Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

HAC var Milton E. Cassel lærd af Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbejde blev finansieret af tilskud til HAC fra National Institute for generelle medicinske videnskaber R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute of generelle medicinske videnskaber R01 GM0866465, Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin og forskning i stamceller ( Rose bakker og Hal Gaba awards), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, leukæmi lymfom Society, indvirkning priser fra Jonsson Comprehensive Cancer Center til WEL og HAC. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. HAC er medlem af Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin & stamcelleforskning, UCLA Molekylærbiologisk Institut og UCLA Bioinformatik mellemtjenstlig Program.

Alle forsøg beskrives blev godkendt af Animal Care Udvalget ved University of California, Los Angeles.
1. skabe lysbilleder af frosne mus hud
<ol><li>Aflive mus i institution politik. Bemærk: Følg institutionelle politik for Beskyttelsesbeklædning. Alle protokoller, der involverer dyr skal godkendes af den institutionelle dyr efterbehandling udvalget.</li>
	<li>Fjerne den mus hår med en dyr hår trimmer.</li>
	<li>Gør indsnit i huden ved hjælp af saks. Brug af tang, løft huden væ...

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Metoden beskrevet her kan bruges til at overvåge aktiviteten af laktat dehydrogenase eller andre metaboliske enzymer, der genererer NADH eller NADPH, i forskellige celletyper i et væv eller inden for forskellige dele af et væv over tid. Laktat dehydrogenase er et vigtigt enzym for at forstå biologi af stamceller og tumorer, og evnen til at overvåge laktat dehydrogenase aktivitet i enkelte celler er tilbøjelige til at give vigtig indsigt i funktionen af dette enzym.
En vigtig fordel af de...

