Name: light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить благодарность Уильям Талбот Стэнфордского университета для предоставления человека Nrg1 cDNA и Дебора Yelon от UCSD для обеспечения WEA мутантов. Авторы хотели бы также поблагодарить за помощь с приобретением изображений Синтия Чэнь. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (к Hsiai т.к.), HL083015 (к Hsiai т.к.), HD069305 (чтобы оплата Чи и т.к. Hsiai.), HL111437 (к Hsiai т.к. и оплата Чи), HL129727 (к Hsiai т.к.), T32HL007895 (для р.р. Севак Packard), 134613 HL (чтобы V. Мессершмидта) и Университет Техаса системы звезды финансирования (Джей ли).

Следующие методы были исполнены в соответствии с протоколами Ута и UCLA IACUC. Эти экспериментальные группы были использованы с трансгенных Tg(cmlc2:gfp), wea (слабый Атриум) или clo (cloche) мутантов: управления () одичал тип (WT), (b) gata1a MO и (c) tnnt2a MO инъекции (Таблица 1).
<table...

<ol>
	<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+domain+computational+fluid+dynamics+to+interface+with+an+embryonic+model+of+cardiac+morphogenesis.">Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis.</a> PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).</li><li>Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+cardiac+trabeculation+on+neuregulin+signaling+and+blood+flow+in+zebrafish.">Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+Not+Gata2+Converts+Erythropoiesis+to+Myelopoiesis+in+Zebrafish+Embryos.">Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos.</a> Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+is+required+to+preserve+cardiac+chamber+morphology.">Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110 (7), 2718 (2007).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Scientific Reports. 4, 4898 (2014).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+role+for+ErbB2+signaling+in+cardiac+trabeculation.">A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation.</a> Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).</li><li>Samsa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contraction+activates+endocardial+Notch+signaling+to+modulate+chamber+maturation+in+zebrafish.">Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish.</a> Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521, 520 (2015).</li><li>Sifrim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+genetic+architectures+for+syndromic+and+nonsyndromic+congenital+heart+defects+identified+by+exome+sequencing.">Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing.</a> Nature Genetics. 48, 1060 (2016).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+two+risk+loci+for+congenital+heart+malformations+in+Han+Chinese+populations.">A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations.</a> Nature Genetics. 45, 818 (2013).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+confocal+microscopy+and+quantitative+4D+image+analysis+of+anchor-cell+invasion+through+the+basement+membrane+in+Caenorhabditis+elegans.">Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 12, 2081 (2016).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Lavagnino, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+(x-y-z-t)+imaging+of+thick+biological+samples+by+means+of+Two-Photon+inverted+Selective+Plane+Illumination+Microscopy+(2PE-iSPIM).">4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM).</a> Scientific Reports. 6, 23923 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007 (2004).</li><li>Hove, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracardiac+fluid+forces+are+an+essential+epigenetic+factor+for+embryonic+cardiogenesis.">Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis.</a> Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>BioRad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General Protocol for Western Blotting. 6376, (2018).</li><li>GeneTools. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Tools Oligo Design Website. , (2018).</li><li>Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish Course. , (2013).</li><li>Grenander, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Probability and Statistics: The Harald Cram&#233;r Volume. , (1959).</li><li>Fei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Light-Sheet+Fluorescent+Microscopy+for+Multi-Scale+and+Rapid+Imaging+of+Architecture+and+Function.">Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function.</a> Scientific Reports. 6, 22489 (2016).</li><li>Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+cardiac+imaging+in+living+embryos+via+postacquisition+synchronization+of+nongated+slice+sequences.">Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).</li><li>Adeoye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+exogenous+enzymes+and+probiotic+on+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+growth,+intestinal+morphology+and+microbiome.">Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome.</a> Aquaculture. 463, 61-70 (2016).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+Euthanasia+in+Zebrafish.">Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Dissection+in+Larval,+Juvenile+and+Adult+Zebrafish,+Danio+rerio.">Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+Flow+Induces+Autophagy,+but+Impairs+Autophagic+Flux+to+Perturb+Mitochondrial+Homeostasis.">Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Stress-Activated+Wnt-Angiopoietin-2+Signaling+Recapitulated+Vascular+Repair+in+Zebrafish+Embryos.">Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).</li><li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-Responsive+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-Protein+Kinase+C+Isoform+Epsilon+Signaling+Mediates+Glycolytic+Metabolites+for+Vascular+Repair.">Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).</li><li>Vermot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+blood+flows+act+through+klf2a+to+ensure+normal+valvulogenesis+in+the+developing+heart.">Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart.</a> PLoS Biol. 7 (11), (2009).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+essential+for+ventricular+chamber+development.">Notch signaling is essential for ventricular chamber development.</a> Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).</li><li>Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+weak+atrium/atrial+myosin+heavy+chain+disrupts+atrial+function+and+influences+ventricular+morphogenesis+in+zebrafish.">Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish.</a> Development. 130 (24), 6121 (2003).</li><li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiologic+dissection+of+the+vertebrate+cardiac+conduction+system.">Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system.</a> PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation.">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. 124 (2), 381-389 (1997).</li><li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloche,+an+early+acting+zebrafish+gene,+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages.">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+(SPIM).">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li></ol>

В этом протоколе мы показали, что 4-D изображений может использоваться для отслеживания развития трабекулярной сети в ответ на изменения в биомеханических сил. В частности касательное напряжение опытных эндотелиальных клеток инициирует паз, сигнальный Каскад, который в свою очередь сп...

