Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

HAC var Milton E. Cassel lärd av Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Detta arbete finansierades genom bidrag till HAC från nationella institutet av allmänna medicinska vetenskaper R01 GM081686, R01 AR070245, nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper R01 GM0866465, Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & forskning på stamceller ( Rose Hills och Hal Gaba awards), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, föreningen leukemi lymfom, inverkan utmärkelser från Jonsson omfattande Cancer Center WEL och HAC. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. HAC är medlem av Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & forskning på stamceller, UCLA molekylärbiologi Institutet och UCLA bioinformatik enhetsövergripande programmet.

Alla experiment beskrivs godkändes av djur hand kommitté vid University of California, Los Angeles.
1. generera diabilder av frysta mus hud
<ol><li>Euthanize möss i enlighet med institutionens policy. Obs: Följ institutionella politiken för skyddskläder. Alla protokoll som involverar djur måste godkännas av djur hand utskottet för institutionella.</li>
	<li>Ta bort musens hår med en djurhår trimmer.</li>
	<li>Gör snitt i huden med hjälp av sax. Med pincett, lyfta huden från ...

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).</li><li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects.">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li><li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues.">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells.">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments.">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer:+A+systematic+review+with+meta-analysis.">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li><li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies.">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li><li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A:+Therapeutic+potential+in+brain+tumor.">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li><li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+gene:+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure,+function+and+regulation.">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li><li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase.">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li><li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation.">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li><li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism.">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH/NAD(+)+redox+homeostasis+in+cancer+cells.">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer.">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li><li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

Den metod som beskrivs här kan användas för att övervaka aktiviteten av laktatdehydrogenas eller andra metabola enzymer som genererar NADH eller NADPH, i olika celltyper i en vävnad eller inom olika delar av en vävnad över tid. Laktat dehydrogenas är ett enzym som är viktigt för att förstå biologin av stamceller och tumörer, och förmågan att följa laktatdehydrogenas i enskilda celler är sannolikt att ge viktiga insikter i funktionen av detta enzym.
En viktig fördel med detta ...

Förstå platser inom vävnader där enzymer har hög eller låg aktivitet är viktigt för förståelse utveckling och fysiologi. Avskrift eller protein nivåer används ofta som substitut för enzymatisk aktivitet. Sådana studier kan vara informativ, ger de inte information som kan vara avgörande för att fastställa ett enzym aktivitet, till exempel post-translationella modifieringar, förekomsten av proteinkomplex eller enzymets subcellulär lokalisering. När enzymaktiviteten mäts direkt, är det ofta övervakas i homogeniserad protein lysates som inte längre innehåller information om enskilda celler inom blandningen eller rumslig distribution av cellerna med hög eller låg aktivitet i en vävnad.
Vi erbjuder här ett detaljerat protokoll för att kartlägga den rumsliga fördelningen av enzymatisk aktivitet inom ett vävnadsprov. Metodiken bygger på tidigare studier som visar att tetrazolium salter kan användas för att lokalisera verksamhet mellan östradiol och östron, reductases och oxidases i fryst vävnad1. Med dessa metoder bildas en olöslig formazan när protoner överförs till en tetrazolium salt2,3. Glukos-6-fosfatdehydrogenas genererar NADPH och en proton, och har upptäckts med tetrazolium aktivitet. Glukos-6-fosfatdehydrogenas har övervakats i Europeiska skrubbskädda hepatocyter4, i alveolära typ 2 celler av lungorna5 och nefron av njure5. Tetrazolium salter har också använts för att övervaka transketolase aktivitet i fryst vävnad6. Ett liknande tillvägagångssätt användes nyligen till att övervaka aktiviteten hos flera mellan östradiol och östron i samma vävnaden på intilliggande bilder7.
Här beskriver vi en metod för att använda tetrazolium salter för att övervaka den rumsliga fördelningen av laktatdehydrogenas aktivitet (figur 1). Laktatdehydrogenas kan konvertera pyruvat som genereras av glykolys till laktat och omvända reaktionen. Laktatdehydrogenas aktivitet är följaktligen en viktig determinant av pyruvats hänrycka in i cykelns tricarboxylic syra kontra dess utsöndring som laktat. Laktat nivåer i blodet är ofta används för att diagnostisera ett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer8,9,10, eftersom det kan signalera att sjukdom eller skada har skadade celler och enzymet har släppts.
Det finns fyra laktatdehydrogenas gener: LDHA, LDHB, LDHC och LDHD11. LDHA och LDHB tros ha uppstått från dubblering av en tidig LDHA gen12. LDH är aktivet som en tetramer och LDHA och LDHB kan bilda homotetramers och heterotetramers med varandra. LDHA rapporteras ha högre affinitet för pyruvat, medan LDHB rapporteras ha högre affinitet för laktat, och prioriterat konvertera laktat till Pyruvat13. LDHA arrangören innehåller bindande platser för HIF1α, cMYC och FOXM1 transkription faktorer11. Dessutom, liksom många andra glycolytic enzymer14,15, kan LDH ändras av post-translationella modifieringar. Fibroblast tillväxtfaktor receptor 1 kan fosforylera LDHA på Y10, som främjar tetramer bildandet, eller Y83, som främjar NADH substrat bindande16. LDHA kan också vara acetylerade17. Av dessa anledningar kräver en fullständig förståelse av LDH aktivitet övervakning inte bara LDH proteinnivåer, men det enzymaktivitet samt.
Förutom den metod som vi presenterar här, har andra metoder använts för att övervaka laktatdehydrogenas aktivitet. Laktatdehydrogenas aktivitet kan övervakas spektrofotometriskt homogeniserad protein lysate. Generering av NADH som laktat omvandlas till Pyruvat kan mätas utifrån absorbansen vid 340 nm, medan försvinnandet av NADH kan övervakas eftersom pyruvat omvandlas till laktat18. Laktatdehydrogenas aktivitet har också följts med magnetisk resonanstomografi (MRT). 13 C-pyruvat kan administreras och omvandlingen av pyruvat till laktat kan övervakas som förhållandet mellan [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat. Förhöjda nyckeltal [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvat har observerats i cancer vävnad19. Medan MRI-baserade metoder kan ge information om laktatdehydrogenas aktivitet i normal och sjukdom vävnader, har metoder som inte den upplösning som behövs för att avgöra aktivitetsnivån i specifika celler. Den metod som anges här kan ge information om laktatdehydrogenas aktivitet i vävnad områden och även i enstaka celler.
Med i situ aktivitet analyser upptäckte vi att aktiviteten av laktatdehydrogenas är hög i hårsäcken stamcellerna mus hud20. Vi har också använt metoden att övervaka aktiviteten av laktatdehydrogenas i odlade embryonala stamceller och hittade aktiviteten är högre i stamcellerna än feeder lagret. Slutligen, vi övervakas aktiviteten av laktatdehydrogenas i färska musen aorta och observerade färgning i glatta muskelceller. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet i frysta mus hud.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

