Name: light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

De auteurs zou dank willen uitspreken aan William Talbot van Stanford University voor het verstrekken van de mens Nrg1 cDNA en Deborah Yelon van UCSD voor het verstrekken van de wea de mutanten. De auteurs ook bedank Cynthia Chen voor het helpen met Beeldacquisitie. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (T.K. Hsiai), HL083015 (naar T.K. Hsiai), HD069305 (naar NC Chi en T.K. Hsiai.), HL111437 (aan T.K. Hsiai en NC Chi), HL129727 (naar T.K. Hsiai), T32HL007895 (naar R.R. Sevag Packard), HL 134613 (naar V. Messerschmidt) en Universiteit van Texas systeem sterren financiering (J. Lee).

De volgende methoden werden uitgevoerd met inachtneming van UTA en UCLA IACUC protocollen. Deze experimentele groepen werden gebruikt met transgene Tg(cmlc2:gfp), de mutanten wea (zwakke atrium) of clo (cloche) : (a) wild-type (WT) controle, (b) gata1a MO en (c) tnnt2a MO injecties (tabel 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Model</td>
			<td>Naam</t...

<ol>
	<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+domain+computational+fluid+dynamics+to+interface+with+an+embryonic+model+of+cardiac+morphogenesis.">Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis.</a> PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).</li><li>Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+cardiac+trabeculation+on+neuregulin+signaling+and+blood+flow+in+zebrafish.">Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+Not+Gata2+Converts+Erythropoiesis+to+Myelopoiesis+in+Zebrafish+Embryos.">Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos.</a> Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+is+required+to+preserve+cardiac+chamber+morphology.">Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110 (7), 2718 (2007).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Scientific Reports. 4, 4898 (2014).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+role+for+ErbB2+signaling+in+cardiac+trabeculation.">A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation.</a> Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).</li><li>Samsa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contraction+activates+endocardial+Notch+signaling+to+modulate+chamber+maturation+in+zebrafish.">Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish.</a> Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521, 520 (2015).</li><li>Sifrim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+genetic+architectures+for+syndromic+and+nonsyndromic+congenital+heart+defects+identified+by+exome+sequencing.">Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing.</a> Nature Genetics. 48, 1060 (2016).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+two+risk+loci+for+congenital+heart+malformations+in+Han+Chinese+populations.">A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations.</a> Nature Genetics. 45, 818 (2013).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+confocal+microscopy+and+quantitative+4D+image+analysis+of+anchor-cell+invasion+through+the+basement+membrane+in+Caenorhabditis+elegans.">Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 12, 2081 (2016).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Lavagnino, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+(x-y-z-t)+imaging+of+thick+biological+samples+by+means+of+Two-Photon+inverted+Selective+Plane+Illumination+Microscopy+(2PE-iSPIM).">4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM).</a> Scientific Reports. 6, 23923 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007 (2004).</li><li>Hove, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracardiac+fluid+forces+are+an+essential+epigenetic+factor+for+embryonic+cardiogenesis.">Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis.</a> Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>BioRad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General Protocol for Western Blotting. 6376, (2018).</li><li>GeneTools. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Tools Oligo Design Website. , (2018).</li><li>Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish Course. , (2013).</li><li>Grenander, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Probability and Statistics: The Harald Cram&#233;r Volume. , (1959).</li><li>Fei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Light-Sheet+Fluorescent+Microscopy+for+Multi-Scale+and+Rapid+Imaging+of+Architecture+and+Function.">Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function.</a> Scientific Reports. 6, 22489 (2016).</li><li>Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+cardiac+imaging+in+living+embryos+via+postacquisition+synchronization+of+nongated+slice+sequences.">Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).</li><li>Adeoye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+exogenous+enzymes+and+probiotic+on+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+growth,+intestinal+morphology+and+microbiome.">Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome.</a> Aquaculture. 463, 61-70 (2016).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+Euthanasia+in+Zebrafish.">Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Dissection+in+Larval,+Juvenile+and+Adult+Zebrafish,+Danio+rerio.">Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+Flow+Induces+Autophagy,+but+Impairs+Autophagic+Flux+to+Perturb+Mitochondrial+Homeostasis.">Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Stress-Activated+Wnt-Angiopoietin-2+Signaling+Recapitulated+Vascular+Repair+in+Zebrafish+Embryos.">Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).</li><li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-Responsive+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-Protein+Kinase+C+Isoform+Epsilon+Signaling+Mediates+Glycolytic+Metabolites+for+Vascular+Repair.">Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).</li><li>Vermot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+blood+flows+act+through+klf2a+to+ensure+normal+valvulogenesis+in+the+developing+heart.">Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart.</a> PLoS Biol. 7 (11), (2009).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+essential+for+ventricular+chamber+development.">Notch signaling is essential for ventricular chamber development.</a> Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).</li><li>Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+weak+atrium/atrial+myosin+heavy+chain+disrupts+atrial+function+and+influences+ventricular+morphogenesis+in+zebrafish.">Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish.</a> Development. 130 (24), 6121 (2003).</li><li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiologic+dissection+of+the+vertebrate+cardiac+conduction+system.">Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system.</a> PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation.">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. 124 (2), 381-389 (1997).</li><li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloche,+an+early+acting+zebrafish+gene,+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages.">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+(SPIM).">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li></ol>

