Name: optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה על התורמים ובני משפחותיהם אשר אפשרו את העבודה הזאת אנחנו מעריכים גם הסיוע של צוות המכון הבינלאומי לרפואה, טנסי סיפורים אישיים שעזרת אוסף קואורדינטות של רקמות השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים, NIH OT2-OD023850 לתמיכה2 וקצבה EMS של NIH T32-DK007673 כדי AMZ. אנחנו מודים לצוות של משאב משותף פתולוגיה ואנדרבילט Translational גישה לכלי LCM, ייעוץ על הכנת הרקמה. ואנדרבילט רקמות פתולוגיה משותפים המשאב נתמך בחלקה על ידי NIH מענקים P30-CA068485-14 ו- U24-DK059637-13. אנו מודים המרכז גישה הגנום טכנולוגיה במחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על העזרה עם אנליזה גנומית. GTAC היא נתמכת באופן חלקי על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט #P30 CA91842 כדי Siteman מרכז הסרטן ועל ידי ICTS/CTSA #UL1TR002345 מענק של המרכז הארצי עבור מחקר משאבים (NCRR), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), וכן NIH מפת הדרכים למחקר רפואי. פרסום זה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את התצוגה הרשמי של NCRR או NIH.

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן אושרו על ידי ואנדרבילט אוניברסיטת מוסדיים סקירה לוח (IRB).
1. הכנה לפני ההגעה רקמות
<ol><li>לקבל אישור IRB נאות ולתאם עם סוכנויות תרומת איבר אנושי כדי לקבל את רקמות מעיים resected טריים, מבולבל מתורמים אשר עונות על הקריטריונים מחקר כל הנדרש לצורך המחקר. הע...

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5, 9226 (2015).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).</li><li>Bottner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+as+a+new+tool+to+investigate+site-specific+gene+expression+in+enteric+ganglia+of+the+human+intestine.">Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine.</a> Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Hetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+gene+expression+analysis+in+enteric+ganglia+of+human+colon+after+laser+microdissection.">Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection.</a> Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).</li><li>. PALM Protocols - RNA handling Available from: <a target="_blank" href="https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf">https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf</a> (2011)</li><li>. Workflows &amp; Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/">https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/</a> (2015)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arcturus+HistoGene+Frozen+Section+Staining+Kit:+User+Guide.">Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide.</a> Biosystems, A. , (2010).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+cost-effective+and+flexible+method+for+processing+of+snap-frozen+tissue+to+prepare+large+amounts+of+intact+RNA+using+laser+microdissection.">A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection.</a> Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).</li><li>Heumuller-Klug, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+intestinal+mRNA:+a+matter+of+treatment.">Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment.</a> World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+degraded+RNA+addressed+by+3'+tag+counting.">Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting.</a> PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).</li><li>Potter, S. S., Brunskill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture.">Laser capture.</a> Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).</li><li>Funke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+intestinal+epithelial+cells+and+downstream+analysis.">Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).</li><li>Kolijn, K., van Leenders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+extraction+kits+and+histological+stains+for+laser+capture+microdissected+prostate+tissue.">Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue.</a> BMC Res Notes. 9, 17 (2016).</li><li>Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+RNA+from+single+cell+populations+in+human+postmortem+brain+tissue.">Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li><li>Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINCERA:+A+Pipeline+for+Single-Cell+RNA-Seq+Profiling+Analysis.">SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.</a> PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li></ol>

הליך זה מאפשר את האוסף יעיל של הגרעינים המעית רבים כמקור להפקת RNA עבור ה-RNA-תת סעיף. כאן, אנחנו האיץ את התהליכים המתוארים הפרוטוקולים הקיימים תוך שמירה מקסימאלית RNA שלמות. כמו כל השלבים בהליך זה תלויות זו בזו, זה חשוב כי כל הבעיות ניתן לסלק מן תחילת המחקר, כי כל דוגמאות מוכנות באופן דומה כמו אח...

