Name: light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Författarna vill uttrycka tacksamhet till William Talbot från Stanford University för att ge mänskliga Nrg1 cDNA och Deborah Yelon från UCSD för att tillhandahålla den WEA mutanter. Författarna vill även tacka Cynthia Chen för att hjälpa med bild förvärv. Denna studie stöddes av bidrag NIH HL118650 (att T.K. Hsiai), HL083015 (att T.K. Hsiai), HD069305 (till NC Chi och T.K. Hsiai.), HL111437 (att T.K. Hsiai och NC Chi), HL129727 (att T.K. Hsiai), T32HL007895 (att R.R. Sevag Packard), HL 134613 (till V. Messerschmidt) och Universitet av Texas System stjärnor finansiering (till J. Lee).

Följande metoder har utförts i enlighet med UTA och UCLA IACUC protokoll. Dessa experimentella grupper användes med transgena Tg(cmlc2:gfp), wea (svag atrium) eller clo (cloche) mutanter: a vildtyp (WT) kontroll, (b) gata1a MO och (c) tnnt2a MO injektioner (tabell 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modell</td>
			<td>Namn</td>
			<td>Mod...

<ol>
	<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+domain+computational+fluid+dynamics+to+interface+with+an+embryonic+model+of+cardiac+morphogenesis.">Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis.</a> PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).</li><li>Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+cardiac+trabeculation+on+neuregulin+signaling+and+blood+flow+in+zebrafish.">Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).</li><li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease.">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).</li><li>Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+Not+Gata2+Converts+Erythropoiesis+to+Myelopoiesis+in+Zebrafish+Embryos.">Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos.</a> Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+is+required+to+preserve+cardiac+chamber+morphology.">Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110 (7), 2718 (2007).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Scientific Reports. 4, 4898 (2014).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+role+for+ErbB2+signaling+in+cardiac+trabeculation.">A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation.</a> Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).</li><li>Samsa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contraction+activates+endocardial+Notch+signaling+to+modulate+chamber+maturation+in+zebrafish.">Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish.</a> Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521, 520 (2015).</li><li>Sifrim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+genetic+architectures+for+syndromic+and+nonsyndromic+congenital+heart+defects+identified+by+exome+sequencing.">Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing.</a> Nature Genetics. 48, 1060 (2016).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+two+risk+loci+for+congenital+heart+malformations+in+Han+Chinese+populations.">A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations.</a> Nature Genetics. 45, 818 (2013).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+confocal+microscopy+and+quantitative+4D+image+analysis+of+anchor-cell+invasion+through+the+basement+membrane+in+Caenorhabditis+elegans.">Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 12, 2081 (2016).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Lavagnino, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+(x-y-z-t)+imaging+of+thick+biological+samples+by+means+of+Two-Photon+inverted+Selective+Plane+Illumination+Microscopy+(2PE-iSPIM).">4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM).</a> Scientific Reports. 6, 23923 (2016).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007 (2004).</li><li>Hove, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracardiac+fluid+forces+are+an+essential+epigenetic+factor+for+embryonic+cardiogenesis.">Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis.</a> Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li><li>BioRad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General Protocol for Western Blotting. 6376, (2018).</li><li>GeneTools. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Tools Oligo Design Website. , (2018).</li><li>Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish Course. , (2013).</li><li>Grenander, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Probability and Statistics: The Harald Cram&#233;r Volume. , (1959).</li><li>Fei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Light-Sheet+Fluorescent+Microscopy+for+Multi-Scale+and+Rapid+Imaging+of+Architecture+and+Function.">Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function.</a> Scientific Reports. 6, 22489 (2016).</li><li>Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+cardiac+imaging+in+living+embryos+via+postacquisition+synchronization+of+nongated+slice+sequences.">Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).</li><li>Adeoye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+exogenous+enzymes+and+probiotic+on+Nile+tilapia+(Oreochromis+niloticus)+growth,+intestinal+morphology+and+microbiome.">Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome.</a> Aquaculture. 463, 61-70 (2016).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+Euthanasia+in+Zebrafish.">Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Dissection+in+Larval,+Juvenile+and+Adult+Zebrafish,+Danio+rerio.">Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+Flow+Induces+Autophagy,+but+Impairs+Autophagic+Flux+to+Perturb+Mitochondrial+Homeostasis.">Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Stress-Activated+Wnt-Angiopoietin-2+Signaling+Recapitulated+Vascular+Repair+in+Zebrafish+Embryos.">Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).</li><li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-Responsive+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-Protein+Kinase+C+Isoform+Epsilon+Signaling+Mediates+Glycolytic+Metabolites+for+Vascular+Repair.">Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).</li><li>Vermot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+blood+flows+act+through+klf2a+to+ensure+normal+valvulogenesis+in+the+developing+heart.">Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart.</a> PLoS Biol. 7 (11), (2009).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+essential+for+ventricular+chamber+development.">Notch signaling is essential for ventricular chamber development.</a> Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).</li><li>Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+weak+atrium/atrial+myosin+heavy+chain+disrupts+atrial+function+and+influences+ventricular+morphogenesis+in+zebrafish.">Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish.</a> Development. 130 (24), 6121 (2003).</li><li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physiologic+dissection+of+the+vertebrate+cardiac+conduction+system.">Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system.</a> PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation.">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. 124 (2), 381-389 (1997).</li><li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloche,+an+early+acting+zebrafish+gene,+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages.">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+(SPIM).">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li></ol>

