Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

HAC was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan HAC van nationale Instituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM081686, R01 AR070245, Rijksinstituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM0866465, de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek ( Rose heuvels en Hal Gaba awards), de Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, de maatschappij van de leukemie lymfoom, Impact awards van de Jonsson uitgebreide Cancer Center WEL te HAC. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P50CA092131. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. HAC is een lid van de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de UCLA moleculaire biologie-instituut en het UCLA Bioinformatics interdepartementale programma.

Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Californië, Los Angeles.
1. het genereren van dia's van bevroren muis huid
<ol><li>Euthanaseren muizen overeenkomstig het beleid van de instelling. Opmerking: Volg institutioneel beleid voor beschermende kleding. Alle protocollen waarbij dieren moeten worden goedgekeurd door de Commissie voor de institutionele zorg van dier.</li>
	<li>Verwijderen van de muis haar met een die...

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de activiteit van lactaat dehydrogenase of andere metabole enzymen die resulteren in NADH of NADPH, verschillende soorten cellen binnen een weefsel of binnen verschillende gedeelten van een weefsel na verloop van tijd te controleren. Lactaat dehydrogenase is een belangrijk enzym voor het begrip van de biologie van stamcellen en tumoren, en de mogelijkheid om lactaat dehydrogenase activiteit in afzonderlijke cellen te controleren is waarschijnlijk belangrijk inzicht verwer...