Mappning av enzymaktivitet i tid och rum är avgörande för att förstå den molekylära basen för cell beteende i normal vävnad och sjukdom. In situ metabolisk aktivitet analyser kan ge information om den geografiska fördelningen av metabolisk aktivitet i en vävnad. Vi ger här ett detaljerat protokoll för att övervaka aktiviteten hos enzymet laktat dehydrogenas direkt i vävnadsprover. Laktatdehydrogenas är en viktig faktor för om förbrukade glukos omvandlas till energi via aerob eller anaerob glykolys. En lösning som innehåller laktat och NAD tillhandahålls ett fryst vävnad avsnitt. Celler med hög laktatdehydrogenas aktivitet kommer att konvertera den medföljande laktat till Pyruvat, medan samtidigt konvertera som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) till NADH och en proton, vilket kan upptäckas baserat på minskning av nitrotetrazolium blå till formazan, som visualiseras som en blå fällning. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet i mus hud. Tillämpning av detta protokoll, hittade vi att laktatdehydrogenas aktivitet är hög i quiescent hårsäcken stamcellerna i huden. Tillämpa protokollet till odlade mus embryonala stamceller visade högre färgning i odlade embryonala stamceller än mus embryonala fibroblaster. Analysen av nymalen isolerade mus aorta visade färgning i glatta muskelceller vinkelrätt mot aorta. Den metod som kan användas till rumsligt karta aktiviteten av enzymer som genererar en proton i fryst eller färsk vävnad.

Vi har tidigare rapporterat resultat för i situ aktivitet analyser i mus hud20. I figur 3visas vi observerat höga nivåer av laktatdehydrogenas aktivitet i hårsäcken stamcellerna vid basen av hårsäcken när förfarandena ovan följdes. Dessa fynd var styrks av fluorescens aktiverad cell sortering av huden för hårsäcken stamceller och bekräftar högt laktatdehydrogenas aktivitet i stamceller kupén med aktivitet analy...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue at JoVE.com

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kartläggning Metabolism: Övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet direkt i vävnad

Vi beskriver ett protokoll för att kartlägga den rumsliga fördelningen av enzymatisk aktivitet för enzymer som genererar nicotinatmide adenin-dinukleotidfosfat (NAD(P)H) + H + direkt i vävnadsprover.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metod för att mäta Metabolism i Sorterade subpopulationer av komplexa cell gemenskapernas Använda stabila isotopen Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindande enheter (SUBEs) som verktyg för berikning, isolering, identifiering och karakterisering av SUMO Proteome i lever cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snabb och kostnadseffektiv RNA-utvinning av råtta bukspottskörteln vävnad

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...