Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00
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HAC était le savant Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Ce travail a été financé par des dons au HAC de National Institute de R01 de Sciences médicales générales GM081686, R01 AR070245, National Institute of (médecine générale) Sciences R01 GM0866465, l’Eli, Edythe large Centre de médecine régénérative & Stem Cell Research Collines de rose et Hal Gaba awards), Health Center/UCLA ILEC NIH Grant UL1TR000124, la leucémie Lymphoma Society, Impact l’Iris Cantor féminines octroie de la Jonsson Comprehensive Cancer Center à WEL et HAC. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P50CA092131. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. HAC est membre de l’Eli & Edythe large Centre de médecine régénérative & Stem Cell Research, l’Institut de biologie moléculaire de UCLA et le programme interministériel de bioinformatique de UCLA.

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par le Comité de protection de l’Animal à l’Université de Californie à Los Angeles.
1. générer des diapositives de peau de souris congelées
<ol><li>Euthanasier souris conformément à la politique de l’institution. Remarque : Suivez la politique institutionnelle pour vêtements de protection. Tous les protocoles impliquant des animaux doivent être approuvés par le Comité institutionnel de protection Animal.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

La méthode décrite ici peut être utilisée pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase ou d’autres enzymes métaboliques qui génèrent le NADH ou le NADPH, dans différents types de cellules dans un tissu ou dans les différentes parties d’un tissu au fil du temps. Lactate déshydrogénase est une enzyme importante pour comprendre la biologie des cellules souches et de tumeurs, et la possibilité de surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans des cellules individuelles est suscep...

