Name: light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Los autores desean agradecer a William Talbot de la Universidad de Stanford para proporcionar al ser humano Nrg1 cDNA y Deborah Yelon de UCSD para proporcionar la WEA mutantes. Los autores también desean agradecer a Cynthia Chen por ayudar con la adquisición de la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (a Carolina del norte Chi y T.K. Hsiai.), HL111437 (a T.K. Hsiai y Chi de Carolina del norte), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (a V. Messerschmidt) y Universidad de Texas sistema estrellas financiación (J. Lee).

Los métodos siguientes se realizaron en cumplimiento de protocolos de UTA y UCLA IACUC. Estos grupos experimentales fueron utilizados con transgénicos Tg(cmlc2:gfp), los mutantes wea (atrio débil) o clo (cloche) : (a) tipo salvaje (WT) control, (b) gata1a MO y (c) tnnt2a MO inyecciones (tabla 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modelo</td>
			<td>Nombre</...

<ol>
	<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+domain+computational+fluid+dynamics+to+interface+with+an+embryonic+model+of+cardiac+morphogenesis.">Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis.</a> PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).</li><li>Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+cardiac+trabeculation+on+neuregulin+signaling+and+blood+flow+in+zebrafish.">Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+(SPIM).">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li></ol>

En este protocolo, hemos demostrado que la proyección de imagen 4-D puede utilizarse para rastrear el desarrollo de una red trabecular en respuesta a cambios en las fuerzas biomecánicas. En particular, la tensión de corte experimentado por las células endoteliales inicia la muesca señalización cascada, que a su vez promueve la trabeculación. En este manuscrito, hemos demostrado que (1) gata1a MO inyección disminuyó la hematopoyesis y por lo tanto redujo la tensión de esquileo de la pared, (2) tnnt2...

Fuerzas biomecánicas, como hemodinámica tensión de esquileo, están involucradas íntimamente en la morfogénesis cardiaca. En respuesta a las fuerzas de corte hemodinámica, surcos y crestas miocardio desarrollan en una red trabecular ondulatorio en alineación con la dirección de la tensión de esquileo en el auriculoventricular (AV) válvula1. Trabeculación cardiaca es necesario aumentar la función contráctil y masa miocárdica2. Mutaciones en vías de señalización Notch dan lugar a defectos congénitos del corazón en los seres humanos y otros vertebrados3. Por ejemplo, gata1a4 y tnnt2a5 morfolino oligonucleótidos (MO) han demostrado reducir la eritropoyesis, mientras aumenta el de mRNA (EPO) la eritropoyetina6 y7 de Isoproterenol (ISO) rojos de la sangre las células y la frecuencia cardíaca respectivamente y por lo tanto la pared tensión de esquileo (WSS). Además, señalización de ErbB2, aguas abajo de la muesca, promueve la proliferación de los cardiomiocitos y la diferenciación para generar la fuerza contráctil, que a su vez activa la muesca señalización8,9. Se sugiere que tensión de esquileo gobierna conducido trabeculación ventricular desarrollo de señalización de Notch. Actualmente, hay muchos estudios que intentan comprender aún más los eventos programación genéticos conduce a cardiopatía congénita (CHD) de defectos10,11,12, pero muy poco están investigando cómo fuerzas mecánicas influyen en el centro de formación.
Para investigar las fuerzas mecánicas actuando sobre el endocardio, una observación más cercana durante el período de desarrollo debe aplicarse. Sin embargo, es difícil obtener imágenes de buena calidad en vivo a las muestras debido a la injerencia de microscopía tradicional13. Para observar el desarrollo en el tiempo dentro de una muestra, física de seccionamiento y coloración, por lo tanto, deben ocurrir13,14,15. Aunque la microscopía confocal es ampliamente utilizada a la imagen de la estructura 3D de las muestras14,16, adquisición de estos sistemas de imagen todavía está limitado por bajas velocidades de barrido.
Microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM) es una única técnica de imagen que permite visualizar en vivo eventos dinámicos con largos de distancia de trabajo13. Esta técnica utiliza un microscopio fluorescente de luz de hoja a la sección ópticamente una muestra17. Debido a la iluminación de solo una hoja fina de la luz sobre la muestra, hay una reducción en el blanqueo de foto y foto toxicidad13,18. El gran campo de visión y distancia de funcionamiento larga permite muestras grandes a permanecer intacto como imagen13,14,17. La ampliación baja permite un área más grande al ser reflejada, mientras que la larga distancia de trabajo permite para que muestras más gruesas ser reflejada sin comprometer la relación señal a ruido. Muchos grupos han utilizado LSFM a imagen todo embriones17, cerebros de14,18, músculos y corazón19 entre otros tejidos, mostrando los diversos tipos de muestras que pueden ser reflejadas.
Aunque investigaciones previas demostraron fuerza hemodinámica reducida por oclusión de las vías de entrada o salida del corazón del pez cebra, la información es exclusivamente cualitativa. Traduce en una sala tercera anormal, bucle cardiaca disminuida y válvula deteriorada formación20. Las imágenes de 4D LSFM dan una nueva perspectiva en la manera de que la cizalla hemodinámica las fuerzas afectan el desarrollo del tejido cardiaco. Estas fuerzas mecánicas pueden activar moléculas de señalización sensibles a la fuerza e inducir la formación de las crestas trabeculares. Por el aspecto de mayor tiempo de proyección de imagen de 4-D, uno es capaz de seguir los cambios en el desarrollo en tiempo real, que podría conducir a nuevas revelaciones que habían pasado desapercibidas anteriormente. El pez cebra es un modelo ideal para la proyección de imagen porque los científicos pueden observar un animal vertebrado todo versus sólo interacciones de célula. Oxígeno puede difundir también por el embrión completo, que permite el desarrollo que se produzca sin dependiendo del sistema vascular, a diferencia de en el desarrollo de mamífero. A pesar de que el corazón del pez cebra carece de los órganos pulmonares, que requieren un corazón de cuatro cámaras, hay un gran número de genes cardíacos que se conservan entre el pez cebra y los seres humanos21.
En este manuscrito, se describe cómo utilizar microscopía de fluorescencia de la hoja de luz a la imagen de las trabéculas en desarrollo en el corazón del pez cebra bajo circunstancias diversas. En primer lugar, la inyección de gata1a4 o tnnt2a5 MOs utilizaron para baja la viscosidad de la sangre y por lo tanto WSS. Luego se registró la morfología del corazón. En un grupo separado de los peces, aumentamos el WSS mediante la administración de EPO mRNA6 o isoproterenol7 y observa los resultados. También se realizó un estudio de la célula con las tasas de flujo pulsátil u oscilatoria diferente. Después de cada grupo de imágenes, encontramos que WSS percibido por el endocardio mediante muesca señalización inicia trabeculación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clontech Hifi PCR pre-mix&#160;</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td>639298</td>
			<td>PCR mastermix 
			1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Nrg1 cDNA</td>
			<td>Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for trabeculation rescue 
			1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect&#8482; Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>PCR Machine 
			1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2+</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid used to synthesize mRNA 
			1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin purification kit&#160;&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740609.25</td>
			<td>DNA Purification 
			1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>2011A</td>
			<td>PCR Ligation solution 
			1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellar competent cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>636763</td>
			<td>E. coli cells used for transformation 
			1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent 
			1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage SP6 kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>Kit used to synthesize mRNA 
			1.1.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
			<td>Purifies RNA&#160; 
			1.1.6.4, 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTools 4.3.8</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for primer design 
			1.2.1, 3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO cDNA</td>
			<td>Creative Biogene</td>
			<td>CDFH006026</td>
			<td>Increases WSS 
			1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG1478</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T4182</td>
			<td>ErbB inhibitor 
			1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To grow embryos 
			1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5942</td>
			<td>&#947;-secretase inhibitor 
			1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Used for mounting embryos 
			2.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 LT&#160;Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td>Used to capture Images 
			2.1.1.2, 2.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>FEI Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 
			2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaone mesylate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>Used to humanely sedated or sacrifice embryos 
			3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>Synthesizes cDNA 
			3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>Microcentrifuge 
			4.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI254023X</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>260264-93-5</td>
			<td>ADAM10 inhibitor 
			4.1.2, 4.1.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Isoproterenol increases WSS 
			5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cardiac mechanics analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart

Las fuerzas hemodinámicas experimentadas por el desarrollo cardíaco corazón influencia, especialmente trabeculación, que forma una red de ramificación crecimientos del miocardio. Programa genético de defectos en la muesca de señalización cascada participan en defectos ventriculares como cardiomiopatía no compactación Ventricular izquierda o síndrome de corazón izquierdo hipoplásico. Mediante este protocolo, puede determinarse que tensión de esquileo conducido trabeculación y señalización Notch están relacionados con uno otro. Usando microscopía de fluorescencia de luz-hoja, visualización del corazón de pez cebra en desarrollo era posible. En este manuscrito, se evaluó si las fuerzas hemodinámicas modulan el inicio de la trabeculación vía de señalización Notch y por lo tanto, influyen en la función contráctil se produce. Cualitativa y cuantitativa del esquileo tensión análisis, 4-D (3-D + tiempo) imágenes fueron adquiridas durante la morfogénesis cardiaca de pez cebra, y de microscopía de fluorescencia de luz hoja integrada con 4 D sincronización capturado el movimiento ventricular. Viscosidad de la sangre se redujo gata1a- morfolino oligonucleótidos (MO) micro-inyectable para disminuir la tensión de esquileo, de tal modo, abajo-regulación de la muesca señalización y atenuando trabeculación. La inyección de mRNA de Nrg1 con gata1a MO rescatado genes relacionados con la muesca para restaurar trabeculación. Para confirmar la tensión de esquileo por señalización Notch influencias trabeculación, contracción de cardiomiocitos más fue detenida por tnnt2a-MO para reducir las fuerzas hemodinámicas, por lo tanto, abajo-regulan genes de la blanco del muesca para desarrollar no trabeculada miocardio. Por último, corroboración de los patrones de expresión de genes sensibles a la tensión de esquileo de muesca se realizó sometiendo las células endoteliales a flujo pulsátil. Así, la microscopía de luz-hoja 4-D al descubierto las fuerzas hemodinámicas subyacentes de señalización Notch y trabeculación con importancia clínica a la cardiomiopatía no compactación.

LSFM fue utilizado en este manuscrito para adquirir 2-D y 3-d imágenes de alta resolución. Como se ve en la figura 1A y 1B, el lente de la iluminación indica la ficha técnica de iluminación en la muestra. Debido a la delgadez de la ficha técnica de iluminación, se ilumina solamente un solo plano. El objetivo de la detección es colocada perpendicular a la lente de la iluminación y se centra en el plano iluminado (...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

De bajo peso molecular de proteínas en el enriquecimiento de las películas delgadas de silicio mesoporosos para el descubrimiento de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Análisis de la célula de tensión de esquileo en vivo en Pseudomonas aeruginosa mediante un sistema de microfluidos superior rendimiento automatizado

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxiales caracterizaciones mecánicas de válvulas auriculoventricular del corazón

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...