Name: optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

Мы признательны донорам и их семей, которые сделали возможной эту работу. Мы также ценим помощь персонала в Международный Институт медицины и Теннесси доноров услуг для помогать координировать коллекции ткани, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья, низ OT2-OD023850 EMS2 и стипендиальной поддержки от НИЗ T32-DK007673 до AMZ. Мы благодарны сотрудникам Вандербильта трансляционная патологии общих ресурсов для доступа к LCM инструмент и консультации по подготовке ткани. Общий ресурс патологии Вандербильта ткани частично поддерживается NIH грантов P30-CA068485-14 и U24-DK059637-13. Мы благодарим генома центр технологий доступа в отдел генетики в Вашингтоне школы медицины университета за помощь с геномного анализа. GTAC частично поддерживается NCI рака центр поддержки Грант #P30 CA91842 в Siteman центр рака и ИКТ/CTSA #UL1TR002345 грант от национального центра для исследования ресурсов (NCRR), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и низ Дорожная карта для медицинских исследований. Эта публикация является исключительно ответственности авторов и вовсе не обязательно отражает официальное мнение NCRR или низ.

Все протоколы, описанные здесь были одобрены, Вандербильт университета институционального обзора (КИБ).
1. подготовка до прибытия ткани
<ol><li>Получение надлежащего утверждения IRB и координировать с учреждениями человеческий орган пожертвование для получения свежей резе...

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5, 9226 (2015).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).</li><li>Bottner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+as+a+new+tool+to+investigate+site-specific+gene+expression+in+enteric+ganglia+of+the+human+intestine.">Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine.</a> Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Hetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+gene+expression+analysis+in+enteric+ganglia+of+human+colon+after+laser+microdissection.">Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection.</a> Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).</li><li>. PALM Protocols - RNA handling Available from: <a target="_blank" href="https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf">https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf</a> (2011)</li><li>. Workflows &amp; Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/">https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/</a> (2015)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arcturus+HistoGene+Frozen+Section+Staining+Kit:+User+Guide.">Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide.</a> Biosystems, A. , (2010).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+cost-effective+and+flexible+method+for+processing+of+snap-frozen+tissue+to+prepare+large+amounts+of+intact+RNA+using+laser+microdissection.">A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection.</a> Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).</li><li>Heumuller-Klug, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+intestinal+mRNA:+a+matter+of+treatment.">Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment.</a> World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+degraded+RNA+addressed+by+3'+tag+counting.">Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting.</a> PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).</li><li>Potter, S. S., Brunskill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture.">Laser capture.</a> Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).</li><li>Funke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+intestinal+epithelial+cells+and+downstream+analysis.">Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).</li><li>Kolijn, K., van Leenders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+extraction+kits+and+histological+stains+for+laser+capture+microdissected+prostate+tissue.">Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue.</a> BMC Res Notes. 9, 17 (2016).</li><li>Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+RNA+from+single+cell+populations+in+human+postmortem+brain+tissue.">Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li><li>Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINCERA:+A+Pipeline+for+Single-Cell+RNA-Seq+Profiling+Analysis.">SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.</a> PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li></ol>

Эта процедура позволяет эффективного сбора многочисленных кишечных ганглиев в качестве источника для получения РНК для РНК seq. Здесь мы ускорили процесс, изложенные в существующих протоколах, максимально сохраняя целостность РНК. Поскольку все шаги в этой процедуре являются взаимоза?...

