Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Agradecemos al laboratorio de Chernoff todo para contribuir a la optimización y validación de este protocolo, en particular María Radu y Galina Semenova. También agradecemos a Andrey Efimov de la instalación de la proyección de imagen de celular en el Fox Chase Cancer Center. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (R01 CA148805) a JC.

1. preparación de soluciones
<ol><li>Preparar solución de fijación: 4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x. Para 10 mL, tomar 2.5 mL de 16% PFA y agregar 7,5 mL de PBS 1 x. Peligros: PFA es carcinogénico a dosis bajas. Los vapores y el contacto con la piel son peligrosos. Almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar solución de permeabilización: 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x. Para 100 mL de solución, añada 100 μl de Tritón X-100 en 100 mL de 1 x PBS. Almacenar a temperatura ambiente (RT).</li>
	<...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Nos pareció útil portaobjetos de la cámara para este experimento, ya que es muy conveniente realizar el experimento con varias líneas de celulares (14-16) y no hay necesidad de cambiar la muestra cada vez que durante el análisis de microscopía. Pueden surgir algunas complicaciones, tales como un mayor riesgo de contaminación cruzada con los anticuerpos. Por lo tanto, sugerimos lavar cada pozo individual en lugar de utilizar un frasco de Coplin, a pesar de la mayor duración del experimento. Además, la remoción d...

Interrupción de señalización MST1/Hippo ha estado ligada a trastornos del desarrollo y carcinogénesis1. En mamíferos, se activan las quinasas MST1 y MST2 (fosforilan) MOB1 y LATS1/2, el último de los cuales luego fosforila y hace inactivo el coactivador transcripcional de la proteína asociada a Yes (YAP)2. En su forma activa (unphosphorylated), YAP tiene actividad oncogénica, mejorar la transcripción de genes de proliferación celular; por el contrario, cuando YAP es inactivado por la vía de Hippo, se suprime la proliferación celular y apoptosis promovido3. En los tejidos, MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activo, pero estímulos oncogénicos pueden aumentar los niveles de heterodímeros MST1/MST2 y son de estos heterodímeros inactivos4. Sin embargo, cómo está regulada la MST1/MST2 heterodimerization sigue siendo mal entendida. Homo - y heterodímeros están mediada a través de interacciones entre regiones de en espiral-arrolle c-terminal de MST1 y MST2, conocida como SARAH dominios5. Usando una en situ PLA demostrado en este artículo, nos muestran la presencia de heterodímeros MST1/MST2 en las células de las células de Schwann humana (HSC) y riñón embrionario humano (HEK-293). PLA tiene una ventaja sobre otros métodos de detección de interacción proteína/proteína, ya que permite la detección de interacciones proteína-proteína endógena, que puede ser identificado y cuantificado sin la necesidad de expresión del transgen o el uso de etiquetas del epítopo 6.
Vías de transducción de señalización son controladas en gran parte por la Asociación condicional de proteínas componentes. Por ejemplo, la estimulación de la mayoría del receptor tirosina quinasas conduce a su homo o hetero-dimerización y posterior asociación con proteínas de señalización intracelulares adicionales, que a su vez formar más complejos. El propósito del método PLA es visualizar la proximidad entre las proteínas en las células, siempre que las proteínas son menos de 30-40 nm aparte. Proximidad de proteína generalmente se detecta por primera incubar las células con anticuerpos primarios apropiados en diferentes especies (por ej., conejo y ratón) contra cada interacción proteína, luego agregar anticuerpos secundarios propios de cada especie, sondas de ADN previamente acoplado a corto. Si las sondas de ADN están en proximidad cercana, un oligonucleótido de ADN enlace específico al mismo tiempo puede enlazar tanto de estas sondas, formando una plataforma para la amplificación en situ PCR o mecanismo del círculo del balanceo. Etiquetas fluorescentes agregados a la reacción de amplificación permiten la visualización de las proteínas obran recíprocamente, que aparecen como puntos fluorescentes que pueden ser fácilmente cuantificados y localizadas en determinadas regiones en la celda7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Las interacciones proteína-proteína regulada están un principio rector de muchos eventos de señalización, y la detección de este tipo de eventos es un elemento importante en la comprensión de cómo estas vías están organizadas y cómo funcionan. Hay muchos métodos para detectar las interacciones proteína-proteína en las células, pero relativamente pocos pueden utilizarse para detectar interacciones entre proteínas endógenas. Un tal método, el análisis de ligadura de proximidad (PLA), tiene varias ventajas para recomendar su uso. En comparación con otros métodos comunes de análisis de interacción de proteínas, PLA tiene relativamente alta sensibilidad y especificidad, se puede realizar con la manipulación mínima de la célula y en el protocolo descrito en este documento, requiere sólo dos específico del destino anticuerpos derivan de diferentes especies (por ejemplo., de ratón y conejo) y un reactivo especializado: un conjunto de anticuerpos secundarios que son oligonucleótidos covalentemente ligados a determinado que, cuando muy cerca uno del otro, crear un plataforma amplificable en situ PCR o amplificación de círculo rodante. En esta presentación mostramos cómo aplicar la técnica PLA para visualizar cambios en proximidad MST1 y MST2 en células fijas. La técnica descrita en este manuscrito es particularmente aplicable para el análisis de estudios de señalización de la célula.

