Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
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Agradecemos todo laboratório Chernoff para contribuir para a otimização e validação do presente protocolo, em particular Maria Radu e Galina Semenova. Agradecemos também Andrey Efimov da célula Imaging facilidade no Fox Chase Cancer Center. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 CA148805) para JC.

1. preparação de soluções
<ol><li>Preparar a solução fixador: paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x. Para 10 mL, 2,5 mL de 16% de tomar PFA e adicione 7,5 mL de 1X PBS. Riscos: PFA é cancerígeno em doses baixas. Fumos e contacto com a pele são perigosos. Loja a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar a solução de permeabilização: 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Para 100 mL de solução, adicione 100 µ l de Triton X-100 em 100 mL de 1X PBS. Armazenar em temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparar o ta...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Achamos útil usar lâminas de câmara para esta experiência, como é muito conveniente realizar o experimento com várias linhas de célula (14-16) e não há nenhuma necessidade de mudar a amostra de cada vez durante a análise de microscopia. Algumas complicações podem surgir, tais como um aumento do risco de contaminação cruzada com os anticorpos. Portanto, sugerimos lavar cada poço individualmente em vez de usar uma jarra de Coplin, apesar da maior duração do experimento. Além disso, a remoção da inserç?...

Interrupção de sinalização MST1/Hippo tenha sido conectada para transtornos globais do desenvolvimento e carcinogênese1. Nos mamíferos, ativam as quinases MST1 e MST2 (fosforilar) MOB1 e LATS1/2, o último dos quais depois fosforila e inactivates ativador transcricional co Sim-associado a proteínas (YAP)2. Na sua forma ativa (unphosphorylated), YAP tem atividade oncogênica, realçando a transcrição de genes de proliferação celular; Inversamente, quando YAP é inativado por via de hipopótamo, é suprimida a proliferação celular e apoptose promovida3. Em tecidos, MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativo, mas estímulos oncogênicos podem aumentar os níveis de MST1/MST2 heterodímeros, e tais heterodímeros são inativos4. No entanto, como heterodimerization MST1/MST2 é regulada continua a ser mal compreendido. Homo - e heterodímeros são mediadas através de interações entre regiões de bobina coiled do C-terminal do MST1 e MST2 conhecida como SARAH domínios5. Usando um em situ PLA demonstrado neste artigo, vamos mostrar a presença de MST1/MST2 heterodímeros nas células células de Schwann humanas (HSC) e rim embrionário humano (HEK-293). PLA tem uma vantagem sobre outros métodos de deteção de interação da proteína/proteína porque permite a detecção de interações proteína-proteína endógena, que pode ser identificado e quantificado sem a necessidade de expressão do transgene ou o uso do Tag do Resumo 6.
Sinalização de vias de transdução em grande parte são controladas pela Associação condicional de proteínas de componente. Por exemplo, estimulação da quinase de tirosina do receptor a maioria leva a sua homo ou hetero-dimerização e subsequente associação com proteínas de sinalização intracelulares adicionais, que eles mesmos formar mais complexos. O objetivo do método PLA é Visualizar a proximidade entre as proteínas nas células, desde que as proteínas são menos de 30-40 nm separados. Proximidade de proteína é geralmente detectada pelo primeiro incubar as células com anticorpos primários adequados levantados em diferentes espécies (EG., coelho e rato) contra cada proteína de interação, então a adição de anticorpos secundários espécie-específicos, sondas de DNA previamente acoplado à curta. Se as sondas de DNA estão nas proximidades, um oligonucleotide vinculação específica do DNA pode vincular simultaneamente tanto destas sondas, formando uma plataforma para a amplificação por em situ PCR ou por mecanismo de círculo de rolamento. Etiquetas fluorescentes adicionadas para a reação de amplificação permitem a visualização das proteínas de interação, que aparecem como pontos fluorescentes que podem ser facilmente quantificados e localizados em regiões específicas na célula7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Interações da proteína-proteína regulamentados são um princípio orientador para muitos eventos de sinalização, e a detecção de tais eventos é um elemento importante na compreensão de como tais caminhos são organizados e como eles funcionam. Existem muitos métodos para detectar interações da proteína-proteína nas células, mas relativamente poucos podem ser usados para detectar interações entre proteínas endógenas. Um tal método, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA), tem várias vantagens para recomendar seu uso. Em comparação com outros métodos comuns de análise de interação da proteína-proteína, PLA tem relativamente elevada sensibilidade e especificidade, pode ser realizada com manipulação mínima da célula e, no protocolo descrito neste documento, requer apenas dois alvos anticorpos derivados de espécies diferentes (por exemplo., rato e coelho) e um reagente especializado: um conjunto de anticorpos secundários que estão covalentemente ligadas ao específico oligonucleotides que, quando trouxe em estreita proximidade um do outro, criar um ampliáveis plataforma para em situ PCR ou amplificação de círculo rolante. Nesta apresentação, mostramos como aplicar a técnica PLA para visualizar alterações na proximidade MST1 e MST2 em células fixas. A técnica descrita neste manuscrito é particularmente aplicável para a análise de estudos de sinalização celular.

