Name: optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

ونحن ممتنون للجهات المانحة وأسرهم الذين جعلوا هذا العمل ممكناً. ونقدر أيضا بمساعدة الموظفين في المعهد الدولي للطب والخدمات تينيسي الجهات المانحة للمساعدة في تنسيق مجموعة من الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة. وأيد هذا العمل المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة"، المعاهد الوطنية للصحة OT2-OD023850 لدعم الإدارة البيئية2 وراتب من المعاهد الوطنية للصحة T32-DK007673 إلى أمز. ونحن ممتنون للموظفين من "الموارد المشتركة علم الأمراض المتعدية فاندربيلت" للوصول إلى صك LCM وإسداء المشورة بشأن إعداد الأنسجة. علم أمراض الأنسجة فاندربيلت الموارد المشتركة معتمد جزئيا من المعاهد الوطنية للصحة منح P30-CA068485-14 و U24-DK059637-13. ونشكر مركز الوصول إلى تكنولوجيا الجينوم في قسم علم الوراثة في "كلية الطب في جامعة واشنطن" للمساعدة في تحليل الجينوم. غتاك معتمد جزئيا بالسرطان NCI مركز دعم المنح #P30 CA91842 إلى مركز السرطان Siteman وتكنولوجيات المعلومات والاتصالات/كتسا #UL1TR002345 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (نكر)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، والمعاهد الوطنية للصحة خارطة الطريق للأبحاث الطبية. هذا المنشور هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الرأي الرسمي لنكر أو المعاهد الوطنية للصحة.

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المذكورة هنا فاندربيلت الجامعي المؤسسي استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين).
1-إعداد قبل وصول الأنسجة
<ol><li>الحصول على موافقة الاتحاد الدولي للرجبى السليم والتنسيق مع وكالات التبرع بالأعضاء البشرية للحصول على أنسجة الأمعاء مستأصل حديث...

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5, 9226 (2015).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).</li><li>Bottner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+as+a+new+tool+to+investigate+site-specific+gene+expression+in+enteric+ganglia+of+the+human+intestine.">Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine.</a> Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Hetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+gene+expression+analysis+in+enteric+ganglia+of+human+colon+after+laser+microdissection.">Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection.</a> Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).</li><li>. PALM Protocols - RNA handling Available from: <a target="_blank" href="https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf">https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf</a> (2011)</li><li>. Workflows &amp; Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/">https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/</a> (2015)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arcturus+HistoGene+Frozen+Section+Staining+Kit:+User+Guide.">Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide.</a> Biosystems, A. , (2010).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+cost-effective+and+flexible+method+for+processing+of+snap-frozen+tissue+to+prepare+large+amounts+of+intact+RNA+using+laser+microdissection.">A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection.</a> Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).</li><li>Heumuller-Klug, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+intestinal+mRNA:+a+matter+of+treatment.">Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment.</a> World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+degraded+RNA+addressed+by+3'+tag+counting.">Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting.</a> PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).</li><li>Potter, S. S., Brunskill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture.">Laser capture.</a> Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).</li><li>Funke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+intestinal+epithelial+cells+and+downstream+analysis.">Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).</li><li>Kolijn, K., van Leenders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+extraction+kits+and+histological+stains+for+laser+capture+microdissected+prostate+tissue.">Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue.</a> BMC Res Notes. 9, 17 (2016).</li><li>Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+RNA+from+single+cell+populations+in+human+postmortem+brain+tissue.">Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li><li>Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINCERA:+A+Pipeline+for+Single-Cell+RNA-Seq+Profiling+Analysis.">SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.</a> PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li></ol>

يتيح هذا الإجراء كفاءة جمع ganglia المعوية عديدة كمصدر استخلاص الحمض النووي الريبي لما يليها الحمض النووي الريبي هنا، نحن قد تسارعت العمليات الواردة في البروتوكولات القائمة مع أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كما كافة الخطوات في هذا الإجراء مترابطة، من المهم أن القضاء على كافة الق...

