Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00
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HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품에서 국립 연구소의 일반 의료 과학 R01 GM081686, R01 AR070245, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli와 Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구 (HAC에 교부 금에 의해 투자 되었다 로즈 언덕 및 Hal Gaba 상), 아와 HAC Jonsson 종합 암 센터에서 상을 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 백혈병 림프 종 사회 영향. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli & Edythe 넓은 센터의 재생 의학 및 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소, UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램의 회원입니다.

설명 하는 모든 실험 동물 관리 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 되었다.
1. 냉동된 마우스 스킨의 슬라이드 생성
<ol><li>기관 정책에 따라 마우스를 안락사 참고: 보호에 대 한 제도적 정책을 따릅니다. 동물 관련 된 모든 프로토콜 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다.</li>
	<li>동물 털 트리머 사용 마우스의 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>가 위를 사...

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. 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A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

여기 설명 하는 방법은 젖 산 효소 또는 다른 세포 유형 조직 내에서 또는 시간이 지남에 따라 조직의 다른 부분에서에서 NADH 또는 NADPH를 생성 하는 다른 대사 효소의 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 젖 산 효소, 종양 줄기 세포의 생물학을 이해 하기 위한 중요 한 효소 이며 개별 셀에서 젖 산 효소 활동을 모니터 하는 능력이이 효소의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.
<...

있는 효소는 높은 또는 낮은 활동 조직 내의 위치를 이해 하는 것은 이해 개발 및 생리학에 대 한 필수적입니다. 사본 또는 단백질 레벨은 효소 활동에 대 한 대리 모 알선으로 자주 사용 된다. 이러한 연구는 유익 수 있습니다, 그들은 포스트 번역 상 수정, 단백질 복합물, 또는 효소의 subcellular 지 방화의 존재 하는 효소의 활동을 결정 하기 위한 중요 한 수 있는 정보를 제공 하지 않습니다. 효소 활동은 직접 측정 하는 경우 더 이상 높은 또는 낮은 활동은 조직 내에서 혼합물 또는 셀의 공간 분포 내에서 개별 셀에 대 한 정보를 포함 하는 무 균된 단백질 lysates에 자주 모니터링 합니다.
여기는 조직 샘플 내에서 효소 활동의 공간 배급을 매핑하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 방법론은 tetrazolium 염 dehydrogenases, reductases, 및 냉동된 조직1에서 oxidases의 활동을 지역화를 사용할 수 있습니다 설명 하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 방법으로, 물 불용 성 formazan 형성 때 양성자 tetrazolium 소금2,3에 전송 됩니다. 포도 당-6-인산 효소는 NADPH와 양성자, 생성 하 고 tetrazolium 활동 감지 되었습니다. 포도 당-6-인산 효소는 유럽 넙치 hepatocytes4, 폐5 의 2 형 폐 포 세포와 신장5nephrons에서에서 모니터링 되었습니다. Tetrazolium 소금 또한 냉동된 조직6transketolase 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 비슷한 접근 방식은 최근 인접 한 슬라이드7에 동일한 조직에 여러 개의 dehydrogenases의 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었다.
여기 tetrazolium 염을 사용 하 여 (그림 1) 젖 산 효소 활동의 공간적 분포를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 젖 산 효소 분해 젖이 나올, 하 고 역 반응에 의해 생성 된 pyruvate를 변환할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 결과적으로 그것의 분 비로 젖이 나올 대 tricarboxylic 산 주기로 pyruvate의 입구를 결정 하는 중요 한 이다. 젖 산 수치 종종 다양 한 질병 이나 상해는 손상 된 세포와 효소가 릴리스 되었습니다 나타낼 수 있기 때문에 암8,,910를 포함 하 여 질병을 진단 하는 데 사용 됩니다.
4 젖 산 효소 유전자를 있다: LDHA, LDHB, LDHC, 및 LDHD11. LDHA와 LDHB는 초기 LDHA 유전자12의 중복에서 발현 생각 된다. LDH는 tetramer로 활성 이며 LDHA 및 LDHB homotetramers와 함께 heterotetramers를 형성할 수 있다. LDHA LDHB는 젖 산에 대 한 높은 선호도를 보고 pyruvate13우선적으로 젖 산을 변환 하는 동안 pyruvate에 대 한 높은 선호도가지고 보고 있다. LDHA 발기인 HIF1α, cMYC 및 FOXM1 녹음 방송 요인11에 대 한 바인딩 사이트를 포함 되어 있습니다. 또한, 같은 많은 다른 glycolytic 효소14,15, LDH 포스트 번역 상 수정에 의해 수정할 수 있습니다. 섬유 아 세포 성장 인자 수용 체 1 Y10 tetramer 형성을 촉진, 또는 NADH 기질 바인딩16촉진 Y83 LDHA phosphorylate 수 있습니다. LDHA acetylated17수도 있습니다. 이러한 이유로, LDH 활동의 완전 한 이해 LDH 단백질 수준, 하지만 효소의 활동 뿐만 아니라 모니터링 해야 합니다.
우리가 여기에 제시 하는 메서드와 다른 접근 젖 산 효소 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 무 균 단백질 lysate spectrophotometrically 젖 산 효소 활동을 모니터링할 수 있습니다. NADH 생성 젖 산 pyruvate 변환으로 측정 될 수 있다 340 흡 광도에 따라 nm, 동안 pyruvate는 젖 산18변환으로 NADH의 실종을 모니터링할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 또한 자기 공명 영상 (MRI)와 모니터링 되었습니다. 13 C-pyruvate를 관리할 수 있습니다 하 고 젖이 나올에 pyruvate의 변환의 비율으로 감시 될 수 있다 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate. 상승의 비율 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate 암 조직19에서 관찰 되었습니다. MRI-기반 접근 정상에 젖 산 효소 활동과 질병 조직에 정보를 제공할 수 있습니다, 하는 동안 방법론 특정 셀에 활동 수준을 결정 하는 데 필요한 해상도 있지 않습니다. 여기에 제공 된 방법론은 조직 영역에서 단일 셀에도 젖 산 효소 활동에 정보를 제공할 수 있습니다.
현장에서 활동 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 젖 산 효소의 활동은 마우스 피부20의 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 높은 발견. 우리 또한 사용 방법이 경작된 한 배아 줄기 세포에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 활동은 피더 계층 보다는 줄기 세포에서 발견. 마지막으로, 우리는 신선한 마우스 대동맥에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 부드러운 근육 세포에 얼룩이 관찰. 우리 여기 냉동된 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

