Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
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Ringraziamo l'intero laboratorio Chernoff per contribuire alla ottimizzazione e convalida del presente protocollo, in particolare Maria Radu e Galina Semenova. Ringraziamo anche Andrey Efimov della struttura cellulare Imaging presso il Fox Chase Cancer Center. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (R01 CA148805) a JC.

1. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare soluzione fissante: paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1X. Per 10ml, prendere 2,5 mL di 16% PFA e aggiungere 7,5 mL di PBS 1X. Pericoli: PFA è cancerogeno a basse dosi. Fumi e contatto con la pelle sono pericolosi. Conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare la soluzione di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS 1X. Per 100 mL di soluzione, aggiungere 100 µ l di Triton X-100 in 100 mL di 1X PBS. Conservare a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Abbiamo trovato utile utilizzare vetrini camera per questo esperimento, come è molto conveniente eseguire l'esperimento con diverse linee di cellule (14-16) e non c'è nessuna necessità di cambiare il campione ogni volta durante l'analisi in microscopia. Alcune complicazioni possono sorgere, ad esempio un aumentato rischio di contaminazione incrociata con gli anticorpi. Pertanto, consigliamo di lavare ogni pozzetto singolarmente anziché utilizzare una vaschetta di Coplin, nonostante l'aumento della durata dell'esperim...

Rottura di MST1/Hippo segnalazione è stata collegata a disturbi dello sviluppo e carcinogenesi1. Nei mammiferi, attivano le chinasi MST1 e MST2 (fosforilare) MOB1 e LATS1/2, il secondo dei quali poi fosforila ed inattiva co-l'attivatore trascrizionale Yes-associated protein (YAP)2. Nella sua forma attiva (unphosphorylated), YAP ha attività oncogena, migliorando la trascrizione dei geni di proliferazione delle cellule; al contrario, quando YAP è inattivato dalla via del Hippo, è soppressa la proliferazione cellulare e apoptosi promosso3. Nei tessuti, MST1 e MST2 esiste principalmente come attivo omodimeri, ma stimoli oncogeni possono aumentare i livelli di MST1/MST2 eterodimeri, e tali eterodimeri sono inattivo4. Tuttavia, com'è regolata la MST1/MST2 eterodimerizzazione rimane capita male. Omo - ed eterodimeri sono mediati tramite interazioni tra regioni arrotolato-arrotola C-terminale di MST1 e MST2 conosciuta come SARAH domini5. Utilizzando un in situ PLA ha dimostrato in questo articolo, ci mostrano la presenza di MST1/MST2 eterodimeri in cellule di Schwann umane (HSC) e rene embrionale umano cellule (HEK-293). PLA ha un vantaggio rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazione proteina/proteina perché permette la rilevazione delle interazioni proteina-proteina endogena, che possono essere individuati e quantificati senza la necessità di espressione del transgene o l'uso di epitopo 6.
Vie di trasduzione del segnale sono in gran parte controllate dall'associazione condizionale delle proteine di componente. Per esempio, stimolazione della maggior parte dei recettori tirosina chinasi conduce alla loro omo - o etero-dimerizzazione e la successiva associazione con altre proteine di segnalazione intracellulare, che a loro volta formare ulteriori complessi. Lo scopo del metodo PLA è visualizzare la vicinanza tra le proteine nelle cellule, purché le proteine sono meno di 30-40 nm apart. Prossimità di proteina è rilevata solitamente incubando le cellule con gli anticorpi primari appropriati generati in specie diverse (ad es., coniglio e il mouse) contro ogni proteina d'interazione, quindi aggiungendo specie-specifici anticorpi secondari, sonde di DNA pre-accoppiato a breve. Se le sonde del DNA sono nelle immediate vicinanze, un oligonucleotide specifico collegamento DNA possibile associare contemporaneamente sia di queste sonde, formando una piattaforma per l'amplificazione in situ PCR o dal meccanismo del cerchio di rotolamento. Fluorescente tag aggiunti per la reazione di amplificazione permettono la visualizzazione delle proteine interagenti, che appaiono come puntini fluorescenti che possono essere facilmente quantificate e localizzate alle regioni particolari nella cella7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Interazioni proteina-proteina regolamentati sono un principio guida per molti eventi di segnale, e l'individuazione di tali eventi è un elemento importante nella comprensione di come tali percorsi sono organizzati e come funzionano. Ci sono molti metodi per rilevare le interazioni proteina-proteina in cellule, ma relativamente pochi può essere utilizzati per rilevare le interazioni tra proteine endogene. Uno di questi metodi, il dosaggio di legatura di prossimità (PLA), ha diversi vantaggi per raccomandare l'uso. Rispetto ad altri comuni metodi di analisi di interazione proteina-proteina, PLA ha relativamente alta sensibilità e specificità, possa essere eseguita con la manipolazione di cellule minimal e, nel protocollo descritto nel presente documento, richiede solo due target-specifici anticorpi derivati da specie diverse (ad es., da topo e coniglio) e un reagente specializzato: un set di anticorpi secondari che sono oligonucleotidi covalentemente legati a specifiche che, quando ha portato in prossimità di un altro, creare un amplificabile piattaforma per in situ PCR o rotolamento dell'amplificazione del cerchio. In questa presentazione, mostreremo come applicare la tecnica PLA per visualizzare le modifiche in prossimità di MST1 e MST2 nelle celle fisse. La tecnica descritta in questo manoscritto è particolarmente applicabile per l'analisi di studi di segnalazione delle cellule.

