Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
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हम अनुकूलन और इस प्रोटोकॉल के सत्यापन में योगदान के लिए पूरी Chernoff प्रयोगशाला धंयवाद, विशेष रूप से मारिया रडू और Galina Semenova में । हम भी फॉक्स चेस कैंसर सेंटर में सेल इमेजिंग सुविधा के एंड्री Efimov धंयवाद । इस कार्य को NIH (R01 CA148805) से जे. पी. ए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

1. समाधान की तैयारी
<ol><li>1x पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए): निर्धारण समाधान तैयार करें । 10 मिलीलीटर के लिए, 16% पीएफए के २.५ मिलीलीटर ले और 1x पंजाब के ७.५ मिलीलीटर जोड़ें । खतरों: पीएफए कम मात्रा में यलो होता है ?...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

हम इस प्रयोग के लिए ग्लास चैंबर स्लाइड का उपयोग करने के लिए उपयोगी पाया, के रूप में यह बहुत (14-16) सेल लाइनों के साथ प्रयोग करने के लिए सुविधाजनक है और कोई नमूना माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान हर बार बदलने ...

MST1/हिप्पो संकेतन के विघटन विकासात्मक विकारों और कैंसरजनन1से जुड़ा हुआ है । स्तनधारी में, kinases MST1 और MST2 सक्रिय (phosphorylate) MOB1 और LATS1/2, के बाद जो फिर phosphorylates और निष्क्रिय transcriptional सह उत्प्रेरक हां-जुड़े प्रोटीन (याप)2। अपने सक्रिय (unphosphorylated) रूप में, याप oncogenic गतिविधि है, कोशिका प्रसार जीन की प्रतिलेखन बढ़ाने; इसके विपरीत, जब याप हिप्पो मार्ग द्वारा निष्क्रिय है, सेल प्रसार दबा दिया और apoptosis3पदोंनत किया है । ऊतकों में, MST1 और MST2 सक्रिय homodimers के रूप में मुख्य रूप से मौजूद हैं, लेकिन oncogenic उत्तेजनाओं MST1 के स्तर में वृद्धि कर सकते हैं/MST2 heterodimers, और इस तरह के heterodimers निष्क्रिय कर रहे हैं4. हालांकि, कैसे MST1/MST2 heterodimerization विनियमित है खराब समझ में आता है । दोनों होमो-और heterodimers सी के बीच बातचीत के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं-टर्मिनल कुंडलित MST1 और MST2 सारा डोमेन5के रूप में जाना के क्षेत्रों का तार । एक सीटू पीएलए में इस लेख में प्रदर्शन का प्रयोग, हम MST1/MST2 heterodimers की उपस्थिति मानव Schwann कोशिकाओं (HSC) और मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-२९३) में दिखाते हैं । पीएलए अन्य प्रोटीन पर एक फायदा है/प्रोटीन इंटरेक्शन डिटेक्शन तरीके क्योंकि यह अंतर्जात प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, जो transgene अभिव्यक्ति की आवश्यकता के बिना quantified और epitope टैग के उपयोग की पहचान की जा सकती है 6.
संकेत transduction रास्ते काफी हद तक घटक प्रोटीन की सशर्त संघ द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे रिसेप्टर tyrosine kinases की उत्तेजना अपने होमो-या hetero-dimerization और अतिरिक्त intracellular संकेतन प्रोटीन, जो खुद आगे परिसरों के फार्म के साथ बाद में सहयोग करने के लिए सुराग । पीएलए विधि के उद्देश्य से कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच निकटता की कल्पना है, बशर्ते कि प्रोटीन से कम 30-40 एनएम के अलावा कर रहे हैं । प्रोटीन निकटता आमतौर पर उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को अलग प्रजातियों में उठाया द्वारा पता लगाया है (जैसे, खरगोश और माउस) प्रत्येक बातचीत प्रोटीन के खिलाफ है, तो प्रजातियों-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने, पूर्व में लघु डीएनए जांच को मिलकर. यदि डीएनए जांच बंद निकटता में हैं, एक विशिष्ट जोड़ने डीएनए oligonucleotide एक साथ इन जांच के दोनों बांध कर सकते हैं, प्रवर्धन के लिए एक मंच बनाने के द्वारा सीटू पीसीआर में या वृत्त तंत्र रोलिंग द्वारा । फ्लोरोसेंट टैग प्रवर्धन प्रतिक्रिया को जोड़ा गया बातचीत प्रोटीन के दृश्य की अनुमति है, जो फ्लोरोसेंट डॉट्स कि आसानी से quantified जा सकता है और सेल में विशेष क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत के रूप में प्रकट7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

