Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
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Wir bedanken uns bei der gesamte Chernoff-Labor für Beitrag zur Optimierung und Validierung dieses Protokolls, insbesondere Maria Radu und Galina Semenova. Wir danken auch Andrey Efimov von Cell Imaging Facility am Fox Chase Cancer Center. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem NIH (R01 CA148805) an JC.

1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Fixativ Lösung: 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer. Nehmen Sie für 10 mL, 2,5 mL 16 % PFA und 7,5 mL 1 X PBS. Gefahren: PFA ist in geringen Dosen krebserregend. Dämpfe und Hautkontakt sind gefährlich. Shop bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung: 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer. Fügen Sie für 100 mL der Lösung 100 µL Triton x-100 in 100 mL 1 X PBS hinzu. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Waschp...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Wir fanden es nützlich, Kammer Objektträger für dieses Experiment zu verwenden, wie es sehr praktisch zum Experiment mit mehreren (14-16) Zelllinien durchführen ist und es keine Notwendigkeit gibt, die Probe jedes Mal während der Mikroskopie Analyse ändern. Ein paar Komplikationen auftreten, wie ein erhöhtes Risiko für Cross-Kontamination mit Antikörpern. Daher empfehlen wir waschen jeden gut einzeln anstatt Kanope Coplin, trotz der erhöhten während des Experiments. Darüber hinaus Entfernen von Silikon-Einlag...

Störung der MST1/Hippo-Signal wurde mit Entwicklungsstörungen und Karzinogenese1verbunden. Bei Säugetieren, die Kinasen MST1 und MST2 aktivieren (phosphorylieren) MOB1 und LATS1/2, von denen die letztere dann phosphorylates und inaktiviert die transkriptionelle Coaktivator ja-assoziierten Protein (YAP)2. In seiner aktiven Form (unphosphorylated) hat YAP Onkogenen Aktivität, Verbesserung der Transkription von Genen Zelle Verbreitung; umgekehrt, wenn YAP durch den Hippo-Weg inaktiviert, Zellproliferation wird unterdrückt und Apoptose gefördert3. In Geweben MST1 und MST2 gibt es hauptsächlich als aktive Homodimers aber Onkogenen Reize MST1/MST2 Heterodimere erhöhen können, und solche Heterodimere sind inaktive4. Wie MST1/MST2 Heterodimerization reguliert wird, bleibt jedoch schlecht verstanden. Homo- und Heterodimere sind vermittelte über Interaktionen zwischen C-terminale coiled-Coil Regionen MST1 und MST2 bekannt als SARAH Domänen5. Über ein in Situ nachgewiesen PLA in diesem Artikel zeigen wir die Anwesenheit von MST1/MST2 Heterodimere im menschlichen Schwann-Zellen (HSC) und menschliche embryonale Nieren-Zellen (HEK-293). PLA hat einen Vorteil gegenüber anderen Eiweiß/Protein-Interaktion-Nachweismethoden, weil dadurch die Erkennung von endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen, die identifiziert und quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit des Transgens Ausdrucks oder die Verwendung von Epitop Tags werden können 6.
Transduktion Signalwege sind weitgehend vom bedingte Verband der Komponente Proteine gesteuert. Zum Beispiel führt Stimulation der meisten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ihre Homo oder Hetero-Dimerisierung und anschließende Verbindung mit zusätzlichen intrazellulären Signalproteine, die ihrerseits weitere komplexe Form. Der PLA-Methode soll Nähe zwischen den Proteinen in den Zellen visualisieren unter der Voraussetzung, dass die Proteine weniger als 30-40 nm auseinander. Protein-Nähe in der Regel vom ersten Inkubation der Zellen mit entsprechenden Primärantikörper angehoben in verschiedenen Arten erkannt wird (zB., Hase und Maus) gegen jedes interagierenden Protein, dann Zugabe artspezifische Sekundärantikörper Pre-gekoppelte, kurze DNA-Sonden. Wenn die DNA-Sonden in der Nähe sind, kann eine bestimmte Verknüpfung DNA-Oligonukleotid gleichzeitig sowohl diese Sonden, bilden eine Plattform für die Verstärkung von in Situ PCR oder durch Walzen Kreis Mechanismus binden. Fluoreszierende Tags hinzugefügt, um die Verstärkung Reaktion ermöglichen Visualisierung der interagierenden Proteine, die erscheinen als fluoreszierende Punkte, die leicht zu quantifizieren und lokalisiert auf bestimmte Regionen in der Zelle7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Regulierte Protein-Protein-Interaktionen sind ein leitendes Prinzip für viele Signalisierung Veranstaltungen, und die Erkennung solcher Ereignisse ist ein wichtiges Element für das Verständnis, wie solche Wege organisiert sind und wie sie funktionieren. Es gibt viele Methoden, um Protein-Protein-Interaktionen in den Zellen zu erkennen, aber relativ wenige können verwendet werden, um Interaktionen zwischen endogenen Proteinen zu erkennen. Eine solche Methode, Nähe Ligatur Assay (PLA), hat mehrere Vorteile, seine Verwendung zu empfehlen. Im Vergleich zu anderen gängigen Methoden der Proteinprotein Interaktionsanalyse, PLA hat relativ hohe Sensitivität und Spezifität, mit minimalen Zelle Manipulation und im Protokoll beschriebenen erfolgen kann, erfordert nur zwei gezielt Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten (zB., von Mäusen und Kaninchen) und eine spezielle Reagenzien: eine Reihe von sekundären Antikörper, die kovalent verknüpfte spezifischer Oligonukleotide sind, wenn in unmittelbarer Nähe zueinander gebracht, erstellen ein amplifiable Plattform für in Situ PCR oder rollenden Kreis Verstärkung. In diesem Vortrag zeigen wir, wie die PLA-Technik, um Änderungen in MST1 und MST2 Nähe in festen Zellen visualisieren anwenden. Die Technik in diesem Manuskript beschrieben gilt vor allem für die Analyse der Zelle Studien.

