Name: light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

著者は人間を提供するためスタンフォード大学からウィリアム ・ タルボットに感謝の意を表したいと思いますNrg1cDNA とを提供するための UCSD からデボラ ・ Yelon、wea変異体。著者も感謝したいシンシア陳画像の取得で助けるため。この研究は (t. k. Hsiai) に NIH の HL118650 の補助金によって支えられました (t. k. Hsiai) に HL083015、HD069305 (ノースカロライナ州チーと t. k. Hsiai.) に、(t. k. Hsiai、ノースカロライナ州 Chi) に HL111437 (t. k. Hsiai) に HL129727、(r. r. Sevag パッカード) に T32HL007895 (V. メッサーシュ ミット) に HL 134613 と(J. リー) へ星をテキサス州の資金の大学.

次の方法は、うたと UCLA IACUC プロトコルに準拠して行った。これらの実験グループ トランスジェニックTg(cmlc2:gfp)、使用されたwea (弱いアトリウム) 、 clo (cloche)変異体: (a) 野生型 (WT) 制御、(b) gata1aミズーリ、および (c) tnnt2a MO 注射 (表 1)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>モデル</td>
	...

<ol>
	<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+domain+computational+fluid+dynamics+to+interface+with+an+embryonic+model+of+cardiac+morphogenesis.">Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis.</a> PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).</li><li>Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+cardiac+trabeculation+on+neuregulin+signaling+and+blood+flow+in+zebrafish.">Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+is+required+to+preserve+cardiac+chamber+morphology.">Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110 (7), 2718 (2007).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Scientific Reports. 4, 4898 (2014).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+role+for+ErbB2+signaling+in+cardiac+trabeculation.">A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation.</a> Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).</li><li>Samsa, L. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Kelley, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloche,+an+early+acting+zebrafish+gene,+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages.">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+(SPIM).">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li></ol>

このプロトコルでは、我々 は 4 D イメージングを生体力学的力の変化に対応した骨梁ネットワークの発展を追跡する使用ことができることを示しています。特に、血管内皮細胞による経験豊富な剪断応力は、ノッチ シグナル伝達カスケードは、順番に肉を促進するを開始します。本稿では、我々 は、(1) gata1a MO 注入減少造血、したがってそれは壁面せん断応力を減少、抑制 (2) tnnt2a...

