Name: detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Vi tackar hela Chernoff laboratoriet för bidrar till optimering och validering av detta protokoll, särskilt Maria Radu och Galina Semenova. Vi tackar också Andrey Efimov Cell Imaging anläggningen vid Fox Chase Cancer Center. Detta arbete stöds av ett bidrag från NIH (R01 CA148805) till JC.

1. beredning av lösningar
<ol><li>Förbereda fixativ lösning: 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS. För 10 mL, ta 2,5 mL av 16% PFA och tillsätt 7,5 mL 1 x PBS. Faror: PFA är cancerframkallande vid låga doser. Ångor och kontakt med huden är farliga. Förvaras vid-20 ° C.</li>
	<li>Förbereda permeabilisering lösning: 0,1% Triton x-100 i 1 x PBS. För 100 mL lösning, tillsätt 100 µL av Triton x-100 till 100 mL 1 x PBS. Förvara i rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Förbered tvättbufferten: 1 ...

<ol>
	<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nore1B/Mst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na&#239;ve+T+cells.">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of na&#239;ve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li><li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOBKL1A/MOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation.">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li><li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades.">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li><li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1/Mst2Heterodimerization.">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li><li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ste20-like+protein+kinase,+Mst1,+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain.">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li><li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome.">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li><li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li></ol>

Vi fann det lämpligt att använda kammaren objektglas för detta experiment, som det är mycket bekvämt att utföra experimentet med flera (14-16)-cellinjer och det finns ingen anledning att ändra urvalet varje gång under mikroskopi analys. Några komplikationer kan uppstå, till exempel en ökad risk för korskontaminering med antikroppar. Därför föreslår vi att tvätta varje brunn individuellt istället för att använda en Coplin-burk, trots ökad varaktighet av experimentet. Dessutom, borttagning av silikon i...

Störningar av MST1/Hippo signalering har varit ansluten till utvecklingsstörningar och carcinogenes1. Hos däggdjur, aktivera kinaser MST1 och MST2 (fosforylera) MOB1 och LATS1/2, varav den senare då phosphorylates och inaktiverar transkriptionell samtidig aktivare Ja-associerade protein (YAP)2. I sin aktiva (unphosphorylated) form har YAP onkogen aktivitet, ökad transkription av cell spridning gener; omvänt, när YAP inactivateds av Hippo vägen, cellproliferation dämpas och apoptos främjas3. I vävnader, MST1 och MST2 finns huvudsakligen som aktiva homodimers, onkogena stimuli kan öka nivåer av MST1/MST2 heterodimerer men sådana heterodimerer är inaktiva4. Men fortfarande hur MST1/MST2 heterodimerization regleras dåligt förstådd. Både homo- och heterodimerer är medierade via interaktioner mellan C-terminal dubbeltvinnade regioner av MST1 och MST2 känd som SARAH domäner5. Med en i situ visat PLA i denna artikel, vi visar förekomsten av MST1/MST2 heterodimerer i mänskliga Schwann celler (HSC) och mänskliga embryonala njure celler (HEK-293). PLA har en fördel över andra protein och protein interaktion detektionsmetoder eftersom det möjliggör upptäckt av endogen protein-protein interaktioner, som kan identifieras och kvantifieras utan behov av transgenens uttryck eller användning av epitop Taggar 6.
Transduktion signalvägar styrs till stor del av föreningen villkorad av komponenten proteiner. Till exempel leder stimulering av de flesta receptortyrosinkinaser till sin homo - eller hetero-dimerization och efterföljande association med ytterligare Intracellulär signalering proteiner, som själva formuläret ytterligare komplex. Syftet med metoden PLA är att visualisera närhet mellan proteiner i celler, förutsatt att proteinerna är mindre än 30-40 nm apart. Protein närhet upptäcks oftast av första ruvning cellerna med lämplig primär antikroppar tas upp i olika arter (t.ex., kanin och mus) mot varje samverkande protein, sedan lägga till artspecifika sekundära antikroppar, Pre kopplat till korta DNA-prober. Om DNA sonderna finns i närheten, kan en specifik länka DNA oligonukleotiden samtidigt binda både av dessa sonder, bildar en plattform för förstärkning av i situ PCR eller rullande cirkel mekanism. Fluorescerande tags tillsätts förstärkning reaktionen kan visualisering av samverkande proteiner, som visas som fluorescerande prickar som lätt kan kvantifieras och lokaliserad till vissa regioner i cell7,8, 9 , 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chamber slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">178599</td>
			<td style="width:167px;">16 well, glass slide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA probe Anti-Mouse Minus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wash Buffers, Flurescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Detection Reagents Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td>Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5726s</td>
			<td>pERK antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MST2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3952s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Krs-2 (RJ-5)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-100449</td>
			<td>MST1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton x100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 151-500</td>
			<td>To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica TCS SP8, 63x</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis with ImageJ software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay

Reglerade protein-protein interaktioner är en vägledande princip för många signalering händelser, och upptäckt av sådana händelser är en viktig del i att förstå hur sådana vägar är organiserade och hur de fungerar. Det finns många metoder att upptäcka protein-protein interaktioner i celler, men relativt få kan användas för att upptäcka interaktioner mellan endogena proteiner. En sådan metod, den närhet ligation assay (PLA), har flera fördelar att rekommendera dess användning. Jämfört med andra vanliga analysmetoder protein-protein interaktioner, PLA har relativt hög känslighet och specificitet, kan utföras med minimal cell manipulation, och, i det protokoll som beskrivs häri, kräver endast två mål-specifikt antikroppar som härrör från olika arter (t.ex., från mus och kanin) och en specialiserad reagens: en uppsättning av sekundära antikroppar som är kovalent länkade till specifika oligonukleotider som, när kommer i närheten av varandra, skapa en amplifiable plattform för i situ PCR eller rullande cirkel förstärkning. I denna presentation visar vi hur man tillämpa den PLA-tekniken för att visualisera förändringar i MST1 och MST2 närhet i fasta celler. Tekniken som beskrivs i detta manuskript är särskilt lämpligt för analys av cell signalering studier.

Vi använde PLA analysen för att testa samspelet mellan MST1 och MST2 i HEK-293 och iHSC. Cellerna var fast, permeabilized och färgas med olika antikroppar, följt av i situ förstärkning enligt protokollet PLA (figur 1). För att dokumentera nivån av MST1/MST2 heterodimerization, var celler fläckade av MST1 och MST2 antikroppar (figur 1A, 1 C och 1 G). Som positiv kontroll, vi använde också ERK o...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Här visar vi hur du använder en närhet Ligation Assay (PLA) för att visualisera MST1/MST2 heterodimerization i fasta celler med hög känslighet.