Inzicht in de locaties binnen weefsels waarin enzymen hoge of lage activiteit hebben is essentieel voor de ontwikkeling van het begrip en fysiologie. Transcript of proteïne niveaus worden vaak gebruikt als surrogaten voor enzymatische activiteit. Hoewel dergelijke studies kunnen informatief, bieden ze geen gegevens die cruciaal worden kan voor het bepalen van een enzymactiviteit, zoals posttranslationele modificaties, de aanwezigheid van eiwitcomplexen, of van het enzym subcellular localisatie. Enzymatische activiteit rechtstreeks wordt gemeten, is het vaak gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysates die niet langer informatie over individuele cellen binnen het mengsel of de ruimtelijke spreiding van de cellen met hoge of lage activiteit binnen een weefsel bevatten.
Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit binnen een weefsel monster. De methodologie is gebaseerd op eerdere onderzoeken die aantonen dat tetrazolium zouten kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van de activiteit van dehydrogenases, reductases en oxidasen in bevroren weefsel1. Met deze methoden wordt een water onoplosbare formazan gevormd wanneer protonen worden overgedragen aan een tetrazolium zout2,3. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase genereert NADPH en een proton en met tetrazolium activiteit is geconstateerd. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase heeft gevolgd in Europese bot hepatocyten4, in alveolaire type 2 cellen van de longen5 en nephrons van de nier-5. Tetrazolium zouten zijn ook gebruikt om transketolase activiteit in bevroren weefsel6te controleren. Een soortgelijke aanpak werd onlangs gebruikt om de activiteit van meerdere dehydrogenases in de dezelfde weefsel op aangrenzende dia's7te controleren.
Hier beschrijven we een methode om met behulp van tetrazolium zouten te controleren van de ruimtelijke spreiding van lactaat dehydrogenase activiteit (Figuur 1). Lactaat dehydrogenase kunt converteren pyruvaat gegenereerd door glycolyse te lactaat en de omgekeerde reactie. Lactaat dehydrogenase activiteit is bijgevolg een belangrijke determinant van pyruvaat de ingang in de tricarboxylic acid cyclus versus de secretie zoals lactaat. Lactaat niveaus in het bloed worden vaak gebruikt voor de diagnose van een aantal ziekten, waaronder kanker8,9,10, omdat het kan signaal dat ziekte of letsel heeft beschadigde cellen en het enzym is vrijgegeven.
Er zijn vier lactaat dehydrogenase genen: LDHA, LDHB, LDHC en LDHD11. LDHA en LDHB worden verondersteld te zijn ontstaan uit een vroege LDHA gen12dubbel. LDH is actief als een tetrameer en LDHA en LDHB kan homotetramers en heterotetramers met elkaar. LDHA wordt gemeld te hebben hogere affiniteit voor pyruvaat, terwijl LDHB aan hebben hogere affiniteit voor lactaat, en bij voorkeur converteren lactaat en pyruvaat13is gemeld. De promotor LDHA bevat bandplaatsen voor de HIF1α, cMYC en FOXM1 transcriptie factoren11. Bovendien, zoals vele andere glycolytic enzymen14,15, kan LDH worden gewijzigd door posttranslationele modificaties. Fibroblast groeifactor receptor 1 kan LDHA Y10, die bevordert tetrameer vorming, of Y83, die bevordert NADH substraat bindende16phosphorylate. Ook kan LDHA geacetyleerd17. Om deze redenen vereist een compleet begrip van LDH activiteit controle niet alleen LDH eiwitniveaus, maar van het enzym activiteit ook.
Naast de methode die we hier presenteren, zijn andere benaderingen gebruikt om lactaat dehydrogenase activiteit te controleren. Lactaat dehydrogenase activiteit kan spectrophotometrically worden gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysate. De generatie van NADH zoals lactaat wordt geconverteerd naar pyruvaat kan worden gemeten op basis van de absorptie bij 340 nm, terwijl de verdwijning van NADH kan worden gecontroleerd dat pyruvaat naar lactaat18is geconverteerd. Lactaat dehydrogenase activiteit heeft ook gevolgd met magnetische resonantie beeldvorming (MRI). 13 C-pyruvaat kan worden beheerd en de omzetting van pyruvaat naar lactaat kan worden gecontroleerd als de verhouding tussen [1 -13C] lactaat / [1 -13C] pyruvaat. Verhoogde ratio's van [1 -13C] lactaat / [1 -13C] pyruvaat zijn waargenomen in kanker weefsel19. Terwijl de MRI-gebaseerde benaderingen kunnen informatie geven over lactaat dehydrogenase activiteit in normale en ziekte weefsels, hebben de methoden niet de resolutie nodig voor het bepalen van het niveau van de activiteit in specifieke cellen. De methodologie die hier geboden kan informatie verstrekken over lactaat dehydrogenase activiteit in weefsel gebieden en zelfs in afzonderlijke cellen.
Met behulp van in situ activiteit testen, vonden we dat de activiteit van lactaat dehydrogenase hoog in de haarfollikel cellen van de stam van muis huid20 is. Wij ook gebruikt de methode aan de activiteiten van lactaat dehydrogenase in gekweekte embryonale stamcellen controleren en vond dat de activiteit is hoger in de cellen van de stam dan de feeder laag. Tenslotte, wij gecontroleerd van de activiteit van lactaat dehydrogenase in verse muis aorta en waargenomen vlekken in de zachte spiercellen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in bevroren muis huid.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Toewijzen van enzymatische activiteit in ruimte en tijd is van cruciaal belang voor het begrip van de moleculaire basis van cel gedrag in normale weefsels en ziekte. In situ metabole activiteit testen kunnen informatie geven over de ruimtelijke spreiding van de metabole activiteit binnen een weefsel. Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toezicht op de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase rechtstreeks in weefselmonsters. Lactaat dehydrogenase is een belangrijke determinant van of verbruikte glucose worden geconverteerd naar energie via aerobe of anaerobe glycolyse. Een oplossing met lactaat en NAD wordt verstrekt aan een bevroren weefselsectie. Cellen met hoge lactaat dehydrogenase activiteit zal omzetten in de meegeleverde lactaat pyruvaat, terwijl tegelijkertijd converteren verstrekt nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) NADH en een proton, die kan worden opgespoord op basis van de vermindering van de nitrotetrazolium blauwe naar formazan, die wordt weergegeven als een blauwe neerslag. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in muis huid. Toepassing van dit protocol, vonden we dat lactaat dehydrogenase activiteit hoog in de cellen van de stam van het sluimerende haarfollikel in de huid is. Toepassing van het protocol aan gekweekte muis embryonale stamcellen, bleek hoger kleuring in gekweekte embryonale stamcellen dan muis embryonale fibroblasten. Onderzoek van vers geïsoleerde muis aorta bleek kleuring in zachte spiercellen loodrecht op de aorta. De methodologie die kan worden gebruikt om de activiteit van enzymen die het genereren van een proton in bevroren of vers weefsel ruimtelijk in kaart.

Resultaten voor in situ activiteit testen in muis huid20hebben we eerder gemeld. Zoals blijkt uit Figuur 3, vastgesteld we hebben dat hoge niveaus van lactaat dehydrogenase activiteit in de haarfollikel stamcellen aan de basis van de haarfollikel als hierboven de procedures beschreven werden gevolgd. Deze bevindingen werden bevestigd door fluorescentie geactiveerd cel sorteren van de huid voor de cellen van de stam van de haar...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

We beschrijven een protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit voor enzymen die nicotinatmide adenine dinucleotide-fosfaat (NAD(P)H) + H + rechtstreeks in weefselmonsters genereren.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...