ويهدف هذا الأسلوب للحصول على عينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة من ganglia المعوي من الأنسجة المعوية البشرية باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). البروتوكول هو موضح هنا تم الأمثل لتقديم نوعية الجيش الملكي النيبالي وغلة كافية للحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) والمقصود ليتم استخدامها مع الأنسجة المعوية البشرية مستأصل حديثا، غير المثبتة، مجمدة في فلاش.
اضطرابات حركية الجهاز الهضمي والأمعاء الوظيفية يؤثر على واحد من كل أربعة أشخاص في الولايات المتحدة. النظام العصبي المعوي (ENS)، كما يشار إلى الدماغ الثاني1، غالباً في وسط هذه الاضطرابات، كما أنها تلعب دوراً حاسما في التوازن القناة الهضمية وحركية. عموما قيدت التلاعب بحركية القناة الهضمية للاستئصال الجراحي للأنسجة أجانجليونيك/نونكونتراكتيلي، وتعديل النظام الغذائي المزمن، و/أو الأدوية. من المستغرب، يظل الترنسكربيتوم الكامل من ENS الكبار تكون متسلسلة، يحد كثيرا من قدرتنا على تحديد الجزيئات داخل ENS يمكن استهداف فارماسيوتيكالي أو تستخدم في علاجات الخلايا الجذعية.
هناك طرق قليلة نسبيا لعزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوية البشرية. يتطلب النهج الأول، تفكك الخلية2، حضانة ارتفاع درجات الحرارة وأوقات طويلة الحضانة؛ على حد سواء التي من المعروف أن تعزز تدهور الجيش الملكي النيبالي، ويغير2،الترنسكربيتوم3. نهج بديل، LCM، أكثر موثوقية يحافظ الترنسكربيتوم ويحمي سلامة الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت LCM لجمع ganglia من الأنسجة المعوية البشرية مجمدة طازجة4،،من56، هذه النهج يعوقها أما ضعف كمية ونوعية الجيش الملكي النيبالي، وكانت ذات العمالة الكثيفة جداً، أو تحتاج إلى تعديل لتلطيخ أو تقنيات استخراج الحمض النووي الريبي للعمل في أيدينا. بروتوكولات LCM أخرى مصممة للحفاظ على الحمض النووي الريبي التي تم العثور عليها في المنتج LCM أدلة قدمت تحسينات إضافية7،8، ولكن التكيف الضروري عند تطبيقه على عزل ganglia المعوي8، 9-ولهذه الأسباب، قمنا بتطوير بروتوكول أمثل استناداً إلى هذه الموارد أن ينتج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية البشرية، وسير عمل سريع نسبيا، وتنتج نتائج متسقة عبر كبيرة عدد العينات.
في هذه الدراسة، نقدم موجزاً لإجراءات محسنة تسهل عزل الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوي مصدرها الأنسجة المعوية البشرية مستأصل. لدينا أسلوب يتضمن خمسة جوانب هامة. ينبغي أن يتم اقتطاعها عينات الأمعاء البشرية الأولى، مستأصل حديثا، غير المثبتة للحجم، وجميع الرطوبة الزائدة إزالة مع أنسجة مختبرية وسويت بالأرض في قالب قاعدة كبيرة قبل تجميد فلاش قمة الطين من الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني (2 ميغا بايت). وينبغي إعداد المقاطع النسجية، والثانية من الأمعاء للحصول على الطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك على شريحة، الذي يقدم حمولة كبيرة من ganglia المعوي. نجاح هذه الخطوة تعتمد إلى حد كبير على عملية إعداد الأنسجة. ثالثا، يتطلب هيكل نونونيفورم ganglia في ENS استخدام البولي إثيلين نابثالاتي (القلم) غشاء الشرائح6، التي توفر أكبر قدر من السرعة والدقة أثناء عملية LCM. ينبغي استخدام الأصباغ الرابعة، المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء تلطيخ ganglia المعوي. آخر، عملية استخراج الحمض النووي الريبي حاسمة بالنسبة لنتيجة ناجحة مع ما يليها الحمض النووي الريبي سعينا لنهج استخراج الحمض النووي الريبي التي تنتج نزاهة الجيش الملكي النيبالي عالية ويزيد الغلة الحمض النووي الريبي عند بدء التشغيل مع مجموعات صغيرة من ganglia المعوي ويزيل التلوث بالحمض النووي ويحتفظ العديد من الحمض النووي الريبي الأنواع ممكن.
أخذت معا، الاستفادة المثلى من هذه العوامل في هذه الدراسة إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي كمية ونوعية. وكانت النتائج متسقة إلى حد كبير بين مجموعة كبيرة من العينات، مما يشير إلى اتساق هذا النهج. علاوة على ذلك، فقد استخدمنا هذه النهج بالتسلسل بنجاح عشرات من عينات الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي. يمكن أيضا تكييف الاستراتيجيات التي أبرزت هنا لأداء LCM للعقد المطلوب أو نويات الطرفية والجهاز العصبي المركزي والحالات الأخرى التي تتطلب عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة على نطاق واسع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:920px;" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">10% Neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-mL conical tubes, polypropylene&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Base molds 37x24x5mm, disposable</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>5025511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Belzer UW&#160; Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CapSure Macro LCM caps</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cling Wrap, Press&#8217;n Seal&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Glad&#160;&#160;</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC405760025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting Board</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 190-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gloves, extended cuff</td>
			<td>Microflex&#160;</td>
			<td>19010144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gowns, surgical-disposable</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>19-088-2116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>1335920B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (large)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (small)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica Cryostat Chuck, large,&#160; 40 mm&#160;</td>
			<td>Southeast Pathology Instrument Service</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (20X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &#8734;/0.17</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (10X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &#8734;/-</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Sieves</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC197255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PicoPure RNA extraction kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Kontes</td>
			<td>4621973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEN membrane LCM slides</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZAP&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma-R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;A&#34; (PicoPure)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;B&#34; (RNeasy&#160; Micro kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Method &#34;C&#34; (TRIzol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;D&#34; (RNeasy PLUS Mini kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Splash Shield, disposable faceshield</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors, Surgical, 14.5 cm &#34;sharp-sharp&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe filter, cellulose acetate (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>190-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td>General Data Healthcare</td>
			<td>TFM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue

