Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

HAC var Milton E. Cassel forskeren Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd til HAC fra National Institute av generelle medisinske fakultet R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute of generelle medisinske fakultet R01 GM0866465, Eli og Edythe bredt Center for regenerativ medisin og stamcelleforskning ( Rose og Hal Gaba awards), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, leukemi Lymphoma Society, innvirkning priser fra Jonsson Comprehensive Cancer Center WEL og HAC. Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute av National Institutes of Health under prisen nummer P50CA092131. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. HAC er medlem av Eli & Edythe bred Center for regenerativ medisin & stamcelleforskning, UCLA Molecular Biology Institutt og UCLA bioinformatikk interdepartemental programmet.

Alle eksperimenter beskrevet ble godkjent av dyr omsorg komiteen ved University of California, Los Angeles.
1. Generer lysbilder frosne mus hud
<ol><li>Euthanize mus i henhold til institusjonen personvern. Merk: Følg institusjonelle politikk for verneklær. Alle protokoller som involverer dyr må godkjennes av institusjonelle dyr omsorg komiteen.</li>
	<li>Fjerne musen er håret med en dyr hår trimmer.</li>
	<li>Lage snitt i huden med saks. Ved hjelp av pinsett, løft huden fra musen. M...

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Metoden beskrevet her kan brukes til å overvåke aktiviteten til laktat dehydrogenase eller andre metabolsk enzymer som genererer NADH eller NADPH, i ulike celletyper i en vev eller i ulike deler av en vev over tid. Laktat dehydrogenase er et viktig enzym for å forstå biologi stamceller og svulster, og evnen å dataskjerm laktat dehydrogenase aktivitet i enkeltceller er sannsynlig å gi viktig innsikt i funksjonen av dette enzymet.
En viktig fordel av denne protokollen sammenlignet med andr...