In dit protocol hebben we aangetoond dat 4-D imaging kan worden gebruikt voor het bijhouden van de ontwikkeling van een trabecular netwerk in reactie op veranderingen in de biomechanische krachten. In het bijzonder initieert de shear stress ervaren door endotheliale cellen de inkeping signalering cascade, die op zijn beurt trabeculation bevordert. In dit manuscript, hebben wij aangetoond dat (1) gata1a MO injectie daalde Haematopoiese en daarom het minder muur shear stress, (2) tnnt2a MO injectie geremd...

Biomechanische krachten, zoals hemodynamische schuifspanning, zijn nauw betrokken bij cardiale morfogenese. In reactie op de hemodynamische schuintrekken krachten ontwikkelen myocardiale richels en groeven in een golf-achtige trabecular netwerk in afstemming met de richting van de schuifspanning over de atrioventriculaire (AV) ventiel1. Cardiale trabeculation is noodzakelijk om contractiele functie en myocard massa2te verhogen. Mutaties in Notch signalering trajecten leiden tot congenitale hartafwijkingen bij mensen en andere gewervelde dieren3. Bijvoorbeeld, is gata1a4 en tnnt2a5 morfolino oligonucleotides (MO) aangetoond dat het verminderen van Erytropoëse, terwijl Erytropoëtine (EPO) mRNA6 en Isoproterenol (ISO)7 rood bloed verhogen cellen en hartslag muur respectievelijk, en daarom schuifspanning (WSS). Bovendien, ErbB2 signalering, stroomafwaarts van de inkeping, bevordert cardiomyocyte proliferatie en differentiatie voor het genereren van contractiele force, die op zijn beurt activeert Notch signalering van8,9. Er wordt voorgesteld dat schuifspanning regelt Notch signalering gedreven trabeculation voor ventriculaire ontwikkeling. Op dit moment, er zijn vele studies die poging om verder te begrijpen de genetische programmering gebeurtenissen die leiden tot aangeboren hart gebreken (CHD)10,11,12, maar heel weinig zijn onderzoekt hoe mechanische krachten beïnvloeden de vorming hart.
Om te onderzoeken de mechanische krachten die op het endocard, nauwe waarneming tijdens de periode ontwikkelingsbehoeften worden uitgevoerd. Het is echter wel uitdagend om het verkrijgen van goede kwaliteitsbeelden van het in vivo verslaan monsters als gevolg van de verbondenheid van traditionele microscopie13. Om het observeren van de ontwikkeling na verloop van tijd in een steekproef, moeten fysieke segmenteren en kleuring, daarom optreden van13,14,15. Hoewel confocale microscopie veel gebruikt wordt om het imago van de 3D-structuur van monsters14,16, is deze beeldvormingssystemen overname nog beperkt door langzame digitaliseringsnelheden aan.
Licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) is een unieke beeldvormende techniek die de visualisatie van in vivo dynamische evenementen met lang werkende afstand13 toelaat. Deze techniek maakt gebruik van een licht vel fluorescent microscopie optisch deel een monster17. Als gevolg van verlichting van alleen een dun blad van licht op de steekproef is er een vermindering in de foto-bleken en foto toxiciteit13,18. Het grote gebied van weergave en lange afstand zorgt voor grote monsters intact blijven zoals ze verbeelde13,14,17 zijn. De lage vergroting zorgt voor een groter gebied aan het image worden gemaakt, terwijl de lange afstand zorgt voor dikker monsters te worden zonder afbreuk te doen aan de signal-to-noise verhouding beeld. Veel groepen LSFM zijn gewend geraakt afbeelding hele embryo's17, hersenen14,18, spieren en hart19 onder andere weefsels, tonen van de verschillende soorten monsters die image kunnen worden gemaakt.
Hoewel eerder onderzoek aangetoond verminderde hemodynamische schuintrekken kracht door de instroom of uitstroom tracks van de zebravis hart occluding, is de informatie uitsluitend kwalitatieve. Dit resulteert in een abnormale derde kamer, verminderde cardiale looping en verminderde ventiel vorming20. De 4-D LSFM beelden geven een nieuw perspectief in de manier waarop die de hemodynamische schuintrekken dwingt invloed op de ontwikkeling van de cardiale weefsel. Deze mechanische krachten kunnen activeren kracht-gevoelige signalering moleculen en de vorming van de trabecular rimpels veroorzaken. Vanwege de toegevoegde tijd aspect voor 4-D imaging is het kundig voor bijhouden van wijzigingen in ontwikkeling in realtime, die kunnen leiden tot nieuwe onthullingen dat eerder onopgemerkt was gegaan. De zebravis is een ideaal model voor imaging omdat wetenschappers een hele gewervelde dier versus alleen cel-cel interacties kunnen observeren. Zuurstof kan ook diffuus door het gehele embryo, waarmee de ontwikkeling optreden zonder afhankelijk van het vaatstelsel, in tegenstelling tot bij zoogdieren ontwikkeling. Hoewel de zebravis hart de pulmonaire organen, waarvoor een vier-chambered hart ontbreekt, is er een groot aantal cardiale genen die tussen zebravis en mensen21zijn bewaard.
