor in situ PCR of rollende cirkel versterking. In deze presentatie tonen we hoe toe te passen op de PLA-techniek om wijzigingen in de nabijheid van de MST1 en MST2 in vaste cellen zichtbaar maken. De techniek wordt beschreven in dit manuscript is met name van toepassing voor de analyse van cel signalering van studies.

We gebruikten de PLA-assay voor het testen van de interactie tussen MST1 en MST2 in HEK-293 en iHSC. De cellen waren vaste permeabel en gekleurd met verschillende antilichamen, gevolgd door in situ versterking volgens het PLA-protocol (Figuur 1). Om het document op het niveau van de MST1/MST2 heterodimerization, werden cellen gekleurd met MST1 en MST2 antilichamen (figuur 1Aen 1 C, 1 G). Als positieve co...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

De in situ Proximity Ligation Assay of PLA, is een technologie die in staat is om interacties tussen eiwitten, aangebracht weefsel en cellen te detecteren. De associaties tussen eiwitten kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgene expressie of extra techs. De enige vereiste is de beschikbaarheid van specifieke hoog-efficiënte antilichamen die met DNA oligonucleotiden kunnen worden gewijzigd.In weefsels MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimeren, maar oncogene stimuli kunnen het niveau van MST1 MST2 heterodimeren verhogen en dergelijke heterodimeren zijn inactief. Na incubatie met specifieke primerantilichamen tegen de proteïnen van belang worden speciale specifieke secundaire antilichamen, elk gekoppeld aan een unieke, korte, gratis DNA-streng die eraan verbonden is, toegevoegd aan de sleuf om zich aan de primaire antilichamen te binden. Als de eiwitten in vragen heterodimerized zijn, zullen zowel de primaire antilichamen als de secundaire antilichamen die eraan verbonden zijn in de nabijheid zijn.In deze toestand kunnen de bijgevoegde DNA-strengen op de tweede antilichamen interageren door een volgende toevoeging van twee andere cirkelvormende DNA-oligonucleotiden. Enkele honderdvoudige replicatie van de DNA-cirkel kan optreden na een versterkingsreactie en een fluorescentiesignaal wordt gegenereerd door genivelleerde gratis oligonucleotidesondes. Daarom wordt elk gedetecteerd signaal gevisualiseerd als een individuele fluorescerende stip die kan worden toegewezen aan een specifieke subcellulaire locatie op basis van microscoopbeelden.Op de dag voor het experiment, jas 16 goed kamers dia's door het toevoegen van 50 tot 100 microliter van muis laminine of poly-L-lysine en incubbaat bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten koude oplossing te verwijderen, split de cellen met trypsine en plaat 15, 000 tot 25.000 cellen per goed in 16 goed chambered dia. Incubeercellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%koolstofdioxide incubator gedurende 24 uur.Na 24 uur, verwijder het medium uit de putten en was de cellen voorzichtig met PBS. Gebruik een micropipet om het nemen van risico's van het monster te minimaliseren en vervolgens de PBS aan te trekken en cellen te fixeren door 50 microliter van 4% PFA per put toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie uit te broeden. Pipette de oplossing niet rechtstreeks op de cellen, omdat dat kan leiden tot onthechting van de cellen.Na de fixatie, was de cellen met TBST drie keer gedurende vijf minuten elk met milde agitatie. Volgende permeabiliseren van de cellen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Nadat de permeabilisatie is voltooid, was de cellen met TBST drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met agitatie.Na het verwijderen van TBST voeg een druppel van de blokkering oplossing in elke put en uitbroeden de dia's in een voorverwarmde vochtigheidskamer voor een uur op 37 graden Celsius. Verdun primaire antilichamen. Verwijder de blokkeringsoplossing met behulp van een micropipet, maar laat glijbanen niet drogen.Vortex en voeg 40 microliter van de verdunde antilichaamoplossing toe aan de juiste putten en broed de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een uur in een voorverwarmde vochtigheidskamer. Verdun tijdens de incubatie de twee