Wir verwendet die PLA-Assay, um die Interaktion zwischen MST1 und MST2 in HEK-293 und Royal zu testen. Die Zellen wurden behoben, permeabilized und befleckt mit verschiedenen Antikörpern, gefolgt von in Situ Verstärkung nach dem PLA-Protokoll (Abbildung 1). Um das Niveau der MST1/MST2 Heterodimerization zu dokumentieren, wurden Zellen mit MST1 und MST2 Antikörper (Abb. 1A, 1 C und 1 G) gebeizt. Als Po...

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Der in situ Proximity Ligation Assay oder PLA ist eine Technologie, die in der Lage ist, Wechselwirkungen zwischen Proteinen, anbefestem Gewebe und Zellen zu erkennen. Die Assoziationen zwischen Proteinen können identifiziert und quantifiziert werden, ohne dass eine transgene Expression oder zusätzliche Technologien erforderlich sind. Die einzige Voraussetzung ist die Verfügbarkeit spezifischer hocheffizienter Antikörper, die mit DNA-Oligonukleotiden modifiziert werden können.In Geweben existieren MST1 und MST2 hauptsächlich als aktive Homodimere, aber onkogene Reize können den MST1-MST2-Heterodimer erhöhen und solche Heterodimere sind inaktiv. Nach der Inkubation mit spezifischen Primer-Antikörpern gegen die Proteine von Interesse werden spezielle spezifische sekundäre Antikörper, die jeweils mit einem einzigartigen, kurzen, kostenlosen DNA-Strang verbunden sind, dem Steckplatz hinzugefügt, um an die primären Antikörper zu binden. Wenn die in Frage stehenden Proteine heterodimerisiert sind, befinden sich sowohl die primären Antikörper als auch die an sie gebundenen sekundären Antikörper in unmittelbarer Nähe.In diesem Zustand können die angehängten DNA-Stränge an den zweiten Antikörpern durch eine nachfolgende Zugabe von zwei anderen kreisbildenden DNA-Oligonukleotiden interagieren. Nach einer Amplifikationsreaktion kann eine mehrfache Replikation des DNA-Kreises erfolgen und ein Fluoreszenzsignal wird durch nivellierte komplementäre Oligonukleotid-Sonden erzeugt. Daher wird jedes erkannte Signal als einzelner Fluoreszenzpunkt visualisiert, der auf Derbfolge von Mikroskopbildern einer bestimmten subzellulären Position zugeordnet werden kann.Am Tag vor dem Experiment 16 gut gekammerte Dias überziehen, indem man 50 bis 100 Mikroliter Mauslaminin oder Poly-L-Lysin hinzufügt und bei 37 Grad Celsius brütet. Nach 30 Minuten kalte Lösung entfernen, teilen Sie die Zellen mit Trypsin und Platte 15, 000 bis 25, 000 Zellen pro Well in 16 gut gekammerte Rutsche. Inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator für 24 Stunden.Nach 24 Stunden das Medium aus den Brunnen entfernen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die Risikoaufnahme der Probe zu minimieren, dann die PBS zu aspirieren und Zellen zu fixieren, indem Sie 50 Mikroliter 4%PFA pro Bohrkörper hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rührung inkubieren. Pipette die Lösung nicht direkt auf die Zellen, da dies zu einer Ablösung der Zellen führen kann.Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung dreimal für jeweils fünf Minuten mit leichter Rührung mit TBST. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rührung. Nachdem die Permeabilisierung abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen mit TBST dreimal für fünf Minuten pro Waschgang mit Rührung.Nach dem Entfernen von TBST fügen Sie einen Tropfen Blockierlösung in jeden Brunnen und inkubieren Sie die Dias in einer vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Verdünnung primärer Antikörper. Entfernen Sie die Blockierlösung mit einer Mikropipette, lassen Sie die Dias jedoch nicht trocknen.Vortex und fügen Sie 40 Mikroliter der verdünnten Antikörperlösung in die entsprechenden Brunnen und inkubieren die Proben bei 37 Grad Celsius in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für eine Stunde. Während der Inkubation die beiden PLA-Sonden in Antikörperdilutant verdünnen. Für jede Probe bereiten 40 Mikroliter PLA-Sonde.Nach einer Stunde Inkubation die Antikörperlösung ansaugen und mit TBST bei Raumtemperatur zweimal für fünf Minuten mit Rutschen waschen. Entfernen Sie den TBST vorsichtig von den Dias