In dit manuscript beschrijven we het gebruik van licht-blad fluorescentie microscopie om het imago van de ontwikkelingslanden trabeculae in zebrafish hart onder verschillende omstandigheden. Ten eerste injectie van gata1a4 of tnnt2a5 Mnd werden gebruikt om lager de viscositeit van het bloed, en dus WSS. De morfologie van het hart werd vervolgens opgenomen. In een afzonderlijke groep van vissen, we de WSS verhoogd door het toedienen van de EOB mRNA6 of isoproterenol7 en de resultaten waargenomen. We voerde ook een onderzoek van de cel met een verschillende gepulseerde of oscillerende spuitsnelheid. Na elke groep imaging, vonden we dat WSS gevoeld door het endocard via Notch signalering ingewijden trabeculation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clontech Hifi PCR pre-mix&#160;</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td>639298</td>
			<td>PCR mastermix 
			1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Nrg1 cDNA</td>
			<td>Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for trabeculation rescue 
			1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect&#8482; Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>PCR Machine 
			1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2+</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid used to synthesize mRNA 
			1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin purification kit&#160;&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740609.25</td>
			<td>DNA Purification 
			1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>2011A</td>
			<td>PCR Ligation solution 
			1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellar competent cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>636763</td>
			<td>E. coli cells used for transformation 
			1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent 
			1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage SP6 kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>Kit used to synthesize mRNA 
			1.1.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
			<td>Purifies RNA&#160; 
			1.1.6.4, 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTools 4.3.8</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for primer design 
			1.2.1, 3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO cDNA</td>
			<td>Creative Biogene</td>
			<td>CDFH006026</td>
			<td>Increases WSS 
			1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG1478</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T4182</td>
			<td>ErbB inhibitor 
			1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To grow embryos 
			1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5942</td>
			<td>&#947;-secretase inhibitor 
			1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Used for mounting embryos 
			2.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 LT&#160;Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td>Used to capture Images 
			2.1.1.2, 2.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>FEI Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 
			2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaone mesylate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>Used to humanely sedated or sacrifice embryos 
			3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>Synthesizes cDNA 
			3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>Microcentrifuge 
			4.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI254023X</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>260264-93-5</td>
			<td>ADAM10 inhibitor 
			4.1.2, 4.1.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Isoproterenol increases WSS 
			5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cardiac mechanics analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart

De hemodynamische krachten, ervaren door de hart invloed cardiale ontwikkeling, vooral trabeculation, die een netwerk van vertakkende uitwassen van het myocardium vormt. Genetische programma gebreken in de inkeping signalering trapsgewijs zijn betrokken bij ventriculaire gebreken zoals links ventriculaire Non-compactie cardiomyopathie of Hypoplastic links hart syndroom. Met behulp van dit protocol, kan het worden bepaald dat de schuifspanning gedreven trabeculation en Notch signalering zijn gerelateerd aan elkaar. Met behulp van licht vel fluorescentie microscopie, was visualisatie van het ontwikkelende zebrafish hart mogelijk. In dit manuscript, het was beoordeeld of hemodynamische krachten moduleren van de opening van trabeculation via Notch signalering en dus, invloed contractiele functie optreedt. Voor kwalitatieve en kwantitatieve schuintrekken spanningsanalyse, 4-D (3-D + tijd) beelden werden verworven tijdens de zebravis cardiale genuitdrukking en geïntegreerde licht-blad fluorescentie microscopie met 4-D synchronisatie veroverde de ventriculaire motie. Bloed viscositeit werd verminderd via gata1a- morfolino oligonucleotides (MO) micro-injectie te verminderen schuifspanning, daarmee Notch signalering en verzachtende trabeculation down-regulering. Co injectie van Nrg1 mRNA met gata1a MO gered Notch-gerelateerde genen om te herstellen van trabeculation. Om te bevestigen schuifspanning gedreven Notch signalering invloeden trabeculation, gearresteerd cardiomyocyte contractie verder via tnnt2a-MO om hemodynamische krachten, daarmee Notch doelgenen down-regelen om een niet-trabeculated myocard. Ten slotte werd datanauwkeurigheid van de expressiepatronen van shear stress-responsieve Notch genen uitgevoerd door endotheliale cellen te onderwerpen aan gepulseerde stroom. Dus, de microscopie van de licht-blad 4-D ontdekt hemodynamische krachten onderliggende Notch signalering en trabeculation met klinische relevantie voor non-compactie cardiomyopathie.

LSFM werd gebruikt in dit manuscript om verwerven van hoge resolutie 2D en 3D-afbeeldingen. Zoals te zien in figuur 1A en 1B, regisseert de verlichting lens het lichte blad op het monster. Vanwege de dunheid van het lichte blad, slechts een enkel vliegtuig brandt. De detectie-lens is gepositioneerd loodrecht op de lens van de verlichting en is gericht op het verlichte vlak (figuur 1B). Het lichte blad van de verl...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Cel analyse van Shear Stress voortleven Pseudomonas aeruginosa met behulp van een geautomatiseerde hoger-Throughput Microfluidic systeem

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mechanische karakteristieken van Atrioventriculaire hartkleppen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...