Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
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Nous remercions le laboratoire Chernoff ensemble pour contribuer à l’optimisation et la validation du présent protocole, notamment Maria Radu et Galina Semenova. Nous remercions également Andrey Efimov de l’installation d’imagerie cellulaire au Fox Chase Cancer Center. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (R01 CA148805) de JC.

1. préparation des Solutions
<ol><li>Préparer la solution de fixation : 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x. Prendre 10 mL, 2,5 mL de 16 % PFA et ajouter 7,5 mL de PBS 1 x. Risques : PFA est cancérogène aux doses faibles. Fumées et contact avec la peau sont dangereux. Conserver à-20 ° C.</li>
	<li>Préparer la solution de la perméabilisation : 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x. Pour 100 mL de solution, ajouter 100 µL de Triton X-100 dans 100 mL de solution 1 PBS x. Conserver ...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Nous avons trouvé utile d’utiliser des lames de verre chambre pour cette expérience, car il est très pratique réaliser l’expérience avec plusieurs lignées de cellules (14-16) et il n’y a pas besoin de changer l’échantillon chaque fois lors de l’analyse de la microscopie. Quelques complications peuvent survenir, comme une augmentation du risque de contamination croisée avec des anticorps. Par conséquent, nous suggérons de laver chaque cupule individuellement au lieu d’utiliser une coloration, malgré...

Perturbation de la signalisation de MST1/Hippo a été liée à des troubles du développement et de la carcinogenèse1. Chez les mammifères, les kinases MST1 et MST2 activent (phosphoryler) MOB1 et LATS1/2, dont le dernier puis phosphoryle et inactive l’activateur de la transcription co Oui-associated protein (YAP)2. Sous sa forme active (lieu), YAP a activité oncogénique, améliorant la transcription des gènes de la prolifération cellulaire ; à l’inverse, lorsque YAP est inactivée par la voie de l’hippopotame, la prolifération cellulaire est supprimée et l’apoptose promu3. Dans les tissus, MST1 et MST2 existent principalement sous forme d’homodimères active, mais des stimuli oncogènes peuvent augmenter les niveaux de MST1/MST2 hétérodimères et telles hétérodimères sont inactifs4. Cependant, comment hétérodimérisation MST1/MST2 est réglementée reste mal comprise. Les deux homo - et hétérodimères sont médiée par les interactions entre régions coiled-coil C-terminales de MST1 et MST2 dite SARAH domaines5. En utilisant un in situ PLA démontré dans cet article, nous montrons la présence de MST1/MST2 hétérodimères dans les cellules de Schwann humaine (HSC) et rein embryonnaire humain cellules (HEK-293). PLA a un avantage sur les autres méthodes de détection d’interactions protéine/protéine parce qu’il permet la détection des interactions protéine-protéine endogène, qui peuvent être identifiés et quantifiés sans le besoin d’expression du transgène ou l’utilisation d’étiquettes d’épitope 6.
Signalisation des voies de transduction sont en grande partie contrôlés par l’association conditionnelle des protéines composant. Par exemple, stimulation de la plupart tyrosine kinase entraîne leur homo - ou hétéro-dimérisation et association subséquente avec d’autres protéines de signalisation intracellulaires, qui eux-mêmes formant des complexes plus. L’objectif de la méthode PLA est de visualiser un lien étroit entre les protéines dans les cellules, sous réserve que les protéines sont moins de 30-40 nm apart. Proximité de protéine est généralement détectée en premier en incubant les cellules avec des anticorps primaires appropriés chez les différentes espèces (p. ex.., lapin et souris) contre chaque protéine d’interaction, puis en ajoutant des anticorps secondaires propres à chaque espèce, des sondes d’ADN avant couplé à court. Si les sondes ADN sont à proximité, un oligonucléotide spécifique d’ADN liant pouvez lier simultanément deux de ces sondes, formant une plate-forme pour l’amplification par in situ par PCR ou par mécanisme de cercle de roulement. Étiquettes fluorescentes ajoutés à la réaction d’amplification permettent visualisation des protéines qui interagissent, qui apparaissent comme des points fluorescents qui peuvent être facilement quantifiés et localisés à des régions particulières dans la cellule7,,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Interactions de protéine-protéine réglementés sont un principe directeur pour de nombreux événements de signalisation, et la détection de tels événements est un élément important pour comprendre comment ces voies sont organisés et comment ils fonctionnent. Il existe de nombreuses méthodes pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules, mais relativement peu peuvent être utilisés pour détecter des interactions entre protéines endogènes. Une de ces méthodes, le dosage de la ligature de proximité (PLA), présente plusieurs avantages pour recommander son utilisation. Par rapport aux autres méthodes courantes d’analyse des interactions protéine-protéine, PLA a la spécificité et la sensibilité relativement élevée, peut être réalisée avec manipulation cellule minimale et, dans le protocole décrit ci-après, nécessite seulement deux spécifique à la cible anticorps provenant de différentes espèces (p. ex.., de souris et le lapin) et un réactif spécialisé : un ensemble d’anticorps secondaires qui sont des oligonucléotides par covalence liés à certains qui, quand à proximité d’un autre, créer un amplifiable plate-forme pour in situ par PCR ou l’amplification de cercle roulant. Dans cette présentation, nous montrons comment appliquer la technique PLA pour visualiser les changements à proximité de MST1 et MST2 dans les cellules fixes. La technique décrite dans ce manuscrit est particulièrement adaptée pour l’analyse des études de signalisation cellulaire.