विनियमित प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत कई संकेतन घटनाओं के लिए एक मार्गदर्शक सिद्धांत हैं, और इस तरह की घटनाओं का पता लगाने कैसे इस तरह के रास्ते का आयोजन कर रहे हैं और कैसे वे समारोह को समझने में एक महत्वपूर्ण तत्व है. वहाँ कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन अपेक्षाकृत कुछ अंतर्जात प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसी ही एक विधि, निकटता बंधाव परख (पीएलए), इसके उपयोग की सिफारिश करने के लिए कई फायदे हैं । प्रोटीन के अंय आम तरीकों के मुकाबले प्रोटीन संपर्क विश्लेषण, पीएलए अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है, ंयूनतम सेल हेरफेर के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, और, प्रोटोकॉल में वर्णित यहां, केवल दो लक्ष्य विशेष की आवश्यकता है विभिंन प्रजातियों से व्युत्पंन एंटीबॉडी (जैसे, माउस और खरगोश से) और एक विशेष एजेंट: माध्यमिक एंटीबॉडी कि covalently विशिष्ट oligonucleotides है कि, जब एक दूसरे के करीब निकटता में लाया से जुड़े रहे है का एक सेट, बनाएं सीटू पीसीआर या रोलिंग सर्कल प्रवर्धन में के लिए प्रवर्धित मंच । इस प्रस्तुति में, हम MST1 और MST2 निकटता में तय कोशिकाओं में बदलाव की कल्पना करने के लिए पीएलए तकनीक लागू करने के लिए कैसे दिखाते हैं । इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक सेल सिग्नलिंग अध्ययन के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से लागू है ।

हम पीएलए परख इस्तेमाल के लिए MST1 और HEK में MST2-२९३ और iHSC के बीच बातचीत का परीक्षण । कोशिकाओं तय किया गया, permeabilized, और विभिन्न एंटीबॉडी के साथ दाग, पीएलए प्रोटोकॉल के अनुसार सीटू प्रवर्धन में द्वार?...

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

यहां, हम बताते है कि कैसे एक निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करने के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ तय की कोशिकाओं में MST1/MST2 heterodimerization कल्पना ।

प्रोटीन Isoforms के Heterodimerization का पता लगाने में एक का उपयोग कर सीटू निकटता बंधाव परख