und fügen Sie jedem Bohrloch 40 Mikroliter der PLA-Sondenlösung hinzu. Inkubieren Sie die Dias in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.Vortex und verdünnen Sie die erforderlichen Mengen des Ligationsbestandes 1 bis 5 in hochreinem Wasser unmittelbar vor Gebrauch. Für jeden Brunnen werden 40 Mikroliter der Ligationslösung benötigt. Nach der Inkubation die PLA-Lösung von den Dias entfernen und zweimal in TBST fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Rührung waschen.Verwenden Sie einen Gefrierblock, wenn Sie Ligase aus dem Gefrierschrank entfernen und kurz vor dem Hinzufügen zu den Zellen, Wirbel und verdünnen Sie es mit der Ligationslösung. Entfernen Sie den TBST von den Dias und fügen Sie 40 Mikroliter der Ligationligase-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Gleitet in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation die Lösung aspirieren und zweimal mit TBST für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Rührung waschen. Vermeiden Sie es, den Brunnen hellem Licht auszusetzen, da die Reagenzien lichtempfindlich sind. Während der letzten Wäsche, Wirbel und verdünnen Sie die Bedarfsvolumina der Amplifikationslösung in hochreinem Wasser unmittelbar vor Gebrauch.Bewahren Sie die Polymerase auf Eis oder in einem Kühlblock auf und fügen Sie sie kurz vor dem Hinzufügen in den Zellwirbel auf und verdünnen Sie sie mit der Amplifikationslösung. Aspirieren Sie das TBST aus den Brunnen und fügen Sie 40 Mikroliter Verstärkungslösung zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Gleitet in einer dunklen vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für 100 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation die Amplifikationspolymerase-Lösung aus den Dias aspirieren und jeweils zweimal zehn Minuten in TBST bei Raumtemperatur waschen. Entfernen Sie die Kammern und Silikon um die Brunnen von der Rutsche vollständig. Die restlichen Silikonperlen mit einem Rasiermesser abkratzen.Zeichnen Sie ein Raster auf der Folie, das jeden Brunnen trennt. Fügen Sie ca. 40 Mikroliter des Montagemediums mit DAPI hinzu, damit keine Luftblasen unter dem Deckschein gefangen werden. Verwenden Sie Nagellack, um Deckglas zu fixieren.Mikroskopische Analysen können in 20 Minuten nach der Fixierung durchgeführt werden, aber in der Praxis finden wir es am bequemsten, Bildanalysen am nächsten Tag durchzuführen. Zur Analyse der Proben verwenden wir ein Leica SP8-Konfigurationslasermikroskop. Hier sind Beispiele für in situ-Nähe Ligation assay Visualisierung der Nähe zwischen MST 1 und MST2 Proteine in menschlichen embryonalen Nierenzellen in den Paneelen A bis D, und Human Schwann Zellen in Panels E durch H.In alle Panels Zellkerne sind blau durch DAPI gefärbt und rote Punkte zeigen positive Nähe Ligation Assay Signale aus der Nähe zwischen den angegebenen Proteinen.Panel A zeigt die Nähe von MST1 und MST2 und Panel B zeigt die Nähe von ERK und PhosphoERK, da sich diese Epitope auf demselben Protein befinden. Panel C stellt eine negative Kontrolle dar, da diese Zellen wie MST1 und MST2 und Panel D eine zweite negative Kontrolle darstellen, die mit Antikörpern für MST1 und ERK gefärbt ist, von denen nicht erwartet wird, dass sie in der Nähe zueinander liegen. Die Panels E und F zeigen die Nähe von MST1 mit MST2 und ERK mit PhosphoERK in Schwann-Zellen.Panel G und H sind Negativkontrollen, die nur mit MST1-Antikörpern oder mit MST1- und ERK-Antikörpern gebeizt werden. Es ist zwingend erforderlich, nicht-kreuzreaktive primäre Antikörper zu verwenden, dass nur ein Mitglied von Heterodimer erkannt werden sollte. Auch ist es wichtig, verschiedene Tipps zu verwenden, um Kreuzkontamination von primären Antikörpern und PLA-Sonden zu vermeiden, um zu vermeiden, den Boden des Brunnens zu berühren, und um Pipettieren direkt auf Proben zu vermeiden.Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man in situ PLA verwendet, um die Proteindimerisierung in festen Zellen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Forschung

Biochemie

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...