Name: optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00
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Agradecemos a los donantes y sus familias que hicieron posible este trabajo. También agradecemos la asistencia de personal en el Instituto Internacional de medicina y servicios de donantes de Tennessee para ayudar a coordinar colección de tejido utilizado en este estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud, NIH OT2-OD023850 a EMS2 y estipendio apoyo de NIH T32-DK007673 al AMZ. Agradecemos al personal de Vanderbilt traslacional patología compartida del recurso de acceso al instrumento de LCM y asesoramiento sobre la preparación de tejido. El recurso de compartido de patología de tejido Vanderbilt es apoyado en parte por subvenciones de NIH P30-CA068485-14 y U24-DK059637-13. Agradecemos el genoma tecnología centro de acceso en el Departamento de genética de la escuela de medicina de la Universidad de Washington ayuda con análisis genomic. El GTAC es parcialmente apoyado por NCI cáncer centro apoyo beca #P30 CA91842 al centro de cáncer Siteman y por TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 del centro nacional para recursos de investigación (NCRR), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH) y los NIH Hoja de ruta para la investigación médica. Esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de NCRR o NIH.

Se describen aquí todos los protocolos han sido aprobados por la Vanderbilt University institucional de junta (IRB).
1. preparación antes de la llegada de tejido
<ol><li>Obtener la aprobación IRB apropiado y coordinar con agencias de donación de órganos humanos para obtener tejido intestinal recién resecado, interpretaciones de los donantes que cumplen todos los criterios de investigación para el estudio. Nota: Este protocolo puede ser adaptado para su uso con ratones y otros roedo...

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5, 9226 (2015).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).</li><li>Bottner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+as+a+new+tool+to+investigate+site-specific+gene+expression+in+enteric+ganglia+of+the+human+intestine.">Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine.</a> Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Hetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+gene+expression+analysis+in+enteric+ganglia+of+human+colon+after+laser+microdissection.">Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection.</a> Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).</li><li>. PALM Protocols - RNA handling Available from: <a target="_blank" href="https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf">https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf</a> (2011)</li><li>. Workflows &amp; Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/">https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/</a> (2015)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arcturus+HistoGene+Frozen+Section+Staining+Kit:+User+Guide.">Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide.</a> Biosystems, A. , (2010).</li><li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue.">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li><li>Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+cost-effective+and+flexible+method+for+processing+of+snap-frozen+tissue+to+prepare+large+amounts+of+intact+RNA+using+laser+microdissection.">A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection.</a> Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).</li><li>Heumuller-Klug, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+intestinal+mRNA:+a+matter+of+treatment.">Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment.</a> World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li><li>Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+degraded+RNA+addressed+by+3'+tag+counting.">Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting.</a> PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).</li><li>Potter, S. S., Brunskill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture.">Laser capture.</a> Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).</li><li>Funke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+intestinal+epithelial+cells+and+downstream+analysis.">Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).</li><li>Kolijn, K., van Leenders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+extraction+kits+and+histological+stains+for+laser+capture+microdissected+prostate+tissue.">Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue.</a> BMC Res Notes. 9, 17 (2016).</li><li>Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+RNA+from+single+cell+populations+in+human+postmortem+brain+tissue.">Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li><li>Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINCERA:+A+Pipeline+for+Single-Cell+RNA-Seq+Profiling+Analysis.">SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.</a> PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li></ol>

Este procedimiento permite la eficiente recopilación de numerosos ganglios entéricos como fuente para obtener RNA para RNA-seq. Aquí, hemos acelerado los procesos descritos en los protocolos existentes al máximo preservar integridad del RNA. Como todos los pasos de este procedimiento son interdependientes, es importante eliminar todos los problemas desde el inicio del estudio y que todas las muestras se preparan como semejantemente uno al otro como sea posible, para obtener confiable RNA-seq.
<p class="jove_conte...

