Name: optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

Siamo grati per i donatori e le loro famiglie che hanno reso possibile questo lavoro. Apprezziamo anche l'assistenza di personale presso l'International Institute of Medicine e Tennessee Servizi per i donatori per aiutare la raccolta delle coordinate del tessuto utilizzato in questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 per supporto di EMS2 e stipendio da NIH T32-DK007673 a AMZ. Siamo grati al personale della Vanderbilt traslazionale patologia ha condiviso risorsa per l'accesso allo strumento di LCM e consigli sulla preparazione dei tessuti. La risorsa ha condiviso la foto di Vanderbilt tessuto patologia è sostenuta in parte da sovvenzioni NIH P30-CA068485-14 e U24-DK059637-13. Ringraziamo il genoma Technology Center di accesso del dipartimento di genetica presso la Washington University School of Medicine per aiuto con analisi genomica. Il GTAC è parzialmente supportato da NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 alla Siteman Cancer Center e da TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 dal centro nazionale per ricerca risorse (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH) e NIH Tabella di marcia per la ricerca medica. Questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale di NCRR o NIH.

Tutti i protocolli descritti qui sono stati approvati dalla Vanderbilt University istituzionale Review Board (IRB).
1. preparazione prima dell'arrivo del tessuto
<ol><li>Ottenere l'approvazione IRB corretto e coordinare con agenzie di donazione di organi umani per ottenere tessuto intestinale appena resecato, slegato da donatori che soddisfano tutti i criteri di ricerca necessari per lo studio. Nota: Questo protocollo può essere adattato per l'uso con topi e altri modelli del roditore.<o...

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5, 9226 (2015).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).</li><li>Bottner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+as+a+new+tool+to+investigate+site-specific+gene+expression+in+enteric+ganglia+of+the+human+intestine.">Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine.</a> Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Hetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+gene+expression+analysis+in+enteric+ganglia+of+human+colon+after+laser+microdissection.">Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection.</a> Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).</li><li>. PALM Protocols - RNA handling Available from: <a target="_blank" href="https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf">https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf</a> (2011)</li><li>. Workflows &amp; Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/">https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/</a> (2015)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arcturus+HistoGene+Frozen+Section+Staining+Kit:+User+Guide.">Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide.</a> Biosystems, A. , (2010).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+cost-effective+and+flexible+method+for+processing+of+snap-frozen+tissue+to+prepare+large+amounts+of+intact+RNA+using+laser+microdissection.">A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection.</a> Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).</li><li>Heumuller-Klug, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+intestinal+mRNA:+a+matter+of+treatment.">Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment.</a> World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+degraded+RNA+addressed+by+3'+tag+counting.">Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting.</a> PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).</li><li>Potter, S. S., Brunskill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture.">Laser capture.</a> Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).</li><li>Funke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+intestinal+epithelial+cells+and+downstream+analysis.">Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).</li><li>Kolijn, K., van Leenders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+extraction+kits+and+histological+stains+for+laser+capture+microdissected+prostate+tissue.">Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue.</a> BMC Res Notes. 9, 17 (2016).</li><li>Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+RNA+from+single+cell+populations+in+human+postmortem+brain+tissue.">Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li><li>Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINCERA:+A+Pipeline+for+Single-Cell+RNA-Seq+Profiling+Analysis.">SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.</a> PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li></ol>

Questa procedura consente la raccolta efficiente dei numerosi gangli enterici come fonte per la derivazione di RNA per RNA-seq. Qui, abbiamo abbiamo accelerato i processi illustrati in protocolli esistenti mantenendo al massimo l'integrità del RNA. Come tutti i passaggi di questa procedura sono interdipendenti, è importante che tutti i problemi verranno eliminati dall'inizio dello studio e che tutti i campioni sono preparati come similmente ad uno altro come possibile, per ottenere affidabile RNA-seq.
<p class="jov...