PLA-sondes in antilichaamverdunningsmiddel. Bereid voor elk monster 40 microliter PLA-sonde voor.Na een uur incubatie, aspiraat de antilichaam oplossing en was glijbanen twee keer gedurende vijf minuten met TBST bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de TBST van de dia's en voeg 40 microliter van de PLA sonde oplossing aan elke put. Broed de glijbanen in een voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Vortex en verdun de vereiste volumes van de ligatievoorraad 1 tot 5 in hoog zuiverheidswater vlak voor gebruik. Voor elke put is 40 microliter van de ligatieoplossing nodig. Na de incubatie, verwijder PLA oplossing van de dia's en was ze twee keer in TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie.Gebruik een vriesblok bij het verwijderen van ligase uit de vriezer en net voor het toevoegen aan de cellen, vortex en verdun het met de ligatie oplossing. Verwijder de TBST uit de dia's en voeg 40 microliters van de ligatie ligase oplossing aan elke put. Incubeer glijdt in een voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Na de incubatie de oplossing aanzuigen en twee keer wassen met TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie. Vermijd het blootstellen van de put aan fel licht als de reagentia zijn lichtgevoelig. Tijdens de laatste wasbeurt, vortex en verdunnen de eis volumes van versterking oplossing in hoge zuiverheid water onmiddellijk voor gebruik.Houd de polymerase op ijs of in een koelblok en net voordat u het toevoegt aan de vortex van de cellen en verdunt u met de versterkingsoplossing. Aspirate de TBST uit de putten en voeg 40 microliters van versterking oplossing aan elke put. Incubeer glijdt in een donkere voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende 100 minuten bij 37 graden Celsius.Na de incubatie, aspiraat de versterking polymerase oplossing van de dia's en was twee keer tien minuten elk in TBST bij kamertemperatuur. Verwijder de kamers en siliconen rond de putten volledig van de glijbaan. Schraap de resterende kralen van siliconen af met een scheermes.Teken een raster op de dia die elke put scheidt. Voeg ongeveer 40 microliters van het montagemedium toe met DAPI, zodat er geen luchtbellen onder de deklip komen te zitten. Gebruik nagellak om het afdekglas te repareren.Microscopische analyse kan worden uitgevoerd in 20 minuten na fixatie, maar in de praktijk vinden we het het meest handig om beeldanalyse uit te voeren de volgende dag. Om de monsters te analyseren, gebruiken we een Leica SP8 configureren laser scanning microscoop. Hier zijn voorbeelden van in situ nabijheid ligatie test visualiseren nabijheid tussen MST 1 en MST2 eiwitten in menselijke embryonale niercellen in panelen A tot en met D, en Human Schwann cellen in panelen E door H.In alle panelen celkernen zijn blauw gekleurd door DAPI en rode stippen geven positieve nabijheid ligatie ligatie assay signalen als gevolg van nabijheid tussen de aangegeven eiwitten.Paneel A toont de nabijheid van MST1 en MST2 en paneel B toont de nabijheid van ERK en fosfoERK als deze epitopen zijn op hetzelfde eiwit. Paneel C vertegenwoordigt een negatieve controle omdat deze cellen zoals MST1 en MST2 en paneel D een tweede negatieve controle met antilichamen voor MST1 en ERK vertegenwoordigen die naar verwachting niet in de nabijheid van elkaar zullen zijn. Panelen E en F tonen de nabijheid van MST1 met MST2 en ERK met fosfoERK in Schwann cellen.Panel G en H zijn negatieve controles die alleen zijn gekleurd met MST1-antilichamen of met MST1- en ERK-antilichamen. Het is absoluut noodzakelijk om niet-reactieve primaire antilichamen te gebruiken dat het slechts één lid van heterodimer zou moeten erkennen. Ook is het belangrijk om te onthouden om verschillende tips te gebruiken om kruisbesmetting van primaire antilichamen en PLA-sondes te voorkomen, om te voorkomen dat de bodem van de put wordt aangeraakt en om te voorkomen dat u rechtstreeks op monsters pipet.Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe te gebruiken in situ PLA om eiwit dimerization studie in vaste cellen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...