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

सीटू निकटता लिगेशन परख या पीएलए में, प्रोटीन, चिपका ऊतक, और कोशिकाओं के बीच बातचीत का पता लगाने में सक्षम एक तकनीक है । ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति या अतिरिक्त तकनीकों की आवश्यकता के बिना प्रोटीन के बीच संघों की पहचान और मात्रा निर्धारित की जा सकती है। एकमात्र आवश्यकता विशिष्ट उच्च दक्षता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता है जिसे डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ संशोधित किया जा सकता है।ऊतकों में एमएसटी 1 और एमएसटी 2 मुख्य रूप से सक्रिय होमोसिडिमर्स के रूप में मौजूद हैं, लेकिन ओन्कोजेनिक उत्तेजनाएं एमएसटी 1 एमएसटी 2 हेट्रोडिमर्स के स्तर को बढ़ा सकती हैं और ऐसे हेट्रोडिमर निष्क्रिय हैं। ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ विशिष्ट प्राइमर एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद, विशेष विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी, प्रत्येक इससे जुड़े एक अद्वितीय, छोटे, मानार्थ डीएनए स्ट्रैंड से जुड़े, प्राथमिक एंटीबॉडी से बांधने के लिए स्लॉट में जोड़ा जाता है। यदि प्रश्नों में प्रोटीन विषमताहारी हैं, तो प्राथमिक एंटीबॉडी और उनसे बंधे द्वितीयक एंटीबॉडी दोनों निकटता में होंगे।इस राज्य में, दूसरे एंटीबॉडी पर संलग्न डीएनए किस्में दो अन्य सर्कल बनाने वाले डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बाद के अतिरिक्त के माध्यम से बातचीत कर सकती हैं। डीएनए सर्कल की कई सौ गुना प्रतिकृति एक प्रवर्धन प्रतिक्रिया के बाद हो सकती है और एक फ्लोरेसेंस सिग्नल समतल मानार्थ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच द्वारा उत्पन्न होता है। इसलिए, प्रत्येक पता लगाया संकेत एक व्यक्ति फ्लोरोसेंट डॉट जो माइक्रोस्कोप छवियों के आधार पर एक विशिष्ट उपकोशिक स्थान को सौंपा जा सकता है के रूप में कल्पना की है ।प्रयोग से पहले दिन कोट 16 अच्छी तरह से कक्षित स्लाइड माउस लेमिनिन या पॉली-एल-लाइसिन के ५० से १०० माइक्रोलीटर जोड़कर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । 30 मिनट के बाद ठंडे समाधान को हटा दें, ट्रिप्सिन और प्लेट 15, 000 से 25, 000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 16 अच्छी तरह से कक्षित स्लाइड में उपयोग करके कोशिकाओं को विभाजित करें। 24 घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं ।24 घंटे के बाद, कुएं से माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को धीरे-धीरे पीबीएस से धोएं। नमूना के जोखिम लेने को कम करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, फिर पीबीएस को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को अच्छी तरह से 4% पीएफए के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर और आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके कोशिकाओं को ठीक करें। सीधे कोशिकाओं पर समाधान को पिपेट न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं की टुकड़ी हो सकती है।निर्धारण के बाद, कोशिकाओं को हल्के आंदोलन के साथ पांच मिनट के लिए तीन बार टीबीएसटी से धोएं। अगला कोशिकाओं को पार करना और आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। पारमेबिलाइजेशन पूरा होने के बाद, आंदोलन के साथ प्रति धोने पांच मिनट के लिए तीन बार टीबीएसटी के साथ कोशिकाओं को धोएं।टीबीटी को हटाने के बाद प्रत्येक कुएं में अवरुद्ध समाधान की एक बूंद जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए एक पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके ब्लॉकिंग समाधान निकालें लेकिन स्लाइड को सूखने की अनुमति न दें।भंवर और उचित कुओं के लिए पतला एंटीबॉडी समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक घंटे के लिए एक पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, एंटीबॉडी पतला में दो पीएलए जांच को पतला करें । प्रत्येक नमूने के लिए पीएलए जांच के 40 माइक्रोलीटर तैयार करते हैं।इनक्यूबेशन के एक घंटे के बाद, एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और कमरे के तापमान पर टीबीस्ट के साथ पांच मिनट के लिए दो बार स्लाइड धोएं। स्लाइड्स से धीरे-धीरे टीबीसेंट निकालें और प्रत्येक कुएं में पीएलए जांच समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए एक पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में स्लाइड इनक्यूबेट ।