Nous avons utilisé le test PLA pour tester l’interaction entre MST1 et MST2 HEK-293 et iHSC. Les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec les anticorps différents, suivies en situ amplification selon le protocole PLA (Figure 1). Afin de documenter le niveau de hétérodimérisation de MST1/MST2, les cellules ont été colorées avec des anticorps MST1 ou MST2 (Figure 1 a, 1C et 1 G</stro...

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Ici, nous montrons comment utiliser un test de ligature de proximité (PLA) pour visualiser MST1/MST2 hétérodimérisation dans les cellules fixes à haute sensibilité.

Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

L’analyse de ligature de proximité in situ ou PLA, est une technologie capable de détecter les interactions entre les protéines, les tissus apposés et les cellules. Les associations entre les protéines peuvent être identifiées et quantifiées sans avoir besoin d’expression transgénique ou de techniciens supplémentaires. La seule exigence est la disponibilité d’anticorps spécifiques à haut rendement qui peuvent être modifiés avec des oligonucléotides d’ADN.Dans les tissus MST1 et MST2 existent principalement en tant qu’homodimers actifs, mais les stimuli oncogènes peuvent augmenter le niveau d’heterodimers MST1 MST2 et ces heterodimers sont inactifs. Après incubation avec des anticorps d’amorce spécifiques contre les protéines d’intérêt, des anticorps secondaires spécifiques spéciaux, chacun lié à un brin d’ADN unique, court et complémentaire qui lui est attaché, sont ajoutés à la fente pour se lier aux anticorps primaires. Si les protéines en question sont heterodimérisées, les anticorps primaires et les anticorps secondaires qui y sont liés seront à proximité.Dans cet état, les brins attachés d’ADN sur les deuxièmes anticorps peuvent interagir par un ajout ultérieur de deux autres oligonucléotides d’ADN de cercle-formation. Plusieurs centaines de réplications du cercle d’ADN peuvent se produire après une réaction d’amplification et un signal de fluorescence est généré par des sondes oligonucléotides complémentaires nivelées. Par conséquent, chaque signal détecté est visualisé comme un point fluorescent individuel qui peut être attribué à un endroit subcellulaire spécifique basé sur des images au microscope.La veille de l’expérience, enduire 16 diapositives bien chambées en ajoutant 50 à 100 microlitres de laminine de souris ou de poly-L-lysine et incuber à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes, enlever la solution froide, diviser les cellules à l’aide de trypsine et plaquer 15 000 à 25 000 cellules par puits en 16 lame bien chambées. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone de 5% pendant 24 heures.Après 24 heures, retirer le milieu des puits et laver délicatement les cellules avec du PBS. Utilisez une micropipette pour minimiser la prise de risque de l’échantillon, puis aspirez le PBS et fixez les cellules en ajoutant 50 microlitres de 4%PFA par puits et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Ne pipette pas la solution directement sur les cellules, car cela peut entraîner un décollement des cellules.Après la fixation, laver les cellules avec TBST trois fois pendant cinq minutes chacune avec une légère agitation. Perméabiliz ensuite les cellules et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Une fois la perméabilisation terminée, lavez les cellules avec tbst trois fois pendant cinq minutes par lavage avec agitation.Après avoir enlevé tbst ajouter une goutte de solution de blocage dans chaque puits et incuber les diapositives dans une chambre d’humidité préchauffée pendant une heure à 37 degrés Celsius. Diluer les anticorps primaires. Retirez la solution de blocage à l’aide d’une micropipette, mais ne laissez pas sécher les glissières.Vortex et ajouter 40 microlitres de la solution d’anticorps dilué aux puits appropriés et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius dans une chambre d’humidité préchauffée pendant une heure. Pendant l’incubation, diluer les deux sondes PLA dans le diluant anticorps. Pour chaque échantillon préparer 40 microlitres de sonde PLA.Après une heure d’incubation, aspirer la solution d’anticorps et laver les toboggans deux fois pendant cinq minutes avec tbst à température ambiante. Retirez doucement le TBST des glissières et ajoutez 40 microlitres de la solution de sonde PLA à chaque puits. Incuber les glissières dans une chambre d’humidité préchauffée pendant une heure à 37 degrés Celsius.Vortex et diluer les volumes requis du stock de ligature 1 à 5 dans de l’eau de haute pureté immédiatement avant l’utilisation. 