Este método está diseñado para obtener muestras de RNA de alta calidad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar suficiente RNA calidad y rendimientos para ARN de secuencia (RNA-seq) y está destinado a ser utilizado con tejido intestinal humano recién resecado, interpretaciones, flash-congeladas.
Trastornos de la motilidad gastrointestinal y tripas funcionales afectan uno de cada cuatro personas en los Estados Unidos. El sistema nervioso entérico (ENS), también conocido como el segundo cerebro1, es a menudo en el centro de estos trastornos, como juega un papel fundamental en la homeostasis intestinal y la motilidad. Manipulación de la motilidad intestinal generalmente está limitado a la resección quirúrgica del tejido agangliónico/noncontractile, modificación dietética crónica y/o medicamentos. Sorprendentemente, el transcriptoma completo de la ENS adultos queda ser secuenciado, limitando enormemente nuestra capacidad para identificar las moléculas dentro de la ENS que pueden ser dirigidos farmacéuticamente o utilizados en terapias con células madre.
Hay relativamente pocos métodos para aislar RNA ganglios entéricos humanos. El primer enfoque, disociación celular2requiere incubación altas temperaturas y tiempos de incubación; tanto que se conocen para promover la degradación del RNA y alterar el transcriptoma2,3. Un enfoque alternativo, LCM, más confiablemente conserva el transcriptoma y protege la integridad del RNA. Aunque varios estudios han utilizado LCM para recoger los ganglios del tejido intestinal humano fresco congelado4,5,6, estos enfoques tampoco fueron obstaculizados por la pobre cantidad y calidad de RNA, eran muy intensivas, o necesaria modificación de la tinción o técnicas de extracción de RNA para trabajar en nuestras manos. Otros protocolos de LCM diseñados para la preservación de RNA que se encuentran en productos de LCM manuales proporcionan mejoras adicionales7,8, pero la adaptación era necesario cuando se aplica al aislamiento de los ganglios entéricos8, 9. por estas razones, hemos desarrollado un protocolo optimizado basado en estos recursos que rinde cantidades sustanciales de RNA de alta integridad de ganglios entéricos humanos, tiene un flujo de trabajo relativamente rápido y produce resultados consistentes a través de una gran número de muestras.
En este estudio, presentamos una sinopsis de los procedimientos optimizados que facilitan el aislamiento de ARN de alta integridad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano resecado. Nuestro método incorpora cinco aspectos importantes. Primeras, recién resecado, interpretaciones muestras intestinales humanas deben recortarse en tamaño, tienen todo el exceso de humedad quitada con un pañuelo de laboratorio y aplastada en un molde grande de base antes de la congelación de flash encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano (2 MB). En segundo lugar, histologic secciones del intestino deben estar preparadas para obtener el plano completo del plexo mientérico en un portaobjetos, que ofrece una gran capacidad de carga de ganglios entéricos. Éxito con este paso depende en gran medida del proceso de preparación del tejido. En tercer lugar, la estructura no uniforme de los ganglios en la ENS requiere el uso de polietileno napthalate (PEN) membrana diapositivas6, que ofrecen la mayor velocidad y precisión durante el proceso de la LCM. Tintes en cuarto lugar, compatible con etanol, como el violeta de cresilo, puede usarse para preservar la integridad del RNA mientras manchaba los ganglios entéricos. Por último, el proceso de extracción de RNA es fundamental para un resultado exitoso con RNA-seq. Buscamos un enfoque de extracción de RNA que produce alta integridad del RNA, maximiza rendimientos RNA cuando a partir de pequeñas colecciones de ganglios entéricos, elimina la contaminación de ADN y conserva especies de RNA como muchos como sea posible.
Tomados en conjunto, optimización de estos factores en el presente estudio grandemente acelera el flujo de trabajo y da muestras de ganglios entéricos con la excepcional cantidad de RNA y la calidad. Resultados han sido en gran parte constantes entre un grupo considerable de muestras, indicando que la consistencia de este enfoque. Además, hemos utilizado estos enfoques secuenciar con éxito decenas de muestras de RNA de los ganglios entéricos. Las estrategias aquí destacadas también ampliamente adaptables para la realización de LCM de deseada de los ganglios o núcleos de periférico y sistema nervioso central y otros casos que requieren el aislamiento del ARN de alta calidad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:920px;" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">10% Neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-mL conical tubes, polypropylene&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>05-526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Base molds 37x24x5mm, disposable</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>5025511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Belzer UW&#160; Cold Storage Solution</td>
			<td>Bridge to Life</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CapSure Macro LCM caps</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cling Wrap, Press&#8217;n Seal&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Glad&#160;&#160;</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC405760025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting Board</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 190-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200-proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gloves, extended cuff</td>
			<td>Microflex&#160;</td>
			<td>19010144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gowns, surgical-disposable</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>19-088-2116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>1335920B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (large)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes (small)</td>
			<td>Kimberly-Clark&#160;</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica Cryostat Chuck, large,&#160; 40 mm&#160;</td>
			<td>Southeast Pathology Instrument Service</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (20X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &#8734;/0.17</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope objective (10X)</td>
			<td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &#8734;/-</td>
			<td>N.A.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Sieves</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC197255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PicoPure RNA extraction kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Kontes</td>
			<td>4621973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEN membrane LCM slides</td>
			<td>Arcturus, ThermoFisher</td>
			<td>LCM022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZAP&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma-R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;A&#34; (PicoPure)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;B&#34; (RNeasy&#160; Micro kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Method &#34;C&#34; (TRIzol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Extraction Kit &#34;D&#34; (RNeasy PLUS Mini kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Splash Shield, disposable faceshield</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors, Surgical, 14.5 cm &#34;sharp-sharp&#34;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe filter, cellulose acetate (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td>190-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td>General Data Healthcare</td>
			<td>TFM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of laser-capture microdissection for the isolation of enteric ganglia from fresh-frozen human tissue