والغرض من هذا الأسلوب الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية التي جمعت من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). وقد حددنا خمس خطوات في سير العمل التي لا بد منها للحصول على عزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي مع كمية ونوعية عالية بما فيه الكفاية لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، عند إعداد الأنسجة المعوية، يجب أن يكون كل عينة السائل الزائد كل إزالة بواسطة النشاف قبل التسوية serosa قدر الإمكان عبر الجزء السفلي من قوالب قاعدة كبيرة. العينات ثم تجمد بسرعة فوق ملاط الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني. وثانيا، عند تقطيع الأنسجة، من المهم أن موضع كريومولدس حتى الأجزاء المعوية موازية للطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك، مما تسفر عن مساحة أكبر من ganglia المعوي كل شريحة. الثالثة، خلال LCM، البولي إثيلين نابثالاتي (القلم)-عرض الشرائح غشاء أكبر قدر من السرعة والمرونة في تحديد الأشكال غير موحدة من ganglia المعوي عند جمع ganglia المعوي. رابعا، للتصور متميزة من ganglia المعوية داخل الأقسام، نقدم الأصباغ المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، ممتازة الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي بالنسبة للأصباغ المائية. أخيرا، لاستخراج الحمض النووي الريبي من العقد تم التقاطها، لاحظنا الفروق بين مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية التي أسفرت عن تفوق الجيش الملكي النيبالي الكمية والنوعية، والقضاء على التلوث بالحمض النووي. الأمثل لهذه العوامل في البروتوكول الحالي إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي النوعية والكمية.

ونحن قد أدخلت عدة تحسينات على البروتوكولات القائمة التي تمكن من جمع السريع نسبيا من ganglia المعوي من عينات الأمعاء البشرية باستخدام LCM، الوفاء بالمعايير لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، نحن الأمثل التجميد السريع لشرائح الأنسجة المعوية في قوالب قاعدة كبيرة وضعت على سط?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية المعزولة من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). ويشمل هذا البروتوكول إعداد فلاش تجميد عينات من الأنسجة المعوية البشرية، كريوسيكتيونينج، وتلطيخ ethanolic والجفاف، LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

القبض على الليزر Microdissection ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

الخلايا العصبية الشمية التي يتم الحصول عليها من خلال الأنف خزعة جنبا إلى جنب مع الليزر والتقاط تسليخ مجهري: نهج المحتملين لدراسة الاستجابة للعلاج في اضطرابات العقلية

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...