Comprendre les emplacements au sein des tissus dans lesquels enzymes ont une activité élevée ou faible est indispensable pour la physiologie et le développement de la compréhension. Niveaux de transcription ou de la protéine sont souvent utilisés comme substituts à l’activité enzymatique. Alors que ces études peuvent être informatifs, ils ne fournissent pas d’informations qui peuvent être essentielles pour la détermination de l’activité de l’enzyme, comme les modifications post-traductionnelles, la présence de complexes protéiques, ou la localisation subcellulaire de l’enzyme. Lorsque l’activité enzymatique est mesurée directement, il est souvent contrôlé dans les lysats de protéines homogénéisé qui n’est plus contiennent des informations sur des cellules individuelles dans le mélange ou la distribution spatiale des cellules ayant une activité au sein d’un tissu haute ou basse.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique dans un échantillon de tissu. La méthodologie est basée sur des études antérieures montrant que les sels de tétrazolium peuvent être utilisés pour localiser l’activité des déshydrogénases, réductases et oxydases en tissus congelés1. Avec ces méthodes, un formazan insolubles dans l’eau se forme lorsque les protons sont transférés à un tétrazolium sel2,3. Glucose-6-phosphate déshydrogénase génère NADPH et un proton et a été détecté avec activité de tétrazolium. Glucose-6-phosphate déshydrogénase a été contrôlé dans les hépatocytes flet européen4, dans les poumons de5 des cellules alvéolaires de type 2 et les néphrons du rein5. Sels de tétrazolium ont également été utilisés pour surveiller l’activité de la transcétolase en tissus congelés6. Une approche similaire a été récemment utilisée pour surveiller l’activité des déshydrogénases multiples dans le même tissu sur diapositives adjacentes7.
Nous décrivons ici une méthode pour utiliser les sels de tétrazolium pour surveiller la distribution spatiale de l’activité de la lactate déshydrogénase (Figure 1). Lactate déshydrogénase peut convertir pyruvate généré par la glycolyse de lactate et la réaction inverse. Activité de la lactate déshydrogénase est par conséquent un facteur déterminant de l’entrée du pyruvate dans le cycle des acides tricarboxyliques contre sa sécrétion comme le lactate. Les taux de lactate dans le sang sont souvent utilisés pour diagnostiquer un éventail de maladies, y compris le cancer8,9,10, car il peut indiquer que la maladie ou blessure a des cellules endommagées et l’enzyme a été libéré.
Il existe quatre gènes de lactate déshydrogénase : LDHA, LDHB, LDHC et LDHD11. LDHA et LDHB seraient apparus de duplication d’un début de gène LDHA12. LDH est active comme un tétramère et LDHA et LDHB peuvent former des HOMOTETRAMERES et heterotetramers entre eux. LDHA est rapporté avoir une affinité plus élevée pour le pyruvate, tandis que LDHB est rapporté pour avoir une affinité plus élevée pour le lactate et préférentiellement convertir lactate et pyruvate13. Le promoteur LDHA contient des sites de liaison pour la transcription facteurs HIF1α, cMYC et FOXM111. En outre, comme de nombreuses autres enzymes glycolytiques14,15, LDH peut être modifié par des modifications post-traductionnelles. Récepteur de facteur de croissance fibroblastique 1 peut phosphoryler LDHA à Y10, qui favorise la formation de tétramère, ou Y83, qui favorise la NADH substrat liaison16. LDHA peut également être acétylées17. Pour ces raisons, une compréhension complète de l’activité LDH exige une surveillance non seulement le taux de protéines LDH, mais aussi bien l’activité de l’enzyme.
Outre la méthode que nous présentons ici, les autres approches ont été utilisées pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase. Activité de la lactate déshydrogénase peut être surveillée par spectrophotométrie en protéines homogénéisé lysat. La génération du NADH lactate est convertie en pyruvate peut être mesurée selon l’absorbance à 340 nm, tandis que la disparition du NADH peut être surveillée comme le pyruvate est converti en lactate18. Activité de la lactate déshydrogénase a également été suivie avec l’imagerie par résonance magnétique (IRM). 13 C-pyruvate peut être administré et la conversion du pyruvate de lactate peut être surveillée comme le ratio de [1 -13C] lactate / [1 -13C] pyruvate. Élevé des ratios de [1 -13C] lactate / [1 -13C] pyruvate ont été observés dans le cancer des tissus19. Alors que les approches axées sur le MRI peuvent fournir des informations sur l’activité de la lactate déshydrogénase dans des conditions normales et les tissus de la maladie, les méthodes n’ont pas la résolution nécessaire pour déterminer le niveau d’activité dans certaines cellules. La méthodologie proposée ici peut fournir des informations sur l’activité de la lactate déshydrogénase dans les zones de tissus et même dans des cellules individuelles.
À l’aide de tests d’activité sur place , nous avons constaté que l’activité de la lactate déshydrogénase est élevée dans les cellules souches de souris peau20le follicule pileux. Nous avons également utilisé la méthode pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans les cellules souches embryonnaires cultivées et trouvé que l’activité est plus élevée dans les cellules souches que la couche de conducteur. Enfin, surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans les aortes de souris fraîche et observé une coloration dans les cellules musculaires lisses. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans la peau de souris congelées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Cartographie de l’activité enzymatique dans le temps et l’espace est essentiel pour comprendre les bases moléculaires du comportement de cellules dans les tissus normaux et la maladie. Essais in situ de l’activité métabolique peuvent fournir des informations sur la distribution spatiale de l’activité métabolique dans un mouchoir en papier. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour surveiller l’activité de l’enzyme lactate déshydrogénase directement dans les échantillons de tissus. Déshydrogénase de lactate est un déterminant important de la question de savoir si glucose consommé sera converti en énergie par la glycolyse aérobie ou anaérobie. Une solution contenant du lactate et NAD est fournie pour une section de tissus congelés. Cellules avec haute lactate déshydrogénases convertira le lactate fourni en pyruvate, tandis que simultanément conversion fourni nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) à NADH et un proton, qui peut être détecté, basée sur la réduction des nitrotetrazolium bleu en formazan, qui est visualisé comme un précipité bleu. Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans la peau de souris. Application de ce protocole, nous avons constaté que l’activité de la lactate déshydrogénase est riche en cellules souches quiescentes follicule pileux dans la peau. Elle applique le protocole aux cellules souches embryonnaires de souris cultivées ont révélé une coloration plus élevée dans les cellules souches embryonnaires cultivées que les fibroblastes embryonnaires de souris. Analyse d’aorte fraîchement isolés de souris a révélé une coloration dans les cellules musculaires lisses perpendiculaire à l’aorte. La méthodologie fournie peut être utilisée pour mapper spatialement l’activité des enzymes qui génèrent un proton dans le tissu congelé ou fraîche.

Nous avons déjà rapporté les résultats des tests d’activité sur place dans la peau de souris20. Comme illustré à la Figure 3, nous avons observé des niveaux élevés d’activité de la lactate déshydrogénase dans les cellules souches du follicule pileux à la base du follicule pileux lorsque les procédures décrites ci-dessus ont été suivies. Ces conclusions ont été corroborées par cellule à fluorescence ac...

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Métabolisme de cartographie : Surveiller l’activité de la Lactate déshydrogénase directement dans le tissu

Les auteurs décrivent un protocole pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique d’une enzyme qui génèrent nicotinatmide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H) + H + directement dans les échantillons de tissus.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Une méthode pour mesurer le métabolisme dans des communautés triées sous-populations cellulaires complexes Utilisation Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Recherche

Biochimie

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This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mesure et l’interprétation des taux de consommation d’oxygène en tout volent tête Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SumO-Binding Entities (SUBEs) comme outils pour l'enrichissement, l'isolement, l'identification et la caractérisation du protéome SUMO dans le cancer du foie

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...