Questo metodo è progettato per ottenere campioni di RNA di alta qualità dei gangli enterici da tessuto intestinale umano mediante microdissezione laser (LCM). Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per fornire sufficiente qualità di RNA e rendimenti per RNA (RNA-seq) di sequenziamento ed è destinato a essere utilizzato con tessuto intestinale umano appena resecato, slegato, flash-congelato.
Disturbi funzionali della motilità gastrointestinale dell'intestino ed interessano uno su quattro persone negli Stati Uniti. Il sistema nervoso enterico (ENS), noto anche come il secondo cervello1, è spesso al centro di questi disordini, che svolge un ruolo fondamentale nell'omeostasi dell'intestino e motilità. Manipolazione della motilità intestinale è stato generalmente limitato a resezione chirurgica del tessuto aganglionic/noncontractile, modifica dietetica cronica e/o farmaci. Sorprendentemente, il trascrittoma completo del ENS adulto rimane essere sequenziato, limitando notevolmente la nostra capacità di identificare le molecole all'interno l'ENS che possono essere mirati farmacologicamente o utilizzate nelle terapie con cellule staminali.
Ci sono relativamente pochi metodi per l'isolamento di RNA dai gangli enterici umani. Il primo approccio, cella dissociazione2, richiede temperature di incubazione elevate e tempi di incubazione lungo; sia di cui sono noti per promuovere la degradazione del RNA e alterare il trascrittoma2,3. Un approccio alternativo, LCM, più attendibilmente conserva il trascrittoma e protegge l'integrità del RNA. Anche se parecchi studi hanno utilizzato LCM per raccogliere dei gangli da tessuto intestinale umano fresco congelato4,5,6, questi approcci erano sia ostacolata dalla scarsa qualità di RNA e la quantità, erano abbastanza laboriosi, o necessaria modifica di colorazione o di tecniche di estrazione di RNA a lavorare nelle nostre mani. Altri protocolli di LCM progettati per la conservazione del RNA che sono stati trovati nel prodotto di LCM manuali forniti ulteriori miglioramenti7,8, ma l'adattamento è stato necessario quando applicato all'isolamento di gangli enterici8, 9. per queste ragioni, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato basato su queste risorse che produce notevoli quantità di RNA ad alta integrità dai gangli enterici umani, ha un flusso di lavoro relativamente veloce e produce risultati coerenti attraverso un grande numero di campioni.
In questo studio, presentiamo una sintesi delle procedure ottimizzate che facilitano l'isolamento di RNA ad alta integrità dai gangli enterici provenienti da tessuto intestinale umano resecato. Il nostro metodo incorpora cinque aspetti importanti. Primi, appena resecato, unfixed campioni intestinali umani devono essere tagliati a misura, hanno tutta l'umidità in eccesso rimossi con un tessuto di laboratorio e appiattito in un grande stampo base prima del flash-congelamento in cima ad una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano (2 MB). Seconda sezioni istologiche dell'intestino dovrebbero essere preparate per ottenere il piano completo del plesso myenteric in una diapositiva, che offre un payload di grandi dimensioni dei gangli enterici. Successo con questo passaggio dipende in larga misura il processo di preparazione del tessuto. In terzo luogo, la struttura non uniforme dei gangli in ENS richiede l'utilizzo di polietilene napthalate (PEN) membrana diapositive6, che offrono la massima velocità e precisione durante il processo di LCM. Coloranti quarto, etanolo-compatibile, ad esempio Cresyl Violet, dovrebbero essere utilizzati per preservare l'integrità di RNA durante la macchiatura dei gangli enterici. Infine, il processo di estrazione di RNA è fondamentale per un risultato di successo con RNA-seq. Abbiamo cercato un approccio di estrazione di RNA che produce alta integrità di RNA, massimizza RNA rendimenti quando si inizia con piccole collezioni di gangli enterici, Elimina la contaminazione di DNA e conserva specie di RNA come molti come possibile.
Presi insieme, ottimizzazione di questi fattori nel presente studio notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni dei gangli enterici con eccezionale quantità di RNA e di qualità. Risultati sono stati in gran parte coerenti tra un considerevole gruppo di campioni, che indica la consistenza di questo approccio. Inoltre, abbiamo usato questi approcci per sequenziato decine di campioni di RNA dai gangli enterici. Le strategie evidenziate qui possono anche essere ampiamente adattate per l'esecuzione di LCM di gangli desiderati o i nuclei dell'unità periferica e del sistema nervoso centrale e altri casi che richiedono l'isolamento di RNA di alta qualità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:920px;" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">10% Neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-mL conical tubes, polypropylene&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Base molds 37x24x5mm, disposable</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>5025511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Belzer UW&#160; Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CapSure Macro LCM caps</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cling Wrap, Press&#8217;n Seal&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Glad&#160;&#160;</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC405760025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting Board</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 190-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gloves, extended cuff</td>