Биомеханические сил, например гемодинамики при сдвиге, тесно вовлечены в сердечной морфогенеза. В ответ на гемодинамические сдвига миокарда гребней и пазов развиваются в волнообразных трабекулярной сети в соответствие с направлением касательное напряжение через предсердно (AV) клапан1. Сердца trabeculation необходимо увеличить сократительной функции и миокарда массовые2. Мутации в паз, сигнальные пути привести врожденных пороков сердца в организме человека и других позвоночных3. Например было показано, уменьшить эритропоэза, эритропоэтин (ЭПО) мРНК6 и7 Isoproterenol (ISO) увеличение красных кровяных gata1a4 и tnnt2a5 Морфолино олигонуклеотиды (MO) клетки и сердечного ритма соответственно и поэтому стены касательное напряжение (WSS). Кроме того ErbB2 сигнализации, вниз по течению выемки, способствует cardiomyocyte пролиферации и дифференцировки сформировать сократительной силы, которая в свою очередь активирует Notch сигнализации8,9. Он предложил что касательное напряжение регулирует Notch сигнализации приводом trabeculation желудочков развития. В настоящее время, существует множество исследований, которые пытаются понять генетического программирования событий, приведших к сердца врожденные дефекты (CHD)10,11,12, но очень мало изучают как формируя сердце влияние механических сил.
Для того чтобы расследовать механических сил, действующих на эндокарда, тщательное наблюдение в период развития должна осуществляться. Однако это является сложной задачей для получения хорошего качества изображения в vivo избиение образцы из-за наследования традиционных микроскопии13. Для того, чтобы наблюдать за развитием со временем в рамках выборки, физические секционирование и окрашивание, поэтому, должны произойти13,14,15. Хотя конфокальная микроскопия широко используется для изображения 3-D структуры образцов14,16, приобретение этих тепловизионных систем по-прежнему ограничивается медленной скорости сканирования.
Свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) это уникальный изображений техника, которая позволяет визуализировать в естественных условиях динамических событий с длиной рабочей расстояние13. Этот метод использует свет лист флуоресцентной микроскопии для оптически раздел пример17. Из-за освещения только тонкого листа света на образце является снижение отбеливание фото и фото токсичности13,18. Большое поле зрения и рабочим расстоянием позволяет для больших образцов остаются нетронутыми, поскольку они фотосъемка13,14,17. Низкий масштаб позволяет для большей площади для записи образа, а длинный рабочее расстояние позволяет толще образцов для записи образа без ущерба для отношение сигнал шум. Многие группы использовали LSFM для изображения, все эмбрионы17, мозги14,18, мышц и сердца19 среди других тканей, показаны различные виды образцов, которые могут быть образы.
Хотя предыдущие исследования показали снижение гемодинамического поперечной силы поглощения приток или отток треков сердца данио рерио, информация является исключительно качественные. Это приводит к ненормальной третьей камеры, снижение сердечного цикла и нарушением клапан формирования20. 4-D LSFM изображения дают новую перспективу в гемодинамических сдвига силы влияют на путь развития сердечной ткани. Эти механических сил может активировать силы чувствительных сигнальных молекул и стимулировать формирование трабекулярной хребтов. Из-за добавленного времени аспект 4-D изображений одна способна отслеживать изменения в развитии в режиме реального времени, что может привести к новые откровения, которые ранее незамеченным. Данио рерио является идеальной моделью для визуализации потому, что ученые могут наблюдать весь позвоночных животных против только ячеек взаимодействий. Кислород может также диффузных через весь эмбриона, который позволяет развитие происходит без зависимости от сосудистой системы, в отличие от млекопитающих развития. Даже несмотря на то, что сердце данио рерио не хватает легких органов, которые требуют четыре-сердце, существует большое количество сердца генов, которые сохраняются между21данио рерио и людей.
В этой рукописи мы опишем, как использовать свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения развивающихся трабекулы в zebrafish сердца при различных обстоятельствах. Во-первых инъекции gata1a4 или tnnt2a5 MOs были использованы для ниже вязкости крови и поэтому WSS. Морфологии сердца, затем был записан. В отдельную группу рыб мы увеличилось WSS управляющими ЕПВ мРНК6 или isoproterenol7 и отметила результаты. Мы также провели исследование клеток с различными пульсирующего или колебательных расхода. После визуализации каждой группы, мы обнаружили, что WSS воспринимается эндокарда через выемку сигнализации начинает trabeculation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clontech Hifi PCR pre-mix&#160;</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td>639298</td>
			<td>PCR mastermix 
			1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Nrg1 cDNA</td>
			<td>Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for trabeculation rescue 
			1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect&#8482; Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>PCR Machine 
			1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2+</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid used to synthesize mRNA 
			1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin purification kit&#160;&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740609.25</td>
			<td>DNA Purification 
			1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>2011A</td>
			<td>PCR Ligation solution 
			1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellar competent cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>636763</td>
			<td>E. coli cells used for transformation 
			1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent 
			1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage SP6 kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>Kit used to synthesize mRNA 
			1.1.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
			<td>Purifies RNA&#160; 
			1.1.6.4, 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTools 4.3.8</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for primer design 
			1.2.1, 3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO cDNA</td>
			<td>Creative Biogene</td>
			<td>CDFH006026</td>
			<td>Increases WSS 
			1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG1478</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T4182</td>
			<td>ErbB inhibitor 
			1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To grow embryos 
			1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5942</td>
			<td>&#947;-secretase inhibitor 
			1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Used for mounting embryos 
			2.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 LT&#160;Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td>Used to capture Images 
			2.1.1.2, 2.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>FEI Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 
			2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaone mesylate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>Used to humanely sedated or sacrifice embryos 
			3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>Synthesizes cDNA 
			3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>Microcentrifuge 
			4.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI254023X</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>260264-93-5</td>
			<td>ADAM10 inhibitor 
			4.1.2, 4.1.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Isoproterenol increases WSS 
			5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cardiac mechanics analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart

Гемодинамические силы сталкиваются сердце влияние сердца развития, особенно trabeculation, который образует сеть ветвления наросты от миокарда. Генетическая программа дефекты в паз, сигнальный Каскад занимаются такие левого желудочка Non-уплотнение кардиомиопатия или синдром сердца гипоплазии левого желудочков дефекты. Используя этот протокол, можно определить, что касательное напряжение инициативе trabeculation и Notch сигнализации связаны друг с другом. С помощью микроскопии флуоресцирования свет лист, Визуализация развивающихся данио рерио сердца было возможно. В этой рукописи, она оценивалась ли гемодинамики силы модулировать начало trabeculation через выемку сигнализации и таким образом, влияние сократительной функции происходит. Для качественного и количественного сдвига стресс анализ, 4-D (3-D + время) изображения были приобретены во время данио рерио сердца морфогенеза и комплексной света лист флуоресцентной микроскопии с 4-D синхронизации захватили желудочков движения. Вязкость крови был сокращен через gata1a- Морфолино олигонуклеотиды (MO) микро инъекции для уменьшения напряжения сдвига, тем самым, вниз регулирующие выемку сигнализации и смягчающих trabeculation. Совместное инъекций Nrg1 мРНК с gata1a MO спасли Notch связанных генов для восстановления trabeculation. Для подтверждения инициативе Notch сигнализации при сдвиге влияния trabeculation, сокращение cardiomyocyte далее был арестован через tnnt2a-MO для уменьшения гемодинамики силы, тем самым, вниз регулирующие выемку целевых генов для разработки не trabeculated миокард. Наконец подтверждения, выражений шаблонов касательное напряжение отзывчивым Notch генов было проведено подвергать пульсирующего потока эндотелиальных клеток. Таким образом микроскопия свет лист 4-D непокрытый гемодинамики силы лежащие в основе Notch сигнализации и trabeculation с клинической значимости для не уплотнение кардиомиопатии.

LSFM был использован в этой рукописи для того, чтобы приобрести 2-D и 3-D изображений с высоким разрешением. Как видно на рисунке 1A и 1B, освещение объектива направляет свет лист на образец. Из-за тонкости света листа горит только одной плоскости. Лин?...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Здесь мы представляем протокол для визуализации разработки сердца в zebrafish в 4-измерениях (4-D). 4-D изображений, через свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM), занимает 3-мерных изображений (3-D) со временем, чтобы реконструировать развивающихся сердца. Мы покажем, и количественно и качественно, касательное напряжение активирует эндокарда Notch сигнализации во время разработки камеры, которая способствует сердечной trabeculation.

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Низкая молекулярная масса белка Обогащение на мезопористых тонких пленок кремния для биомаркеров Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Анализ выражения гена эндотелиальных клеток, подвергается сдвига стресс с помощью нескольких камер параллель плита потока

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Жить анализа клеток касательное напряжение на синегнойной палочки с помощью автоматизированной системы Microfluidic высшее-пропускная способность

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Двухосная механические характеристики Предсердно-желудочковые клапаны

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Высокой пропускной силы тяги Микроскопия использованием PDMS показывает доз-зависимые эффекты преобразования фактор роста-я на Эпителиальный-к-мезенхимальный переход

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...