血行動態のせん断応力などの生体力学的力は心臓の形態形成に密接に関与しています。血行動態のせん断力に対し、心筋の隆起部分および溝は房室 (AV) 弁1にわたってせん断応力の方向と配置で波のような骨梁ネットワークで開発します。心臓肉収縮機能と心筋質量2を増加する必要があります。Notch シグナルの突然変異の結果人間および他の脊椎動物3先天性心疾患。たとえば、 gata1a4 、 tnnt2a5 morpholino オリゴヌクレオチド (MO) は、エリスロポエチン (EPO) mRNA6とイソプロテレノール (ISO)7増加赤血球、赤血球を減らすために示されています。セルと心拍数, その壁せん断応力 (WSS)。さらに、ErbB2 下流シグナリング、ノッチ、促進する心筋細胞の増殖と分化、Notch シグナル8,9を起動収縮力を生成します。そのせん断応力が Notch シグナル心室開発の駆動肉を支配するをお勧めします。現在、さらに先天性心臓欠陥 (CHD)10、11,12につながる遺伝的プログラミング イベントを理解しようと多くの研究がありますが、ほとんどの調査はどのように機械力形成の心に影響を与えます。
機械の力を調査するために発達期間中に観察、心内膜に作用を実装する必要があります。しかし生体内で伝統的な顕微鏡13の内属のためサンプルを破っての質の良い画像を取得するために挑戦です。物理的な区分および染色はサンプル内で時間をかけて開発を観察するために、したがって、13,14,15を発生する必要。共焦点顕微鏡画像サンプル14,16の 3次元構造に用い、これらのイメージング システムの取得まだ遅いスキャン速度によって制限されます。
光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、動的イベント長い作業距離13で生体内での可視化を可能にするユニークなイメージング手法です。この技法は、サンプル17を光学セクションのライト シート蛍光顕微鏡を使用します。サンプルに光の薄いシートのみの照明、写真漂白、写真毒性13,18削減あります。ビューと長作動距離の大きい分野は、大きなサンプル画像13,14,17ありのままそのままをことができます。低倍率で、永い間、イメージを作成する大きい区域は、作動距離厚いサンプル信号対雑音比を損なうことがなくイメージを作成することができます。多くのグループ、画像全体胚17に LSFM を使用して脳14,18筋肉と心19他の組織の中で多様なイメージを作成することができますのサンプルを示します。
前の研究は、ゼブラフィッシュ心臓の流入または流出のトラックを遮蔽して減らされた血行力学的せん断力を実証、情報はもっぱら定性的です。それによって異常な第 3 室、減少心臓ループと障害弁形成20。4 D の LSFM 画像は、心臓組織の開発血行動態のせん断力に影響を与える方法に新しい視点を与えます。これらの機械力が敏感なシグナリング分子をアクティブにし、骨の隆起部分の形成を誘導します。4 D イメージングの追加時間の側面、ためこれまで見過ごされていた新しい啓示につながる可能性がリアルタイムでの変化を追跡することであります。ゼブラフィッシュ イメージング科学者は、細胞間の相互作用だけ対全体の脊椎動物を観察できるための理想的なモデルであります。酸素もなしに行われる血管システムに応じてとは異なり哺乳類の開発の開発を可能にする全体の胚を介して拡散します。ゼブラフィッシュ心臓 4 chambered 中心、肺の器官を欠いているにもかかわらず、ゼブラフィッシュと人間21の間保存されている心臓の遺伝子の数が多いがあります。
本稿では、ゼブラフィッシュの心のさまざまな状況で発展途上の梁をイメージさせるライト シート蛍光顕微鏡を使用する方法をについて説明します。まず、 gata1a4 tnnt2a5の注射 MOs は低血液粘度と WSS に使用されました。心臓の形態を記録しただった。魚の別のグループ、 EPO mRNA6またはイソプロテレノール7を管理することにより、WSS を増やし、結果を観察しました。異なる脈動や振動流量と細胞の調査を実施しました。各グループをイメージング、わかった WSS をノッチによる心内膜で感じたこと開始肉をシグナリングします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clontech Hifi PCR pre-mix&#160;</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td>639298</td>
			<td>PCR mastermix 
			1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Nrg1 cDNA</td>
			<td>Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for trabeculation rescue 
			1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect&#8482; Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>PCR Machine 
			1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2+</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid used to synthesize mRNA 
			1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin purification kit&#160;&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740609.25</td>
			<td>DNA Purification 
			1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>2011A</td>
			<td>PCR Ligation solution 
			1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellar competent cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>636763</td>
			<td>E. coli cells used for transformation 
			1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent 
			1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage SP6 kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>Kit used to synthesize mRNA 
			1.1.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
			<td>Purifies RNA&#160; 
			1.1.6.4, 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTools 4.3.8</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for primer design 
			1.2.1, 3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO cDNA</td>
			<td>Creative Biogene</td>
			<td>CDFH006026</td>
			<td>Increases WSS 
			1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG1478</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T4182</td>
			<td>ErbB inhibitor 
			1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To grow embryos 
			1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5942</td>
			<td>&#947;-secretase inhibitor 
			1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Used for mounting embryos 
			2.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 LT&#160;Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td>Used to capture Images 
			2.1.1.2, 2.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>FEI Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 
			2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaone mesylate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>Used to humanely sedated or sacrifice embryos 
			3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>Synthesizes cDNA 
			3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>Microcentrifuge 
			4.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI254023X</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>260264-93-5</td>
			<td>ADAM10 inhibitor 
			4.1.2, 4.1.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Isoproterenol increases WSS 
			5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cardiac mechanics analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart

血行動態の軍によって心臓の影響心臓開発、特に肉は、分岐増生心筋からのネットワークを形成する経験します。ノッチ シグナル伝達カスケードは心室欠損症左室非圧縮の心筋症や左心低形成症候群などに関与しているの欠陥の遺伝的プログラム.このプロトコルを使用して、それを決定できます駆動せん断応力肉と Notch シグナルは互いに関連しています。光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の開発の可視化は可能だった。本稿では、それは血行力 Notch シグナルによる肉の開始を調節してしたがって、収縮機能に影響を与えるかどうかが評価されたに発生します。質的・量的にせん断応力解析、4 D (3-D + 時間) ゼブラフィッシュ心臓の形態形成時に得られた画像と 4 D 同期統合光シート蛍光顕微鏡は心室拍動を捕獲しました。血液粘度ではそれにより、せん断応力を減少する - morpholino gata1a(MO) のオリゴヌクレオチド マイクロ射出成形を介してダウン調整ノッチ シグナル伝達と減衰の肉が減った。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、肉を復元するノッチ関連遺伝子を救出しました。Notch シグナルを駆動せん断応力影響肉を確認する心筋細胞の収縮はさらにtnnt2a経由で逮捕された -MO、それにより血行力を減らすために非 trabeculated を開発するノッチ標的遺伝子をダウン調整心筋。最後に、せん断応力応答ノッチ遺伝子の発現パターンの確証は、内皮細胞を拍動流に服従させることによって行なわれました。したがって、4 D ライト シート顕微鏡は非圧縮の心筋症に臨床的意義と Notch シグナルと肉を基になる血行力を発見しました。

LSFM は、高解像度の 2 D と 3 D の画像を取得するためにこの原稿で使用されました。図 1 aおよび1 bに見られるように照明レンズはサンプルで光シートを指示します。光シートの薄さ、ため 1 つの平面だけが点灯します。検出レンズ照明レンズに垂直に配置されたは、照らされた面 (図 1 b) に焦点を当てた。照明?...

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Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch シグナルをアクティブに示します。

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

房室弁の二軸の機械特性

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...