I detta protokoll, har vi visat att 4 D imaging kan användas för att spåra utvecklingen av en trabekulära nätverket som svar på förändringar i biomekaniska krafter. I synnerhet initierar skjuvspänningen erfarna av endotelceller skåran signalering kaskad, som i sin tur främjar trabeculation. I detta manuskript, har vi visat att (1) gata1a MO injektion minskad blodbildning och därför det förminskade vägg skjuvspänning, (2) tnnt2a MO injektion hämmade kontraktila kammarfunktion för att mi...

Biomekaniska krafter, såsom hemodynamiska skjuvspänning, är intimt involverade i hjärt morfogenes. Svar på hemodynamiska skeva styrkor utvecklas myokardiell åsar och fåror i en vågliknande trabekulära nätverket i linje med riktningen av skjuvspänningen över atrioventrikulärt (AV) ventil1. Hjärt trabeculation är nödvändigt att öka kontraktila funktion och hjärtinfarkt massa2. Mutationer i Notch signalering vägar resulterar i kongenitala hjärtfel hos människor och andra ryggradsdjur3. Till exempel har gata1a4 och tnnt2a5 morpholino oligonukleotider (MO) visat sig minska erytropoes, medan erytropoietin mRNA (EPO)6 och Isoproterenol (ISO)7 ökar röda blodkroppar celler och puls vägg respektive, och därför skjuvspänning (WSS). Dessutom ErbB2 signalering, nedströms av Notch, främjar hjärtmuskelcellen proliferation och differentiering att generera kontraktila kraft, som i sin tur aktiverar Notch signalering8,9. Det föreslås att shear stress styr Notch signalering drivna trabeculation för ventrikulär utveckling. För närvarande, det finns många studier som försöker ytterligare förstå genetisk programmering händelserna som ledde till kongenitala defekter (CHD)10,11,12, men mycket lite undersöker hur mekaniska krafter påverkan bildar hjärtat.
För att undersöka de mekaniska styrkorna behöver agera på endocardium, noggrann observation under perioden utvecklingsmässiga genomföras. Det är dock svårt att få bra kvalitetsbilder av i vivo slog prover på grund av tillhörighet traditionella mikroskopi13. För att följa utvecklingen över tid inom ett prov, måste fysiska snittning och färgning, därför uppstå13,14,15. Även om konfokalmikroskopi används ofta till bild 3D-strukturen för prover14,16, begränsas fortfarande dessa bildsystem förvärv av långsam skanning hastigheter.
Ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM) är en unik imaging teknik som möjliggör visualisering av i vivo dynamiska händelser med långa arbeta avstånd13. Denna teknik använder en ljus ark fluorescerande mikroskopi optiskt avsnitt en prov17. På grund av belysning av endast ett tunt lager av ljus på prov finns det en minskning av foto-blekning och foto toxicitet13,18. Stora området Visa och långa arbetsavstånd möjliggör stora prover bo intakt eftersom de är avbildad13,14,17. Den låg förstoringen möjliggör ett större område avbildas, medan långt arbetsavstånd möjliggör tjockare prover som avbildas utan att kompromissa med det signal-brus-förhållandet. Många grupper har använt LSFM till bilden hela embryon17, brains14,18, muskler och hjärtan19 bland andra vävnader, visar de olika typerna av prover som kan avbildas.
Även om tidigare forskning visat minskad hemodynamiska tvärkraften av occluding inflöde eller utflöde spåren av zebrafisk hjärtat, är informationen enbart kvalitativa. Det resulterar i en onormal tredje avdelningen, minskad hjärt looping och nedsatt ventil bildandet20. 4-D LSFM bilderna ge ett nytt perspektiv i det sättet den hemodynamiska skjuvning krafter påverkar utvecklingen av hjärtvävnad. Dessa mekaniska krafter kan aktivera kraft-känsliga signalmolekyler och inducera bildandet av trabekulärt åsar. På grund av den extra tidsaspekten av 4 D imaging är en kompetent att spåra förändringar i utvecklingen i realtid, vilket kan leda till nya uppenbarelser som hade gått obemärkt förbi tidigare. Zebrafiskar är en idealmodell för imaging eftersom forskare kan observera ett hela vertebrate djur kontra endast cell-cell interaktioner. Syre kan också diffunderar genom hela embryot, som möjliggör utveckling sker utan beroende på kärlsystemet, till skillnad från däggdjur utveckling. Även om zebrafiskar hjärtat saknar pulmonell organ, som kräver ett fyrkamrat hjärta, finns det ett stort antal hjärt gener som bevaras mellan zebrafiskar och människor21.