El propósito de este método es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos de interpretaciones, recién resecado tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Hemos identificado cinco pasos en el flujo de trabajo que son cruciales para la obtención de RNA aislados de ganglios entéricos con suficiente calidad y cantidad de RNA-seq. En primer lugar, preparar el tejido intestinal, cada muestra debe tener todo exceso de líquido eliminado por borrar antes de aplanar la serosa tanto como sea posible a través del fondo de grandes moldes base. Las muestras entonces se congelan rápidamente encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. En segundo lugar, al seccionar los tejidos, es importante posicionar cryomolds para que las secciones intestinales paralelas el plano completo del plexo mientérico, produciendo así la mayor superficie de ganglios entéricos por diapositiva. Tercero, en la LCM, polietileno napthalate (PEN)-diapositivas de membrana ofrecen la mayor velocidad y flexibilidad en las formas no uniformes de ganglios entéricos el recoger los ganglios entéricos. En cuarto lugar, para la clara visualización de ganglios entéricos dentro de las secciones, colorantes compatibles con etanol, como el violeta de cresilo, ofrecen excelente preservación de la integridad del RNA en relación con tintes acuosos. Finalmente, para la extracción del ARN de los ganglios capturados, observamos diferencias entre los kits comerciales de extracción RNA que rindieron superior cantidad de RNA y de calidad, eliminando la contaminación del ADN. Optimización de estos factores en el protocolo actual en gran medida acelera el flujo de trabajo y da muestras de los ganglios entéricos con excepcional calidad de RNA y la cantidad.

Hemos hecho varias mejoras en los protocolos que permiten la colección relativamente rápida de ganglios entéricos de muestras intestinales humanas usando LCM, cumpliendo con los estándares para RNA-seq. En primer lugar, hemos optimizado la congelación rápida de los segmentos de tejido intestinal en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco en 2 MB (figura 1B). Se obtuvo el mejor éxito durante cryosec...

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Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Investigación

Neurociencias

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Producción De ARN Para El Análisis Transcriptómico De Los Cuerpos Celulares De La Neurona Motora De La Médula Espinal De Ratón Por Microdisección De Captura Láser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Las neuronas olfativas obtenidos por medio de biopsia nasal combinado con microdisección por láser captura: un enfoque potencial para el Estudio de la respuesta al tratamiento en los trastornos mentales

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

El aislamiento de las poblaciones celulares distinto del cerebelo en desarrollo por Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...