भंवर और उपयोग से तुरंत पहले उच्च शुद्धता वाले पानी में लिगेशन स्टॉक 1 से 5 की आवश्यक मात्रा को पतला करें। प्रत्येक कुएं के लिए लिगेशन सॉल्यूशन के 40 माइक्रोलीटर की आवश्यकता होती है। इनक्यूबेशन के बाद, पीएलए समाधान को स्लाइड से हटा दें और उन्हें आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए टीबीस्ट में दो बार धोएं ।फ्रीजर से लिगाज़ को हटाते समय फ्रीजिंग ब्लॉक का उपयोग करें और इसे कोशिकाओं में जोड़ने से ठीक पहले, भंवर और इसे लिगेशन समाधान के साथ पतला करें। स्लाइड्स से टीबीसेंट निकालें और हर कुएं में लिगाशन लिगाज़ सॉल्यूशन के 40 माइक्रोलीटर डालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट स्लाइड।इनक्यूबेशन के बाद समाधान को आकांक्षी और आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए TBST के साथ दो बार धोने । अच्छी तरह से उज्ज्वल प्रकाश को उजागर करने से बचें क्योंकि अभिकर् वेद प्रकाश संवेदनशील होते हैं। पिछले धोने के दौरान, भंवर और उपयोग से पहले तुरंत उच्च शुद्धता पानी में प्रवर्धन समाधान की आवश्यकता की मात्रा को पतला।पॉलीमरेज को बर्फ पर या कूलिंग ब्लॉक में रखें और इसे कोशिकाओं भंवर में जोड़ने से ठीक पहले और प्रवर्धन समाधान के साथ पतला करें। कुओं से टीबीस्ट को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में प्रवर्धन समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० मिनट के लिए एक अंधेरे पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट स्लाइड ।इनक्यूबेशन के बाद, स्लाइड से प्रवर्धन पॉलीमरेज समाधान को एस्पिरेट करें और कमरे के तापमान पर टीबीस्ट में दो बार दस मिनट धोएं। पूरी तरह से स्लाइड से कुओं के आसपास कक्षों और सिलिकॉन निकालें। एक उस्तरा के साथ सिलिकॉन के शेष मोतियों को कुरेदें।प्रत्येक अच्छी तरह से अलग स्लाइड पर एक ग्रिड ड्रा। DAPI के साथ बढ़ते माध्यम के लगभग 40 माइक्रोलीटर जोड़ें, यह सुनिश्चित करना है कि कोई हवा बुलबुले कवर पर्ची के नीचे पकड़ा मिलता है। कवर ग्लास को ठीक करने के लिए नेल पॉलिश का इस्तेमाल करें।सूक्ष्म विश्लेषण निर्धारण के बाद 20 मिनट में किया जा सकता है, लेकिन व्यवहार में हमें अगले दिन छवि विश्लेषण करना सबसे सुविधाजनक लगता है। नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, हम एक Leica SP8 कॉन्फ़िगर लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यहां दिखाए गए उदाहरण हैं सीटू निकटता लिगेशन परख में पैनल ए थ्रू डी में मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में एमएसटी 1 और एमएसटी 2 प्रोटीन के बीच निकटता की कल्पना करते हैं, और पैनलों ई में मानव श्वान कोशिकाओं को H.In के माध्यम से सभी पैनलों सेल नाभिक DAPI द्वारा नीले रंग के होते हैं और लाल डॉट्स संकेतित प्रोटीन के बीच निकटता के परिणामस्वरूप सकारात्मक निकटता लिगेशन संकेतों को इंगित करते हैं।पैनल ए MST1 और MST2 की निकटता दिखाता है और पैनल बी ईआरके और फॉस्फोएर्क की निकटता दिखाता है क्योंकि ये एपिटोप एक ही प्रोटीन पर हैं। पैनल सी एक नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि एमएसटी 1 और एमएसटी 2 और पैनल डी जैसी ये कोशिकाएं एमएसटी 1 और ईआरके के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग हुए दूसरे नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करती हैं जो एक-दूसरे के निकटता में होने की उम्मीद नहीं है। पैनल ई और एफ श्वान कोशिकाओं में फॉस्फोर्क के साथ MST2 और ईआरके के साथ MST1 की निकटता दिखाते हैं।पैनल जी और एच केवल एमएसटी 1 एंटीबॉडी के साथ या एमएसटी 1 और ईआरके एंटीबॉडी के साथ नकारात्मक नियंत्रण हैं। नॉन क्रॉस-रिएक्टिव प्राइमरी एंटीबॉडी का इस्तेमाल करना जरूरी है कि इसे हेटरोडिमर के केवल एक सदस्य को पहचानना चाहिए । इसके अलावा यह प्राथमिक एंटीबॉडी और पीएलए जांच के पार संदूषण से बचने के लिए विभिन्न सुझावों का उपयोग करने के लिए याद करने के लिए महत्वपूर्ण है, अच्छी तरह से नीचे छूने से बचने के लिए, और नमूनों पर सीधे pipetting से बचने के लिए ।इस वीडियो को देखने के बाद आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि सिटू पीएलए में कैसे इस्तेमाल करें ताकि फिक्स्ड सेल्स में प्रोटीन डाइमराइजेशन का अध्ययन किया जा सके ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

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Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

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निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

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Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन का मूल्यांकन

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...