공간과 시간에 효소 활동을 매핑 하는 것이 정상 조직과 질병에서 셀 동작의 분자 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다. 신진 대사 활동 분석 실험 현장에 는 조직 내에서 신진 대사 활동의 공간적 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기 조직 샘플에서 직접 효소 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젖 산 효소 포도 당 소비 호 기성 또는 혐 기성 해당 분해를 통해 에너지로 변환 하는 것입니다 여부의 중요 한 결정 이다. 젖 고 나드를 포함 하는 솔루션은 냉동된 조직 섹션에 제공 됩니다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) NADH를 검출 될 수 있다 양성자의 감소에 따라 제공 하는 동시에 변환 하는 동안 높은 젖 산 효소 활동에 포함 된 셀 pyruvate에 제공 된 젖 산을 변환 됩니다. nitrotetrazolium 블루 침전으로 시각화 formazan 블루. 우리는 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 젖 산 효소 활동은 높은 무부하 머리 여 포 줄기 세포는 피부 내에 발견. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 보다 배양된 미 발달 줄기 세포에서 높은 얼룩 공개 교양된 마우스 배아 줄기 세포를 적용 하는 프로토콜. 갓 절연된 마우스 대동맥의 분석 계시 수직 대동맥 평활 근 세포에 얼룩. 제공 하는 방법론 공간적으로 냉동 또는 신선한 조직에 양성자를 생성 하는 효소의 활동을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 이전 제자리에 활동 분석 실험 마우스 피부20에 대 한 결과 보고 있다. 그림 3에서 같이, 우리는 절차는 위에서 설명한 때 머리 여 포의 기지에서 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 젖 산 효소 활동의 높은 수준을 다음 관찰. 이러한 결과 형광 활성화 된 세포 피부의 머리 여 포 줄기 세포에 대 한 정렬 및 정렬된 셀에 활동 ?...

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

연구

생화학

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

쥐 췌장 조직의 신속하고 비용 효율적인 RNA 추출

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...