Forstå steder i væv hvor enzymer har høj eller lav aktivitet er afgørende for udvikling af forståelse og fysiologi. Udskrift eller protein niveauer bruges ofte som surrogater for enzymatisk aktivitet. Sådanne undersøgelser kan være informativ, giver de ikke oplysninger, der kan være kritisk for fastsættelse af et enzyms aktivitet, såsom posttranslationelle modifikationer, tilstedeværelsen af proteinkomplekser, eller det enzym subcellulært lokalisering. Når enzymatisk aktivitet måles direkte, er det ofte overvåges i homogeniseret protein lysates, der ikke længere indeholder oplysninger om individuelle celler i blandingen eller den geografiske fordeling af celler med høj eller lav aktivitet inden for en væv.
Vi giver her en detaljeret protokol for kortlægning af den geografiske fordeling af enzymatisk aktivitet inden for en vævsprøve. Metoden er baseret på tidligere undersøgelser viser, at tetrazolium salte kan bruges til at lokalisere aktiviteten af dehydrogenases, reductases og oxidases i frossen væv1. Med disse metoder dannes en vanduopløselig formazankoncentrationen når protoner er overført til en tetrazolium salt2,3. Glucose-6-fosfat dehydrogenase genererer NADPH og en proton, og er blevet opdaget med tetrazolium aktivitet. Glucose-6-fosfat dehydrogenase er blevet overvåget i i europæiske skrubbe hepatocytter4, i alveolær type 2 celler af lungerne5 og nephrons nyre5. Tetrazolium salte har også været brugt til at overvåge transketolase aktivitet i frossen væv6. En lignende fremgangsmåde blev for nylig brugt til at overvåge aktiviteten af flere dehydrogenases i det samme væv på tilstødende dias7.
Vi beskriver her en metode til at bruge tetrazolium salte til at overvåge den geografiske fordeling af laktat dehydrogenase aktivitet (figur 1). Laktat dehydrogenase kan konvertere pyruvat genereret af glykolyse til laktat og den modsatgående reaktion. Laktat dehydrogenase aktivitet er derfor en vigtig faktor for pyruvats indgang til tricarboxylic syre cyklus versus sin sekretion som laktat. Laktat niveauer i blodet er ofte bruges til at diagnosticere en række sygdomme, herunder kræft8,9,10, fordi det kan signalere at sygdom eller skade har beskadiget celler og enzymet er blevet frigivet.
Der er fire laktat dehydrogenase gener: LDHA, LDHB, LDHC og LDHD11. LDHA og LDHB menes at være opstået fra gentagelse af en tidlig LDHA gen12. LDH er aktiv som en tetramer og LDHA og LDHB kan danne homotetramers og heterotetramers med hinanden. LDHA er rapporteret at have højere affinitet til pyruvat, mens LDHB er rapporteret at have højere affinitet for laktat og fortrinsvis konvertere laktat til pyruvat13. LDHA promotor indeholder bindingssteder for HIF1α, cMYC og FOXM1 transskription faktorer11. Hertil kommer, ligesom mange andre glykolytiske enzymer14,15, kan LDH ændres af posttranslationelle modifikationer. Fibroblast vækstfaktor receptor 1 kan phosphorylate LDHA på Y10, som fremmer tetramer dannelse, eller Y83, som fremmer NADH substrat bindende16. LDHA kan også være acetyleret17. Af disse grunde kræver en fuldstændig forståelse af LDH aktivitet overvågning ikke kun LDH protein niveauer, men enzymets aktivitet så godt.
Ud over den metode, vi præsenterer her, har været anvendt andre metoder til at overvåge laktat dehydrogenase aktivitet. Laktat dehydrogenase aktivitet kan overvåges spektrofotometrisk i homogeniseret protein lysate. Generation af NADH som laktat omdannes til pyruvat kan måles baseret på absorbans ved 340 nm, mens forsvinden af NADH kan overvåges som pyruvat omdannes til laktat18. Laktat dehydrogenase aktivitet er også blevet overvåget med magnetisk resonans imaging (MR). 13 C-pyruvat kan administreres og omdannelse af pyruvat til laktat kan overvåges som forholdet mellem [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat. Forhøjet nøgletal af [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat er blevet observeret i kræft væv19. Mens Mr-baserede tilgange kan give oplysninger om laktat dehydrogenase aktivitet i normal og sygdom væv, har metoderne, der ikke den beslutning, der er nødvendig for at bestemme aktivitetsniveau i bestemte celler. Den metode, der her kan give oplysninger om laktat dehydrogenase aktivitet i væv og selv i enkelte celler.
Bruger i situ aktivitet assays, fandt vi, at aktiviteten af laktat dehydrogenase er høj i hårsækken stamceller af musen hud20. Vi brugte også metoden til at overvåge aktiviteten af laktat dehydrogenase i kulturperler embryonale stamceller og fandt aktiviteten er højere i stamcellerne end feeder lag. Endelig, vi overvåges aktiviteten af laktat dehydrogenase i friske mus aorta og observeret farvning i glatte muskelceller. Vi beskriver her en detaljeret protokol til overvågning af laktat dehydrogenase aktivitet i frosne mus hud.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Kortlægning enzymatisk aktivitet i tid og rum er afgørende for at forstå det molekylære grundlag af celle opførsel i normale væv og sygdom. In situ metaboliske aktivitet assays kan give oplysninger om den geografiske fordeling af metaboliske aktivitet inden for en væv. Vi giver her en detaljeret protokol til overvågning af aktiviteten af enzymet laktat dehydrogenase direkte i vævsprøver. Laktat dehydrogenase er en vigtig faktor for hvorvidt forbrugt glukose vil blive konverteret til energi via aerobe eller anaerobe glykolyse. En opløsning indeholdende laktat og NAD tilbydes til en frossen væv sektion. Celler med højt laktat dehydrogenase aktivitet vil konvertere den medfølgende laktat til pyruvat, mens samtidig konvertere nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) til NADH og en proton, som kan påvises baseret på en reduktion af nitrotetrazolium blå til formazankoncentrationen, som er visualiseret som et blåt bundfald. Vi beskriver en detaljeret protokol til overvågning af laktat dehydrogenase aktivitet i mus hud. Anvendelsen af denne protokol, fandt vi, at laktat dehydrogenase aktivitet er høj i inaktiv hår follikel-stamceller i huden. Anvendelsen af protokollen til kulturperler mus embryonale stamceller afslørede højere farvning i kulturperler embryonale stamceller end mus embryonale fibroblaster. Analyse af frisk isolerede mus aorta afslørede farvning i glatte muskelceller vinkelret på aorta. Den metode, der kan bruges til at rumligt kort aktiviteten af enzymer, der genererer en proton i frossen eller frisk væv.

Vi har tidligere rapporteret resultater for i situ aktivitet assays i mus hud20. Som vist i figur 3, observerede vi, høje niveauer af laktat dehydrogenase aktivitet i hårsækken stamceller i bunden af hårsækken når procedurerne beskrevet ovenfor blev fulgt. Disse fund blev bekræftet af fluorescens aktiveret celle sortering af huden for hårsækken stamceller og bekræfter høj laktat dehydrogenase aktivitet i stamceller ...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kortlægning stofskifte: Overvågning af laktat Dehydrogenase aktiviteten direkte i væv

Vi beskriver en protokol for kortlægning af den geografiske fordeling af enzymatisk aktivitet for enzymer, der genererer nicotinatmide-adenin-dinucleotid-phosphat (NAD(P)H) + H + direkte i vævsprøver.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode til måling Metabolisme i Sorteret subpopulationer af Komplekse Cell Fællesskaber Brug stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay at opdage tRNA-Isopentenyl-Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheder (SUBEs) som værktøjer til berigelse, isolation, identifikation og karakterisering af SUMO Proteome i leverkræft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Hurtig og omkostningseffektiv RNA udvinding af rotte pancreas væv

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...