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

In situ Proximity Ligation Assay eller PLA, är en teknik som kan upptäcka interaktioner mellan proteiner, anbringad vävnad och celler. Associationerna mellan proteiner kan identifieras och kvantifieras utan behov av transgena uttryck eller ytterligare teknik. Det enda kravet är tillgången på specifika högeffektiva antikroppar som kan modifieras med DNA-oligonukleotider.I vävnader MST1 och MST2 finns främst som aktiva homodimerer, men onkogena stimuli kan öka nivån av MST1 MST2 heterodimers och sådana heterodimer är inaktiva. Efter inkubation med specifika primerantikroppar mot de proteiner av intresse, särskilda specifika sekundära antikroppar, varje kopplad till en unik, kort, gratis DNA-sträng fäst vid den, läggs till facket för att binda till de primära antikropparna. Om proteinerna i frågor är heterodimeriserade, både de primära antikroppar och sekundära antikroppar bundna till dem kommer att vara i närheten.I detta tillstånd kan de bifogade DNA-strängarna på de andra antikropparna interagera genom ett efterföljande tillägg av två andra cirkelbildande DNA-oligonukleotider. Flera hundrafaldig replikation av DNA-cirkeln kan uppstå efter en förstärkningsreaktion och en fluorescenssignal genereras av utjämnade gratis oligonukleotidsonder. Därför visualiseras varje detekterad signal som en individuell fluorescerande punkt som kan tilldelas en specifik subcellulär plats baserat på mikroskopbilder.Dagen före experiment, päls 16 välkammarer glider genom att lägga till 50 till 100 mikroliter av mus laminin eller poly-L-lysin och inkubera vid 37 grader Celsius. Efter 30 minuter ta bort kall lösning, dela cellerna med hjälp av Trypsin och plattan 15, 000 till 25, 000 celler per brunn i 16 välkammared bild. Inkubera celler vid 37 grader Celsius i en befuktad 5%koldioxidinkubator i 24 timmar.Efter 24 timmar, ta bort mediet från brunnarna och tvätta försiktigt cellerna med PBS. Använd en mikropipette för att minimera risktagandet av provet sedan aspirera PBS och fixera celler genom att lägga till 50 mikroliter på 4%PFA per brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur utan agitation. Pipettera inte lösningen direkt på cellerna, eftersom det kan resultera i att cellerna lossnar.Efter fixeringen tvättar du cellerna med TBST tre gånger i fem minuter vardera med mild agitation. Nästa permeabilisera cellerna och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur utan agitation. Efter permeabilisering är klar, tvätta cellerna med TBST tre gånger i fem minuter per tvätt med agitation.Efter att ha tagit bort TBST tillsätt en droppe blockerande lösning i varje brunn och inkubera bilderna i en förvärmd fuktighetskammare i en timme vid 37 grader Celsius. Späd primära antikroppar. Ta bort blockeringslösningen med hjälp av en mikropipette men låt inte objektglas torka.Vortex och tillsätt 40 mikroliter av den utspädda antikroppslösningen till lämpliga brunnar och inkubera proverna i 37 grader Celsius i en förvärmd fuktighetskammare i en timme. Under inkubationen späd de två PLA-sonderna i antikroppspädningsmedel. För varje prov förbereda 40 mikroliter av PLA sond.Efter en timmes inkubation, aspirera antikroppslösningen och tvätta diabilder två gånger i fem minuter med TBST i rumstemperatur. Ta försiktigt bort TBST-knappen från objektglasen och tillsätt 40 mikroliter av PLA-sondlösningen till varje brunn. Inkubera bilderna i en förvärmd fuktighetskammare i en timme vid 37 grader Celsius.Vortexa och späd de erforderliga volymerna av ligeringsstocken 1 till 5 i vatten med hög renhet omedelbart före användning. 40 mikroliter av ligeringslösningen krävs för varje brunn. Efter inkubationen tar du bort PLA-lösning från objektglasen och tvättar dem två gånger i TBST i fem minuter vid rumstemperatur med agitation.Använd ett frysblock när du tar bort ligase ur frysen och precis innan du lägger till den i cellerna, virvel och späd den med ligaturlösningen. Ta bort TBST från bilderna och lägg till 40 mikroliter av ligeringsligerlösningen i varje brunn. Inkubera diabilder i en förvärmd fuktighetskammare i 30 minuter vid 37 grader Celsius.Efter inkubationen aspirera lösningen och tvätta två gånger med TBST i fem minuter vid rumstemperatur med agitation. Undvik att utsätta brunnen för starkt ljus eftersom reagenserna är ljuskänsliga. Under den sista tvätten, virvel och späda ut kravvolymerna av förstärkningslösning i hög renhetsvatten omedelbart före användning.Håll polymerasen på is eller i ett kylblock och precis innan du lägger till den i cellerna virvel och späd med förstärkningslösningen. Aspirera TBST från brunnarna och tillsätt 40 mikroliter av förstärkningslösning till varje brunn. Inkubera glider i en mörk förvärmd luftfuktighet kammare i 100 minuter vid 37 grader Celsius.Efter inkubationen aspirerar du amplification-polymeraslösningen från objektglasen och tvättar två gånger tio minuter vardera i TBST vid rumstemperatur. Ta bort kamrarna och silikonet runt brunnarna från glidglaset helt. Skrapa bort de återstående pärlorna av silikon med en rakhyvel.Rita ett rutnät på bilden som skiljer varje brunn. Tillsätt cirka 40 mikroliter av monteringsmediet med DAPI, vilket garanterar att inga luftbubblor fastnar under täckslivan. Använd nagellack för att fixera täckglas.Mikroskopisk analys kan utföras på 20 minuter efter fixering, men i praktiken finner vi det mest praktiskt att utföra bildanalys följande dag. För att analysera proverna använder vi en Leica SP8 konfigurera laserscanning mikroskop. Visas här är exempel på in situ närhet ligatur assay visualisera närhet mellan MST 1 och MST2 proteiner i mänskliga embryonala njurceller i panelerna A genom D, och Human Schwann celler i panelerna E till H.In alla paneler cell kärnor färgas blå av DAPI och röda prickar indikerar positiv närhet ligatur analyssignaler till följd av närhet mellan de indikerade proteiner.Panel A visar närhet av MST1 och MST2 och panel B visar närhet av ERK och phosphoERK som dessa epitopes är på samma protein. Panel C representerar en negativ kontroll eftersom dessa celler som MST1 och MST2 och Panel D representerar en andra negativ kontroll färgas med antikroppar för MST1 och ERK som inte förväntas vara i närheten av varandra. Panelerna E och F visar närhet till MST1 med MST2 och ERK med phosphoERK i Schwann-celler.Panel G och H är negativa kontroller som endast färgas med MST1-antikroppar eller med MST1- och ERK-antikroppar. det är absolut nödvändigt att använda icke cross-reaktiv primära antikroppar att det bör känna igen endast en medlem av heterodimer. Också det är viktigt att komma ihåg att använda olika tips för att undvika korskontaminering av primära antikroppar och PLA sonder, för att undvika att vidröra botten av brunnen, och för att undvika pipettering direkt på prover.Efter att ha sett denna video bör du ha en god förståelse för hur man använder in situ PLA för att studera protein dimerisering i fasta celler.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillärelektrofores Separation av monoklonal antikropp isoformer med hjälp av en neutral kapillär

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av protein-proteininteraktion i nukleära och cytoplasmiska fraktioner av Co-immunoprecipitation och<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Mycket känslig och kvantitativa påvisande av proteiner och deras isoformer av kapillär isoelektrisk fokusering metod

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...