I detta manuskript beskriver vi hur du använder ljus ark fluorescensmikroskopi till bild utveckla trabekelantal i zebrafiskar hjärtan under olika omständigheter. Injektion av gata1a4 eller tnnt2a5 användes först, MOs till lägre blodet viskositet och därför WSS. Morfologi av hjärtat spelades sedan. I en separat grupp av fisk, vi ökade WSS genom att administrera EPO mRNA6 eller isoproterenol7 och observerade resultaten. Vi har också genomfört en cell studie med olika pulserande eller oscillerande flöden. Efter imaging varje grupp, hittade vi att WSS kände av endocardium via Notch signalering initierar trabeculation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clontech Hifi PCR pre-mix&#160;</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td>639298</td>
			<td>PCR mastermix 
			1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Nrg1 cDNA</td>
			<td>Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for trabeculation rescue 
			1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect&#8482; Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>PCR Machine 
			1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2+</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid used to synthesize mRNA 
			1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin purification kit&#160;&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740609.25</td>
			<td>DNA Purification 
			1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>2011A</td>
			<td>PCR Ligation solution 
			1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellar competent cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>636763</td>
			<td>E. coli cells used for transformation 
			1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent 
			1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage SP6 kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>Kit used to synthesize mRNA 
			1.1.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
			<td>Purifies RNA&#160; 
			1.1.6.4, 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTools 4.3.8</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for primer design 
			1.2.1, 3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO cDNA</td>
			<td>Creative Biogene</td>
			<td>CDFH006026</td>
			<td>Increases WSS 
			1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG1478</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T4182</td>
			<td>ErbB inhibitor 
			1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To grow embryos 
			1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5942</td>
			<td>&#947;-secretase inhibitor 
			1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Used for mounting embryos 
			2.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 LT&#160;Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td>Used to capture Images 
			2.1.1.2, 2.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>FEI Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 
			2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaone mesylate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>Used to humanely sedated or sacrifice embryos 
			3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>Synthesizes cDNA 
			3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>Microcentrifuge 
			4.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI254023X</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>260264-93-5</td>
			<td>ADAM10 inhibitor 
			4.1.2, 4.1.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Isoproterenol increases WSS 
			5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cardiac mechanics analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart

De hemodynamiska krafter som upplevs av hjärtat påverkan hjärt utveckling, särskilt trabeculation, som bildar ett nätverk av förgrenade utväxter från hjärtmuskeln. Genetiska programmet defekter i skåran signalering kaskad är involverade i ventrikulär defekter såsom vänster ventrikulära Non-Compaction kardiomyopati eller hypoplastiska vänster hjärta syndrom. Användning av detta protokoll, kan det fastställas att skjuvspänningen driven trabeculation och Notch signalering är relaterade till varandra. Använda ljus-ark fluorescensmikroskopi, var visualisering av utveckla zebrafiskar hjärtat möjligt. I detta manuskript, bedömdes det huruvida hemodynamiska krafter modulera inledandet av trabeculation via Notch signalering och således påverka kontraktila funktion uppstår. För kvalitativa och kvantitativa shear stressanalys, 4 D (3-D + tid) bilder förvärvades under zebrafiskar hjärt morfogenes, och integrerad ljus ark fluorescensmikroskopi med 4-D synkronisering erövrade den ventrikulära rörelsen. Blodets viskositet sänktes via gata1a- morpholino oligonukleotider (MO) mikro-injektion för att minska skjuvspänning, därmed, down-reglerande Notch signalering och förmildrande trabeculation. Samtidig injektion av Nrg1 mRNA med gata1a MO räddade Notch-relaterade gener för att återställa trabeculation. För att bekräfta skjuvspänningen driven Notch signalering påverkar trabeculation, hjärtmuskelcellen kontraktion greps ytterligare via tnnt2a-MO att minska hemodynamiska krafter, därmed, down-reglerande Notch målgener att utveckla en icke-trabeculated hjärtmuskeln. Slutligen genomfördes styrkande av uttrycksmönster skjuvspänning-lyhörd Notch gener genom att utsätta endotelceller till pulserande flöde. Således, 4-D ljus ark microscopyen avtäckt hemodynamiska krafter underliggande Notch signalering och trabeculation med klinisk relevans till non-compaction kardiomyopati.

LSFM användes i detta manuskript för att förvärva högupplösta 2D och 3D-bilder. Som kan ses i figur 1A och 1B, styr belysning linsen bladet ljus på provet. På grund av tunna bladet ljus belyses endast ett enda plan. Upptäckt linsen är placerad vinkelrätt mot objektivets belysning och är inriktad på belysta planet (figur 1B). Bladet ljus från belysning linsen söker sedan provet från vänster till h...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart at JoVE.com

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera utveckla hjärtan i zebrafiskar i 4 dimensioner (4 D). 4-D imaging, via ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM), tar 3-dimensionell (3D) bilder över tid, att rekonstruera utveckla hjärtan. Vi visar kvalitativt och kvantitativt att shear stress aktiverar endokardiella Notch signalering under avdelningen utveckling, vilket främjar hjärt trabeculation.

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Låg molekylvikt protein Anrikning av mesoporösa kvarts tunna filmer för biomarkörer

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enda molekyl fluorescensmikroskopi på Planar bilayers stöds

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi för studien av murina hjärtat

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Levande Cell analys av Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa använder ett automatiserat System för högre genomströmning mikrofabricerade

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mekaniska karakteriseringar av atrioventrikulärt hjärtklaffar

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hög genomströmning dragkraft mikroskopi med PDMS avslöjar dosberoende effekter omvandla tillväxtfaktor-β på epitelial-till-mesenkymala övergång

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...