Se utilizó el ensayo PLA para probar la interacción entre MST1 y MST2 en HEK-293 y iHSC. Las células eran fijos, permeabilized y teñidas con anticuerpos diferentes, seguidos de amplificación en situ según el protocolo PLA (figura 1). Para documentar el nivel de heterodimerization MST1/MST2, las células fueron teñidas con anticuerpos MST1 y MST2 (figura 1A, 1C y 1 G). Como control positivo, tambi?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

El ensayo de ligadura de proximidad in situ o PLA, es una tecnología capaz de detectar interacciones entre proteínas, tejido fijado y células. Las asociaciones entre proteínas pueden identificarse y cuantificarse sin necesidad de expresión transgénica ni tecnologías adicionales. El único requisito es la disponibilidad de anticuerpos específicos de alta eficiencia que se pueden modificar con oligonucleótidos de ADN.En los tejidos MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activos, pero los estímulos oncogénicos pueden aumentar el nivel de heterodimeros MST1 MST2 y tales heterodímeros están inactivos. Después de la incubación con anticuerpos de imprimación específicos contra las proteínas de interés, se añaden a la ranura anticuerpos secundarios específicos especiales, cada uno vinculado a una cadena de ADN única, corta y gratuita unida a ella, para unirse a los anticuerpos primarios. Si las proteínas en las preguntas son heterodimerizadas, tanto los anticuerpos primarios como los anticuerpos secundarios unidos a ellos estarán muy cerca.En este estado, las hebras de ADN adjuntas en los segundos anticuerpos pueden interactuar a través de una adición posterior de otros dos oligonucleótidos de ADN formadores de círculos. Varios cientos de replicación del círculo de ADN puede ocurrir después de una reacción de amplificación y una señal de fluorescencia es generada por sondas de oligonucleótido de cortesía niveladas. Por lo tanto, cada señal detectada se visualiza como un punto fluorescente individual que se puede asignar a una ubicación subcelular específica basada en imágenes de microscopio.El día antes del experimento, cubra 16 diapositivas bien bien cuidadas añadiendo 50 a 100 microlitros de laminina de ratón o poli-L-lisina e incubar a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos eliminar la solución fría, dividir las células usando Trypsin y la placa 15,000 a 25, 000 células por pozo en 16 diapositivas bien cámaras. Incubar células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante 24 horas.Después de 24 horas, retire el medio de los pozos y lave suavemente las células con PBS. Utilice una micropipeta para minimizar la toma de riesgos de la muestra y luego aspire el PBS y fije las células añadiendo 50 microlitros de 4%PFA por pozo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. No pipetee la solución directamente sobre las células, ya que eso puede resultar en el desprendimiento de las células.Después de la fijación, lave las células con TBST tres veces durante cinco minutos cada una con agitación leve. A continuación, permeabilizar las células e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Una vez completada la permeabilización, lave las células con TBST tres veces durante cinco minutos por lavado con agitación.Después de eliminar TBST añadir una gota de solución de bloqueo en cada pozo e incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante una hora a 37 grados Centígrados. Diluir los anticuerpos primarios. Retire la solución de bloqueo con una micropipeta, pero no permita que las diapositivas se sequen.Vórtice y añadir 40 microlitros de la solución de anticuerpos diluidos a los pozos apropiados e incubar las muestras a 37 grados Celsius en una cámara de humedad precalentada durante una hora. Durante la incubación, diluya las dos sondas PLA en el diluyente de anticuerpos. Para cada muestra prepare 40 microlitros de sonda PLA.Después de una hora de incubación, aspirar la solución de anticuerpos y lavar los portaobjetos dos veces durante cinco minutos con TBST a temperatura ambiente. Retire suavemente el TBST de las diapositivas y agregue 40 microlitros de la solución de sonda PLA a cada pozo. Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante una hora a 37 grados centígrados.Vórtice y diluya los volúmenes requeridos de la población de ligadura de 1 a 5 en agua de alta pureza inmediatamente antes de su uso. Se requieren 40 microlitros de la solución de ligadura para cada pocóteo. Después de la incubación, retire la solución PLA de los portaobjetos y lávelos dos veces en TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación.Utilice un bloque de congelación al eliminar la ligasa del congelador y justo antes de agregarlo a las células, vórtice y diluirlo con la solución de ligadura. Retire el TBST de las diapositivas y agregue 40 microlitros de la solución de ligasa de ligadura a cada pocero. Incubar toboganes en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación aspirar la solución y lavar dos veces con TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación. Evite exponer el pozo a la luz brillante, ya que los reactivos son sensibles a la luz. Durante el último lavado, vórtice y diluir los volúmenes requeridos de solución de amplificación en agua de alta pureza inmediatamente antes de su uso.Mantener la polimerasa sobre hielo o en un bloque de enfriamiento y justo antes de agregarla al vórtice de las células y diluir con la solución de amplificación. Aspirar el TBST de los pozos y añadir 40 microlitros de solución de amplificación a cada pocólculo. Incubar toboganes en una cámara oscura de humedad precalentada durante 100 minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación, aspirar la solución de amplificación polimerasa de los portaobjetos y lavar dos veces diez minutos cada uno en TBST a temperatura ambiente. Retire las cámaras y la silicona alrededor de los pozos de la diapositiva por completo. Raspa las perlas restantes de silicona con una maquinilla de afeitar.Dibuja una cuadrícula en la diapositiva que separa cada pozo. Agregue aproximadamente 40 microlitros del medio de montaje con DAPI, asegurando que no quede ninguna burbuja de aire atrapada bajo el resbalón de la cubierta. Use esmalte de uñas para fijar el vidrio de la cubierta.El análisis microscópico se puede realizar en 20 minutos después de la fijación, pero en la práctica nos resulta más conveniente realizar análisis de imágenes al día siguiente. Para analizar las muestras, utilizamos un microscopio de escaneo láser de configuración Leica SP8. Aquí se muestran ejemplos de ensayo de ligadura de proximidad in situ que visualiza la proximidad entre las proteínas MST 1 y MST2 en las células renales embrionarias humanas en los paneles A a D, y las células Schwann humanas en los paneles E a través de H.In todos los núcleos celulares de los paneles son manchados de azul por DAPI y los puntos rojos indican señales de ligadura de proximidad positivas resultantes de la proximidad cercana entre las proteínas indicadas.El panel A muestra la proximidad de MST1 y MST2 y el panel B muestra la proximidad de ERK y fosfoERK, ya que estos epítopos están en la misma proteína. El Panel C representa un control negativo, ya que estas células como MST1 y MST2 y el Panel D representan un segundo control negativo manchado con anticuerpos para MST1 y ERK que no se espera que estén cerca unos de otros. Los paneles E y F muestran la proximidad de MST1 con MST2 y ERK con fosfoERK en células Schwann.Los paneles G y H son controles negativos manchados solo con anticuerpos MST1 o con anticuerpos MST1 y ERK. Es imperativo utilizar anticuerpos primarios no reactivos que deben reconocer sólo un miembro del heterodímero. También es importante recordar el uso de diferentes puntas para evitar la contaminación cruzada de anticuerpos primarios y sondas PLA, para evitar tocar el fondo del pozo, y para evitar pipetear directamente en las muestras.Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar PLA in situ para estudiar la dimerización de proteínas en células fijas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Investigación

Bioquímica

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...