שיטה זו נועדה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה של הגרעינים המעית של רקמה אנושית מעיים באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לספק מספיק תשואות ואיכות RNA RNA רצף (RNA-seq) והוא נועד לשמש עם רקמת המעי האנושי resected טריים, מבולבל, קפואה.
הפרעות תנועתיות מערכת העיכול, במעיים פונקציונלי להשפיע על אחד של כל ארבעה אנשים בארצות הברית. מערכת העצבים המעית (ENS), המכונה גם השני המוח1, לעתים קרובות במרכז בהפרעות אלה, כפי שהיא משחקת תפקיד מכריע בטן הומאוסטזיס, תנועתיות. מניפולציה של תנועתיות המעיים הוגבלה כלל כריתה כירורגית לרקמות aganglionic/noncontractile, שינוי תזונה כרונית ו/או תרופות. באופן מפתיע, transcriptome המלא של התרנגולות למבוגרים נשאר היה לסדרם, במידה רבה הגבלת היכולת שלנו לזהות מולקולות בתוך התרנגולות ניתן לפלח הם או מנוצל טיפולים תאי גזע.
ישנן שיטות מעטים יחסית לבידוד RNA מן הגרעינים המעית אנושי. הגישה הראשונה, דיסוציאציה תא2, דורש טמפרטורות גבוהות דגירה דגירה ארוך פעמים; שניהם אשר ידועים לקדם השפלה RNA ולשנות את2,transcriptome3. גישה חלופית, הפונקציה LCM, יותר אמין משמר את transcriptome ומגן RNA שלמות. אף על פי מספר מחקרים השתמשו LCM כדי לאסוף את הגרעינים מוקפאות רקמת המעי האנושי4,5,6, גישות אלה היו גם הקשו על ידי RNA איכות וכמות המסכן, היו די עתירי עבודה, או צריך שינוי של להכתים או RNA מיצוי טכניקות לעבודה בידיים שלנו. LCM פרוטוקולים אחרים המיועדים לשימור RNA שנמצאו במוצר LCM מדריכים מספק שיפורים נוספים7,8, אבל הסתגלות שהיה נחוץ כאשר חל על הבידוד של הגרעינים המעית8, 9. מסיבות אלו, פיתחנו פרוטוקול ממוטבת בהתבסס על משאבים אלה מניב כמויות ניכרות של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית האנושי, יש זרימת עבודה מהיר יחסית, ולא מייצר תוצאות עקביות לרוחב גדול מספר דוגמאות.
במחקר זה, אנו מציגים תקציר של תהליכי אופטימיזציה המאפשרים את הבידוד של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית הטרייה resected. מרקמות מעיים. השיטה שלנו משלבת חמישה היבטים חשובים. הראשון, resected טריים, מבולבל דגימות מעיים אנושיים צריך חיתוך לפי מידה, יש לחות עודפת כל מוסרים עם טישו מעבדה, משוטחים על תבנית הבסיס גדול לפני פלאש-ההקפאה על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane (2 MB). שנית, היסטולוגית מקטעים של המעי צריכים להיות מוכנים לקבל את המטוס מלא של מקלעת myenteric בשקופית, אשר מציעה מטען רב של הגרעינים המעית. ההצלחה עם שלב זה היא תלויה במידה רבה על תהליך הכנת הרקמה. שלישית, המבנה לא אחידה של גרעיני ב התרנגולות מחייב שימוש פוליאתילן napthalate (עט) ממברנה שקופיות6, אשר מציעים את מהירות ודיוק הגדול ביותר במהלך תהליך LCM. צבעי הרביעי, אתנול תואמת, כגון Cresyl, ויולט, אמור לשמש כדי לשמר את שלמות RNA בזמן צביעת המעית הגרעינים. . האחרון, תהליך החילוץ RNA הוא קריטי עבור תוצאות מוצלחות עם ה-RNA-תת סעיף. חיפשנו גישה החילוץ RNA אשר מייצרת שלמות RNA גבוה, הגדלת התשואות RNA כאשר החל אוספים קטנים של הגרעינים המעית, מבטלת את ה-DNA זיהום ו שומר על מינים RNA רבים ככל האפשר.
יחדיו, אופטימיזציה של גורמים אלה במחקר הנוכחי במידה רבה מאיץ את זרימת העבודה ותשואות דגימות של הגרעינים המעית עם דופן RNA בכמות ובאיכות. התוצאות היו עקביות במידה רבה בקרב קבוצה גדול למדי של דגימות, המציין את העקביות של גישה זו. יתר על כן, השתמשנו גישות אלה כדי בהצלחה רצף של RNA דגימות מן הגרעינים המעית עשרות. האסטרטגיות מודגש כאן ניתן גם בהרחבה להתאים לביצוע LCM של הגרעינים הרצוי או גרעינים של ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית במקרים אחרים הדורשים את הבידוד של RNA באיכות גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:920px;" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">10% Neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-mL conical tubes, polypropylene&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Base molds 37x24x5mm, disposable</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>5025511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Belzer UW&#160; Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CapSure Macro LCM caps</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cling Wrap, Press&#8217;n Seal&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Glad&#160;&#160;</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC405760025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting Board</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 190-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gloves, extended cuff</td>
			<td>Microflex&#160;</td>
			<td>19010144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gowns, surgical-disposable</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>19-088-2116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>1335920B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (large)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (small)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica Cryostat Chuck, large,&#160; 40 mm&#160;</td>
			<td>Southeast Pathology Instrument Service</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (20X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &#8734;/0.17</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (10X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &#8734;/-</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Sieves</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC197255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PicoPure RNA extraction kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Kontes</td>
			<td>4621973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEN membrane LCM slides</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZAP&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma-R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;A&#34; (PicoPure)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;B&#34; (RNeasy&#160; Micro kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Method &#34;C&#34; (TRIzol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;D&#34; (RNeasy PLUS Mini kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Splash Shield, disposable faceshield</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors, Surgical, 14.5 cm &#34;sharp-sharp&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe filter, cellulose acetate (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>190-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td>General Data Healthcare</td>
			<td>TFM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue

מטרת שיטה זו היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית שנאסף מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). זיהינו חמישה שלבים בזרימת העבודה כי הם חיוניים להשגת RNA מבודד מן הגרעינים המעית עם כמות ואיכות גבוהה מספיק בשביל RNA-תת סעיף. ראשית, בעת הכנת רקמת המעי, כל מדגם חייב להיות כל נוזל עודף הוסר על-ידי סופג לפני שיטוח serosa ככל האפשר לרוחב החלק התחתון של תבניות הבסיס גדול. דוגמאות ואז מוקפאים במהירות על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane. שנית, בעת חלוקתה הרקמה, חשוב למקם cryomolds כך מעיים מקטעים מקבילים המטוס מלא של מקלעת myenteric, ובכך מניב את פני השטח הגדול ביותר של הגרעינים המעית לכל שקופית. שלישית, במהלך LCM, napthalate פוליאתילן (עט)-ממברנה שקופיות מציעים את המהירות ואת גמישות חלוקה לרמות את הצורות לא אחידה של הגרעינים המעית בעת איסוף הגרעינים המעית הגדול ביותר. רביעית, להמחשת ברורים של הגרעינים המעית בתוך המקטעים, צבעים התואמים לאתנול, כמו Cresyl, ויולט, מציעים מעולה לשימור RNA תקינות ביחס צבעי מימית. בסופו של דבר, על החילוץ של RNA מן הגרעינים בשבי, נצפו הבדלים בין מסחרי ערכות חילוץ RNA הניב סופריור RNA כמות ואיכות, תוך צמצום זיהום ה-DNA. אופטימיזציה של גורמים אלה בפרוטוקול הנוכחי מאיץ את זרימת העבודה במידה רבה ותשואות הגרעינים המעית דגימות עם איכות יוצאת דופן של RNA וכמות.

אנחנו עשינו מספר שיפורים הפרוטוקולים הקיימים המאפשרים את האוסף מהירה יחסית של הגרעינים המעית מדגימות המעי האנושי באמצעות הפונקציה LCM, עמידה בסטנדרטים ביותר עבור ה-RNA-תת סעיף. ראשית, אנחנו אופטימיזציה ההקפאה המהירה של מקטעי רקמת המעי בתבניות הבסיס גדול להציב בפני השטח של ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...