40 microlitres de la solution de ligature sont nécessaires pour chaque puits. Après l’incubation, retirer la solution PLA des glissières et les laver deux fois dans tbst pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation.Utilisez un bloc de congélation lors de l’élimination des ligases du congélateur et juste avant de l’ajouter aux cellules, vortex et diluer avec la solution de ligature. Retirez le TBST des toboggans et ajoutez 40 microlitres de la solution ligase de ligature à chaque puits. L’incubation glisse dans une chambre d’humidité préchauffée pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Après l’incubation aspirer la solution et laver deux fois avec TBST pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation. Évitez d’exposer le puits à la lumière vive car les reagents sont sensibles à la lumière. Lors du dernier lavage, vortex et diluer les volumes d’exigence de solution d’amplification dans de l’eau de haute pureté immédiatement avant l’utilisation.Gardez la polymése sur la glace ou dans un bloc de refroidissement et juste avant de l’ajouter au vortex des cellules et diluer avec la solution d’amplification. Aspirez le TBST des puits et ajoutez 40 microlitres de solution d’amplification à chaque puits. Incuber glisse dans une chambre d’humidité préchauffée foncée pendant 100 minutes à 37 degrés Celsius.Après l’incubation, aspirer la solution de polymésase d’amplification à partir des glissières et laver deux fois dix minutes chacun dans TBST à température ambiante. Retirez complètement les chambres et le silicone autour des puits de la lame. Racler le reste des perles de silicone avec un rasoir.Dessinez une grille sur la glissière séparant chaque puits. Ajouter environ 40 microlitres du milieu de montage avec DAPI, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit prise sous le bordereau de couverture. Utilisez du vernis à ongles pour fixer le verre de couverture.L’analyse microscopique peut être effectuée en 20 minutes après la fixation, mais dans la pratique, nous trouvons plus pratique d’effectuer l’analyse d’image le lendemain. Pour analyser les échantillons, nous utilisons un microscope à balayage laser leica SP8. Montré ici sont des exemples d’analyse de ligature de proximité in situ visualisant la proximité entre les protéines MST 1 et MST2 dans les cellules rénales embryonnaires humaines dans les panneaux A à D, et les cellules humaines Schwann dans les panneaux E à H.In tous les noyaux cellulaires panneaux sont tachés bleu par DAPI et les points rouges indiquent des signaux de ligature de proximité positive résultant de la proximité entre les protéines indiquées.Le panneau A montre la proximité de MST1 et MST2 et le panneau B montre la proximité d’ERK et de phosphoERK car ces épitopes sont sur la même protéine. Le panneau C représente un contrôle négatif car ces cellules comme MST1 et MST2 et le panneau D représentent un deuxième contrôle négatif taché d’anticorps pour MST1 et ERK qui ne devraient pas être à proximité les uns des autres. Les panneaux E et F montrent la proximité de MST1 avec MST2 et ERK avec phosphoERK dans les cellules de Schwann.Les panneaux G et H ne sont des témoins négatifs tachés qu’avec des anticorps MST1 ou avec des anticorps MST1 et ERK. Il est impératif d’utiliser des anticorps primaires non réactifs qu’il ne devrait reconnaître qu’un seul membre de l’heterodimer. En outre, il est important de se rappeler d’utiliser différents conseils pour éviter la contamination croisée des anticorps primaires et des sondes PLA, pour éviter de toucher le fond du puits, et pour éviter le pipetting directement sur les échantillons.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser pla in situ pour étudier la dimérisation des protéines dans les cellules fixes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

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