			<td>Microflex&#160;</td>
			<td>19010144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gowns, surgical-disposable</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>19-088-2116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>1335920B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (large)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (small)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica Cryostat Chuck, large,&#160; 40 mm&#160;</td>
			<td>Southeast Pathology Instrument Service</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (20X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &#8734;/0.17</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (10X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &#8734;/-</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Sieves</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC197255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PicoPure RNA extraction kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Kontes</td>
			<td>4621973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEN membrane LCM slides</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZAP&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma-R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;A&#34; (PicoPure)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;B&#34; (RNeasy&#160; Micro kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Method &#34;C&#34; (TRIzol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;D&#34; (RNeasy PLUS Mini kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Splash Shield, disposable faceshield</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors, Surgical, 14.5 cm &#34;sharp-sharp&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe filter, cellulose acetate (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>190-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td>General Data Healthcare</td>
			<td>TFM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici raccolti da tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Abbiamo identificato cinque passaggi del flusso di lavoro che sono cruciali per l'ottenimento di RNA isolati dai gangli enterici con sufficientemente alta qualità e quantità per RNA-seq. In primo luogo, quando si prepara il tessuto intestinale, ogni campione deve avere tutto il liquido in eccesso rimosso dal macchiare prima della spianatura serosa quanto possibile nella parte inferiore della grande stampi base. I campioni allora rapidamente sono congelati in cima a una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano. In secondo luogo, durante il taglio del tessuto, è importante posizionare cryomolds modo che sezioni intestinali in parallelo il piano completo del plesso mioenterico, producendo quindi il maggiore della superficie dei gangli enterici per ogni diapositiva. Terzo, durante LCM, polietilene napthalate (PEN)-diapositive di membrana offrono la massima velocità e flessibilità nel delineare le forme non uniforme dei gangli enterici durante la raccolta dei gangli enterici. In quarto luogo, per la visualizzazione distinte dei gangli enterici all'interno delle sezioni, etanolo compatibile con coloranti, come la viola di Cresyl, offrono ottima conservazione dell'integrità di RNA rispetto acquose coloranti. Infine, per l'estrazione di RNA da gangli catturati, abbiamo osservato le differenze tra kit commerciali di estrazione RNA che restituito superior RNA quantità e qualità, eliminando la contaminazione del DNA. Ottimizzazione di questi fattori nel protocollo corrente notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni di gangli enterici con eccezionale qualità di RNA e la quantità.

Abbiamo apportato diversi miglioramenti ai protocolli esistenti che consentono la raccolta relativamente rapida dei gangli enterici dai campioni intestinali umani utilizzando LCM, conforme agli standard per RNA-seq. In primo luogo, abbiamo ottimizzato il congelamento rapido di segmenti di tessuto intestinale in grandi stampi base collocati sulla superficie di un impasto di ghiaccio secco in 2 MB (Figura 1B). Il miglior successo durante cryose...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici isolati dal tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Questo protocollo prevede preparazione flash-congelati campioni di tessuto intestinale umano, cryosectioning, colorazione etanolica e disidratazione, LCM e l'estrazione di RNA.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolamento di distinte popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo da Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...