Abbiamo usato l'analisi PLA per testare l'interazione tra MST1 e MST2 in HEK-293 e integrazione socio-sanitaria. Le cellule erano fissi, permeabilizzate e macchiate con vari anticorpi, seguiti dall'amplificazione in situ secondo il protocollo PLA (Figura 1). Per documentare il livello di MST1/MST2 eterodimerizzazione, le cellule sono state macchiate con gli anticorpi MST1 e MST2 (Figura 1A, 1C e 1 G). Co...

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.

Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Il Proximity Ligation Assay o PLA in situ è una tecnologia in grado di rilevare interazioni tra proteine, tessuto apposto e cellule. Le associazioni tra proteine possono essere identificate e quantificate senza la necessità di espressione transgenica o tecnologie aggiuntive. L'unico requisito è la disponibilità di anticorpi specifici ad alta efficienza che possono essere modificati con oligonucleotidi del DNA.Nei tessuti MST1 e MST2 esistono principalmente come omodimeri attivi, ma gli stimoli oncogenici possono aumentare il livello di eterodimeri MST1 MST2 e tali eterodimeri sono inattivi. Dopo l'incubazione con anticorpi primer specifici contro le proteine di interesse, vengono aggiunti allo slot speciali anticorpi secondari specifici, ognuno collegato a un filamento di DNA unico, corto e gratuito ad esso collegato, per legarsi agli anticorpi primari. Se le proteine in questione sono eterodimerizzate, sia gli anticorpi primari che gli anticorpi secondari ad essi legati saranno nelle immediate vicinanze.In questo stato, i filamenti di DNA attaccati sul secondo anticorpo possono interagire attraverso una successiva aggiunta di altri due oligonucleotidi del DNA che formano cerchi. Diverse centinaia di volte la replicazione del cerchio del DNA può verificarsi dopo una reazione di amplificazione e un segnale di fluorescenza è generato da sonde oligonucleotidi gratuite livellate. Pertanto, ogni segnale rilevato viene visualizzato come un singolo punto fluorescente che può essere assegnato a una specifica posizione subcellulare basata su immagini al microscopio.Il giorno prima dell'esperimento, rivestire 16 diapositive ben camerate aggiungendo da 50 a 100 microlitri di laminina di topo o poli-L-lisina e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti rimuovere la soluzione fredda, dividere le celle utilizzando tripina e piastra da 15.000 a 25.000 celle per pozzo in 16 vetri ben camerati. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato del 5% di anidride carbonica per 24 ore.Dopo 24 ore, rimuovere il mezzo dai pozzi e lavare delicatamente le cellule con PBS. Utilizzare una micropipetta per ridurre al minimo l'assunzione di rischi del campione, quindi aspirare il PBS e fissare le cellule aggiungendo 50 microlitri di 4%PFA per pozzo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Non pipettare la soluzione direttamente sulle cellule, in quanto ciò potrebbe causare il distacco delle cellule.Dopo la fissazione, lavare le cellule con TBST tre volte per cinque minuti ciascuna con lieve agitazione. Successivamente permeabilizzare le cellule e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Al termine della permeabilizzazione, lavare le cellule con TBST tre volte per cinque minuti per lavaggio con agitazione.Dopo aver rimosso TBST aggiungere una goccia di soluzione di blocco in ogni pozzo e incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per un'ora a 37 gradi Celsius. Diluire gli anticorpi primari. Rimuovere la soluzione di blocco utilizzando una micropipetta ma non lasciare asciugare i vetrini.Vortice e aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale diluita ai pozzi appropriati e incubare i campioni a 37 gradi Celsius in una camera di umidità preriscaldata per un'ora. Durante l'incubazione, diluire le due sonde PLA in diluinte anticorpale. Per ogni campione preparare 40 microlitri di sonda PLA.Dopo un'ora di incubazione, aspirare la soluzione anticorpale e lavare gli scivoli due volte per cinque minuti con TBST a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il TBST dalle diapositive e aggiungere 40 microlitri della soluzione di sonda PLA ad ogni pozzo. Incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per un'ora a 37 gradi Celsius.Vortice e diluire i volumi richiesti del materiale di legatura da 1 a 5 in acqua ad alta purezza immediatamente prima dell'uso. Per ogni pozzo sono necessari 40 microlitri della soluzione di legatura. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione PLA dagli scivoli e lavarli due volte in TBST per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione.Utilizzare un blocco di congelamento quando si rimuove la ligasi dal congelatore e poco prima di aggiungerla alle cellule, al vortice e diluirla con la soluzione di legatura. Rimuovere il TBST dalle diapositive e aggiungere 40 microlitri della soluzione di legatura ligasi ad ogni pozzo. Incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione aspirare la soluzione e lavare due volte con TBST per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione. Evitare di esporre il pozzo alla luce intensa in quanto i reagenti sono sensibili alla luce. Durante l'ultimo lavaggio, vortice e diluire i volumi di fabbisogno della soluzione di amplificazione in acqua ad alta purezza immediatamente prima dell'uso.Mantenere la polimerasi sul ghiaccio o in un blocco di raffreddamento e poco prima di aggiungerla al vortice delle cellule e diluire con la soluzione di amplificazione. Aspirare il TBST dai pozzi e aggiungere 40 microlitri di soluzione di amplificazione ad ogni pozzo. Incubare gli scivoli in una camera di umidità preriscaldata scura per 100 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di amplificazione della polimerasi dagli scivoli e lavare due volte dieci minuti ciascuno in TBST a temperatura ambiente. Rimuovere completamente le camere e il silicone intorno ai pozzi dalla diapositiva. Raschiare le perline rimanenti di silicone con un rasoio.Disegnare una griglia sulla diapositiva che separa ogni pozzo. Aggiungere circa 40 microlitri del supporto di montaggio con DAPI, assicurando che nessuna bolla d'aria sia catturata sotto lo scivolo di copertura. Utilizzare lo smalto per fissare il vetro di copertura.L'analisi microscopica può essere eseguita in 20 minuti dopo la fissazione, ma in pratica troviamo più conveniente eseguire l'analisi delle immagini il giorno seguente. Per analizzare i campioni, utilizziamo un microscopio a scansione laser Leica SP8. Di seguito sono riportati esempi di saggi di litigazione di prossimità in situ che visualizzano la vicinanza tra le proteine MST 1 e MST2 nelle cellule renali embrionali umane nei pannelli da A a D e le cellule di Schwann umano nei pannelli da E a H.In tutti i nuclei cellulari dei pannelli sono macchiati di blu da DAPI e i punti rossi indicano segnali di dosaggio di ligation di prossimità positivi derivanti da una stretta vicinanza tra le proteine indicate.Il pannello A mostra la vicinanza di MST1 e MST2 e il pannello B mostra la vicinanza di ERK e fosfoERK in quanto questi epitopi si trovano sulla stessa proteina. Il pannello C rappresenta un controllo negativo in quanto queste cellule come MST1 e MST2 e Pannello D rappresentano un secondo controllo negativo macchiato di anticorpi per MST1 ed ERK che non dovrebbero essere in prossimità l'uno dell'altro. I pannelli E e F mostrano la vicinanza di MST1 con MST2 ed ERK con fosfoERK nelle celle Schwann.I pannelli G e H sono controlli negativi macchiati solo con anticorpi MST1 o con anticorpi MST1 ed ERK. È imperativo usare anticorpi primari non reattivi incrociati che dovrebbe riconoscere solo un membro dell'eterodimero. Inoltre è importante ricordare di utilizzare diverse punte per evitare la contaminazione incrociata di anticorpi primari e sonde PLA, per evitare di toccare il fondo del pozzo ed evitare di pipettare direttamente sui campioni.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come usare il PLA in situ per studiare la dimerizzazione delle proteine nelle cellule fisse.

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