Forstå steder i vev som enzymer har høy eller lav aktivitet er avgjørende for forståelse utvikling og fysiologi. Avskrift eller protein brukes ofte som surrogater for enzymatisk aktivitet. Mens slike studier kan være informativ, gir de ikke informasjon som kan være kritiske for å bestemme et enzym aktivitet, som post-translasjonell modifikasjoner, protein komplekser, eller enzymets subcellular lokalisering. Når måles direkte enzymatisk aktivitet, er det ofte overvåket homogenisert protein lysates som ikke inneholder informasjon om individuelle celler i blandingen eller den romlige fordelingen av cellene med høy eller lav aktivitet innenfor en vev.
Vi gir her en detaljert protokoll for å kartlegge den romlige fordelingen av enzymatisk aktivitet innenfor en Vevsprøve. Metodene er basert på tidligere studier viser at tetrazolium salter kan brukes til å lokalisere aktiviteten til dehydrogenases, reductases og oxidases i frossent1. Disse metodene, er en vann-uløselig formazan dannet når protoner overføres til tetrazolium salt2,3. Glukose-6-fosfat dehydrogenase genererer NADPH og et proton, og har blitt oppdaget med tetrazolium aktivitet. Glukose-6-fosfat dehydrogenase har vært overvåket i skrubbe hepatocytter4alveolar type 2 cellene av lungene5 og nephrons nyre5. Tetrazolium salter har også blitt brukt til å overvåke transketolase aktivitet i frossent6. En lignende fremgangsmåte ble nylig brukt til å overvåke aktiviteten til flere dehydrogenases i samme vev på tilstøtende lysbilder7.
Her beskriver vi en metode for å bruke tetrazolium salter til å overvåke den romlige fordelingen av laktat dehydrogenase aktivitet (figur 1). Laktat dehydrogenase kan konvertere pyruvate Glykolysen til laktat, og motsatt reaksjon. Laktat dehydrogenase aktivitet er dermed en viktig determinant av pyruvate's inngangen til tricarboxylic syre syklusen versus sekresjon som laktat. Laktat nivåer i blodet brukes ofte til å diagnostisere en rekke sykdommer, inkludert kreft8,9,10, fordi det kan signalisere at sykdom eller skade har skadede celler og enzymet er frigitt.
Det er fire laktat dehydrogenase gener: LDHA, LDHB, LDHC og LDHD11. LDHA og LDHB antas å ha oppstått fra duplisering av en tidlig LDHA gene12. LDH er som en tetramer LDHA og LDHB kan danne homotetramers og heterotetramers med hverandre. LDHA er rapportert å ha høyere affinitet for pyruvate, mens LDHB er rapportert å ha høyere affinitet for laktat, og fortrinnsvis konvertere laktat til pyruvate13. LDHA selskapet inneholder bindende områder for HIF1α, cMYC og FOXM1 transkripsjon faktorer11. Dessuten, som mange andre glycolytic enzymer14,15, kan LDH endres av post-translasjonell modifikasjoner. Fibroblast vekstfaktor reseptor 1 kan phosphorylate LDHA Y10, som fremmer tetramer formasjon, eller Y83, som fremmer NADH substrat bindende16. LDHA kan også være acetylated17. For disse grunner krever en fullstendig forståelse av LDH aktivitet overvåking ikke bare LDH protein nivå, men det enzym aktivitet også.
I tillegg til metoden vi presenterer her har andre tilnærminger brukt til å overvåke laktat dehydrogenase aktivitet. Laktat dehydrogenase aktivitet kan overvåkes spektrofotometrisk homogenisert protein lysate. Generering av NADH som laktat konverteres til pyruvate kan bli målt basert på absorbans ved 340 nm, mens forsvinningen av NADH kan bli overvåket som pyruvate konverteres til laktat18. Laktat dehydrogenase aktivitet har også vært overvåket med magnetisk resonans imaging (MRI). 13 C-pyruvate kan administrere og konverteringen av pyruvate til laktat kan bli overvåket som forholdet mellom [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate. Forhøyet prosenter av [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate har blitt observert i kreft tissue19. Mens Mr tilnærminger kan gi informasjon om laktat dehydrogenase aktivitet i normal og sykdom vev, har ikke metodikkene oppløsningen måtte bestemme aktivitetsnivået i bestemte celler. Metodene som er gitt her kan gi informasjon om laktat dehydrogenase aktivitet i vev områder og selv i enkeltceller.
Bruker i situ aktivitet analyser, fant vi at aktiviteten til laktat dehydrogenase er høy i hårsekken stamceller musen hud20. Vi brukte også metoden å overvåke aktiviteten til laktat dehydrogenase i kulturperler embryonale stamceller og fant aktiviteten er høyere i stamceller enn mater laget. Endelig vi overvåket aktiviteten til laktat dehydrogenase i frisk musen aorta og observert farging i glatte muskelcellene. Her beskriver vi en detaljert protokoll for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet i frosne mus huden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Kartlegging enzymatiske aktiviteten i rom og tid er avgjørende for å forstå molekylær grunnlaget for cellen atferd i normalt vev og sykdom. In situ metabolsk aktivitet analyser kan gi informasjon om den romlige fordelingen av metabolsk aktivitet innenfor en vev. Vi gir her en detaljert protokoll for å overvåke aktiviteten til enzym laktat dehydrogenase direkte i vevsprøver. Laktat dehydrogenase er en viktig determinant av om brukte glukose konverteres til energi via aerob / anaerob trening Glykolysen. En løsning som inneholder laktat og NAD gis til en frossent seksjonen. Celler med høy laktat dehydrogenase aktivitet vil konvertere den angitte laktat til pyruvate, mens samtidig konvertere gitt nikotinamid adenine dinucleotide (NAD) NADH og et proton, som kan oppdages basert på reduksjon av nitrotetrazolium blå til formazan, som er visualisert som en blå utløse. Vi beskriver en detaljert protokoll for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet i musen huden. Bruk denne protokollen, fant vi at laktat dehydrogenase aktivitet er høy i quiescent hårsekken stamceller innenfor huden. Bruke protokollen kulturperler mus embryonale stamceller viste høyere farging i kulturperler embryonale stamceller enn mus embryonale fibroblaster. Analyse av fersk isolert musen aorta avdekket farging i glatte muskelcellene vinkelrett aorta. Metodikken gitt kan brukes til romlig aktiviteten av enzymer som genererer et proton i frosne eller friske vevet.

Vi har tidligere rapportert resultater for i situ aktivitet analyser i musen hud20. Som vist i Figur 3, observerte vi høye nivåer av laktat dehydrogenase aktivitet i hårsekken stamceller ved foten av hårsekken når fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble fulgt. Disse funn ble bekreftet av fluorescens aktivert cellen sortering av huden for hårsekken stamceller og bekrefter høy laktat dehydrogenase aktivitet i stamcelleforsk...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kartlegging metabolisme: Overvåking laktat Dehydrogenase aktivitet direkte i vev

Vi beskriver en protokoll som tilordner den romlige fordelingen av enzymatisk aktivitet for enzymer som genererer nicotinatmide adenine dinucleotide fosfat (NAD(P)H) + H + direkte i vevsprøver.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode for å måle metabolismen i sortert subpopulasjoner av komplekse Cell Communities Bruke stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

I Vitro analysen å oppdage tRNA-Isopentenyl Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rask og kostnadseffektiv RNA-ekstraksjon av rottepanasittvev

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...