Usamos o ensaio PLA para testar a interação entre MST1 e MST2 em HEK-293 e iHSC. As células foram fixadas, permeabilizadas e manchadas com vários anticorpos, seguidos de amplificação em situ de acordo com o protocolo PLA (Figura 1). Para documentar o nível de heterodimerization MST1/MST2, células estavam manchadas com anticorpos MST1 e MST2 (figura 1Ae 1C, 1G). Como um controle positivo, também ...

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

O in situ Proximity Ligation Assay ou PLA, é uma tecnologia capaz de detectar interações entre proteínas, tecido afixado e células. As associações entre proteínas podem ser identificadas e quantificadas sem a necessidade de expressão transgênica ou tecnologias adicionais. O único requisito é a disponibilidade de anticorpos específicos de alta eficiência que podem ser modificados com oligonucleotídeos de DNA.Nos tecidos MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativos, mas estímulos oncogênicos podem aumentar o nível de heterídmeros MST1 MST2 e tais heterodimers estão inativos. Após a incubação com anticorpos específicos de primer contra as proteínas de interesse, anticorpos secundários específicos especiais, cada um ligado a uma única, curta e complementar cadeia de DNA anexada a ele, são adicionados ao slot para se ligar aos anticorpos primários. Se as proteínas em questão forem heterodimerizadas, tanto os anticorpos primários quanto os anticorpos secundários ligados a eles estarão próximos.Neste estado, os fios de DNA anexados no segundo anticorpos podem interagir através de uma adição subsequente de dois outros oligonucleotídeos de DNA formadores de círculos. Várias centenas de duplicações do círculo de DNA podem ocorrer após uma reação de amplificação e um sinal de fluorescência é gerado por sondas de oligonucleotídeos de cortesia niveladas. Portanto, cada sinal detectado é visualizado como um ponto fluorescente individual que pode ser atribuído a um local subcelular específico com base em imagens de microscópio.No dia anterior ao experimento, cubra 16 slides bem-câmaras adicionando 50 a 100 microliters de laminina de rato ou poli-L-lysina e incubar a 37 graus Celsius. Após 30 minutos remova a solução fria, divida as células usando Trypsin e placa 15.000 a 25.000 células por poço em 16 slides bem-câmara. Incubar células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Após 24 horas, retire o meio dos poços e lave suavemente as células com PBS. Use uma micropipette para minimizar a tomada de risco da amostra e, em seguida, aspire o PBS e fixar células adicionando 50 microliters de 4%PFA por poço e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Não encodou a solução diretamente nas células, pois isso pode resultar em descolamento das células.Após a fixação, lave as células com TBST três vezes por cinco minutos cada uma com leve agitação. Em seguida, permeabiliar as células e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Após a conclusão da permeabilização, lave as células com TBST três vezes por cinco minutos por lavagem com agitação.Depois de remover o TBST adicione uma gota de solução de bloqueio em cada poço e incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora a 37 graus Celsius. Diluir anticorpos primários. Remova a solução de bloqueio usando uma micropipette, mas não permita que slides sequem.Vórtice e adicione 40 microlitadores da solução de anticorpos diluídos aos poços apropriados e incubar as amostras a 37 graus Celsius em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora. Durante a incubação, diluir as duas sondas PLA em diluição de anticorpos. Para cada amostra prepare 40 microliters da sonda PLA.Após uma hora de incubação, aspire a solução de anticorpos e lave duas vezes por cinco minutos com TBST em temperatura ambiente. Remova suavemente o TBST dos slides e adicione 40 microliters da solução da sonda PLA a cada poço. Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora a 37 graus Celsius.Vórtice e diluir os volumes necessários do estoque de ligadura 1 a 5 em água de alta pureza imediatamente antes do uso. 40 microliters da solução de ligadura são necessários para cada poço. Após a incubação, remova a solução PLA dos slides e lave-as duas vezes em TBST por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação.Use um bloco de congelamento ao remover o ligase do congelador e pouco antes de adicioná-lo às células, vórtice e diluí-lo com a solução de ligadura. Remova o TBST dos slides e adicione 40 microliters da solução ligase de ligadura a cada poço. Incubar lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecido por 30 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação aspire a solução e lave duas vezes com TBST por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação. Evite expor o poço à luz brilhante, pois os reagentes são sensíveis à luz. Durante a última lavagem, o vórtice e diluir os volumes necessários da solução de amplificação em água de alta pureza imediatamente antes do uso.Mantenha a polimerase no gelo ou em um bloco de resfriamento e pouco antes de adicioná-la ao vórtice das células e diluir com a solução de amplificação. Aspire o TBST dos poços e adicione 40 microliters de solução de amplificação a cada poço. Incubar lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecido escuro por 100 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação, aspire a solução de polimerase de amplificação a partir dos slides e lave duas vezes dez minutos cada em TBST à temperatura ambiente. Remova as câmaras e o silicone ao redor dos poços do escorregador completamente. Raspe as contas restantes de silicone com uma navalha.Desenhe uma grade no slide separando cada poço. Adicione aproximadamente 40 microliters do meio de montagem com DAPI, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa sob o deslizamento da tampa. Use esmalte para fixar vidro de cobertura.A análise microscópica pode ser realizada em 20 minutos após a fixação, mas na prática achamos mais conveniente realizar a análise de imagem no dia seguinte. Para analisar as amostras, usamos um microscópio de varredura a laser Leica SP8. Aqui são mostrados exemplos de ensaio de ligadura de proximidade in situ visualizando proximidade entre proteínas MST 1 e MST2 em células renais embrionárias humanas em painéis de A a D, e células de Schwann humanos nos painéis E através de H.In todos os núcleos celulares de painéis são manchados de azul por DAPI e pontos vermelhos indicam sinais positivos de proximidade de ligas de proximidade resultantes da proximidade entre as proteínas indicadas.O painel A mostra proximidade de MST1 e MST2 e painel B mostra proximidade de ERK e fosfoERK, pois esses epítopos estão na mesma proteína. O painel C representa um controle negativo, pois essas células como MST1 e MST2 e Painel D representam um segundo controle negativo manchado com anticorpos para MST1 e ERK que não se espera estar próximos um do outro. Os painéis E e F mostram proximidade de MST1 com MST2 e ERK com fosfoERK em células Schwann.Painel G e H são controles negativos manchados apenas com anticorpos MST1 ou com anticorpos MST1 e ERK. É imperativo usar anticorpos primários não reativos que devem reconhecer apenas um membro do heterodimer. Também é importante lembrar de usar diferentes pontas para evitar a contaminação cruzada de anticorpos primários e sondas PLA, para evitar tocar na parte inferior do poço, e evitar a tubulação diretamente em amostras.Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como usar in situ PLA para estudar dimerização de proteínas em células fixas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Electroforese Capilar Separação de Anticorpo Monoclonal isoformas utilizando um capilar de ponto morto

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Bioquímica

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...