Этот метод предназначен для получения высокого качества образцов РНК кишечных ганглиев от кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Протокол, описанные здесь был оптимизирован для обеспечения достаточной РНК качества и урожайности для РНК (РНК seq) последовательности и предназначен для использования с свежезаваренным резецируется, нефиксированных, флэш замороженные кишечных тканей человека.
Расстройства функциональные моторики желудочно-кишечного тракта и кишки затрагивает один из каждых четырех человек в Соединенных Штатах. Кишечные нервной системы (Ен), также именуемый второй мозг1, часто находится в центре этих расстройств, как она играет решающую роль в кишечнике гомеостаза и подвижности. Манипуляция сократительной способности кишечника обычно ограничивались хирургическая резекция aganglionic/noncontractile ткани, хронический диетическое изменение и/или лекарства. Удивительно полным транскриптом взрослых ENS остается последовательной, значительно ограничивает нашу способность идентифицировать молекул в ENS, которые могут быть направлены фармацевтически или используются в терапии стволовой клетки.
Существует относительно небольшое число методов для изоляции RNA от человека кишечные ганглии. Первый подход, клетки диссоциации2, требует температуры высокой инкубации и длительный инкубационный раз; оба из которых известны содействовать деградации РНК и изменить транскриптом2,3. Альтернативный подход, НОК, более надежно сохраняет транскриптом и защищает целостность РНК. Хотя ряд исследований использовали LCM для сбора ганглиев от кишечных тканей человека свежемороженые4,5,6, эти подходы были либо затруднены бедных РНК качества и количества, были довольно трудоемкий, или необходимые модификации пятнать или РНК добыча методы для работы в наших руках. Другие LCM протоколы предназначены для сохранения РНК, которые были найдены в продукте LCM, предоставляемых пособий, дополнительные усовершенствования7,8, но адаптация необходима при применении к изоляции кишечных ганглиев8, 9. по этим причинам, мы разработали оптимизированный протокол, основанный на эти ресурсы, дает значительное количество высокопрочные РНК от человека кишечные ганглии, имеет сравнительно быстрый рабочий процесс и производит последовательные результаты через большой Количество выборок.
В этом исследовании мы представляем краткий обзор оптимизации процедур, которые способствуют изоляции высокопрочные РНК от кишечных ганглии, получены из резекции кишечника ткани человека. Наш метод включает в себя пять важных аспектов. Во-первых, свежезаваренным резецируется, незафиксированная человека кишечные образцы должны быть сокращены до размера, имеют все излишки влаги удален с ткани лаборатории и выравнивается в большой базы плесень до флэш замораживания на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane (2 МБ). Во-вторых, гистологическое части кишечника должны быть готовы получить полное плоскости myenteric сплетения на слайде, который предлагает большой полезной кишечной ганглии. Успех этого шага в значительной степени зависит от процесса подготовки ткани. В-третьих неоднородной структуры ганглиев в ENS требует использования полиэтиленовых napthalate (PEN) мембраны слайды6, который предлагают наибольшую скорость и точность в процессе НОК. Четвертый, этанол совместимых красителей, таких как количество кресил фиолетовый, должны использоваться для сохранения целостности РНК во время окрашивания кишечных ганглии. Наконец процесс извлечения РНК имеет решающее значение для успешного исхода с РНК-последующие Мы стремились РНК добыча подход, который производит высокой целостности РНК, максимизирует РНК урожайности при запуске с небольшими коллекциями кишечных ганглиев, устраняет загрязнения ДНК и сохраняет как много видов РНК как можно скорее.
Вместе взятые, оптимизация этих факторов в настоящем исследовании значительно ускоряет процесс и дает образцы кишечных ганглиев с исключительной РНК количества и качества. Результаты были во многом согласуется среди значительные группы образцов, указывающее последовательность этого подхода. Кроме того мы использовали эти подходы для успешной виртуализации десятки образцов РНК от кишечных ганглии. Стратегии, подчеркнул здесь также может быть широко адаптирована для выполнения LCM желаемого ганглиев или ядер периферической и центральной нервной системы и других случаях, требующих изоляции высокого качества РНК.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:920px;" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">10% Neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-mL conical tubes, polypropylene&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Base molds 37x24x5mm, disposable</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>5025511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Belzer UW&#160; Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CapSure Macro LCM caps</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cling Wrap, Press&#8217;n Seal&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Glad&#160;&#160;</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC405760025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting Board</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 190-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gloves, extended cuff</td>
			<td>Microflex&#160;</td>
			<td>19010144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gowns, surgical-disposable</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>19-088-2116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>1335920B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (large)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (small)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica Cryostat Chuck, large,&#160; 40 mm&#160;</td>
			<td>Southeast Pathology Instrument Service</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (20X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &#8734;/0.17</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (10X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &#8734;/-</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Sieves</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC197255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PicoPure RNA extraction kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Kontes</td>
			<td>4621973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEN membrane LCM slides</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZAP&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma-R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;A&#34; (PicoPure)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;B&#34; (RNeasy&#160; Micro kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Method &#34;C&#34; (TRIzol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;D&#34; (RNeasy PLUS Mini kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Splash Shield, disposable faceshield</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors, Surgical, 14.5 cm &#34;sharp-sharp&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe filter, cellulose acetate (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>190-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td>General Data Healthcare</td>
			<td>TFM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue

Этот метод предназначен для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, собранных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Мы определили пять шагов в рабочем процессе, которые имеют решающее значение для получения РНК изоляты от кишечных ганглиев с достаточно высокого качества и количества РНК seq. Во-первых при подготовке кишечника ткани, каждый образец должен иметь все лишнюю жидкость, удалены промокательной до рихтовки serosa как можно больше в нижней части большого базовой формы. Затем образцы быстро заморожены на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane. Во-вторых при резании ткани, важно располагать cryomolds кишечная разделам параллельно плоскости полная myenteric сплетения, тем самым давая наибольшую площадь поверхности кишечного ганглиев на слайд. В-третьих, во время LCM, полиэтилен napthalate (PEN)-мембраны слайды предлагают наибольшую скорость и гибкость в зарисовке неоднородной формы кишечной ганглии, при сборе интестинальная ганглии. В-четвертых для различных визуализации кишечных ганглиев в пределах секции, этанол совместимых красители, как количество кресил фиолетовый, предлагают отличные сохранение целостности РНК относительно водные красители. Наконец для извлечения РНК из захваченных ганглии, мы наблюдали различия между коммерческой РНК добыча комплекты, которые принесли Реновированый РНК и качества, устраняя загрязнения ДНК. Оптимизация этих факторов в текущий протокол значительно ускоряет процесс и дает кишечных ганглиев образцы с исключительной РНК качества и количества.

Мы сделали несколько улучшений в существующих протоколов, позволяющих коллекции относительно быстрое интестинальной ганглиев от человека кишечные образцов с помощью LCM, отвечающие стандартам для РНК-Seq. Во-первых мы оптимизировали быстрое замораживание кишечных тка...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue at JoVE.com

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

Цель настоящего Протокола заключается в том, для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, изолированных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Этот протокол предусматривает подготовка флэш замороженных образцов человеческой кишечника ткани, cryosectioning, обколоть окрашивание и обезвоживания, НОК и извлечение RNA.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Хроматин Иммунопреципитация из ткани спинного Ganglia Корневая следующие аксональное повреждение

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Лазерная Capture Microdissection обогащенного популяции нейронов или отдельных нейронов для генного анализа выражения после черепно-мозговой травмы

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Обонятельных нейронов, полученных с помощью носовой биопсии в сочетании с лазерной съемки микродиссекции: возможный подход к исследуемым препаратом ответ психических расстройств

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...