Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
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这项工作得到了英国心脏基金会, 理查德明亮的 VEGF 研究信托和湄公河的支持。

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. 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T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

本议定书描述了肾小球疾病的小鼠模型中应进行的全肾脏工作, 从而能够从一只老鼠身上获得关于肾脏和肾小球功能的大量信息。每种方法的关键步骤都允许对肾小球功能进行详细的功能、结构和机械分析, 包括评估肾脏的整体通透性 (uACR 和血浆肌酐测量), 通透性个体肾小球 (肾小球 LpA/V), 检查结构改变 (PAS, 三色蓝色和 EM), 蛋白质定位 (如果), 和肾小球基因表达 (rt-pcr 和西方印迹)。这些方法是对肾脏疾病模型小鼠肾小球功能的全面评估的关键。
在评估 GFB 的渗透性时, 许多研究选择使用常规 uACR 或24小时白蛋白排泄率作为有效的措施17,18。虽然这些技术允许评估 GFB 渗透性作为整体, 它不允许单独肾小球通透性评估和变异在肾小球之间。以前的研究已经发现, 对肾小球 Lpa/V 的测量我是一个更敏感的措施, 改变 GFB 渗透率5,9。事实上, 在本文所展示的代表性结果中, 在14周后诱导 vegf-a 高, vegf-a 高 X Neph VEGF-165小鼠有明显低于 VEGF-a 型小鼠 uACR;然而, 这一结果没有反映在肾小球 Lpa/V测量, 其中 VEGF-165b 没有显著地防止增加 GFB 通透性 (图 1和图 2)5。这表明使用多种化验方法来评估肾脏通透性和个体肾小球的渗透性的重要性。此外, 肾小球 Lponcometric 的实验表明, 同一肾脏的单个肾小球通透性有很大差异, 特别是在疾病模型5,10,19. 测量肾小球 LpA/V 的一个局限性是它只能在实验终点进行;因此, 需要常规的 uACR 测量来表示实验终点。
除了评估功能表型, 目前的方法也鼓励评估的结构和超微表型。这可以通过选择的污点, 如 PAS, 三色, 和银污渍;每个评估肾小球形态学的不同方面。在急性肾小球疾病模型中, 通常是老鼠模型中的例子, 除非你是一个训练有素的肾脏病理学家, 否则很难用这些污渍检测出任何主要的结构异常。因此, 建议对 GFB 的超微结构进行评估, 使其能定量测量肾小球、内皮吕克茶大小、数量和足细胞特征等参数。这种测量需要最少的训练来进行, 并使调查人员能够确定受疾病模型影响的细胞类型/结构。在代表性结果显示的例子中, VEGF-一只高鼠被发现是一种轻度肾小球疾病模型, 因此, 在 PAS 染色中没有出现重大的结构异常。然而, 足细胞特异性 VEGF-A 在检查肾小球超结构5时, 诱导了足和内皮细胞的变化。不幸的是, 目前的方法所描述的 EM 肾脏的制备并不能检测到内皮糖萼, 这对 GFB19的通透性也有显著影响。为了准确测量糖萼的深度, 肾脏应灌注固定与2.5% 戊二醛与1% 阿利新蓝为内皮糖萼标签, 如 Oltean et19所述。
一旦评估功能和结构表型, 不同基因和通路的表达/激活模式就可以在肾小球中具体评估。先前的超结构评估可以提供有关细胞类型/肾小球结构的一些信息, 表明是否应该检查足细胞或内皮特异基因/通路。例如, 在 VEGF-a 高鼠的代表性结果中, 观察到内皮吕克茶数的减少 (图 3D);因此, 研究了一种已知参与 VEGF 的内皮标记的肾小球蛋白表达--通路;VEGFR-2 (图 4B)5。除了蛋白在肾小球中的表达, 它们的定位也可以用 IF 来可视化。在张et al20的研究中, GLUT1 的足细胞表达在足中被证实, 如果将增加的 GLUT1 与 podocin 进行协调。
与文献中提出的用于评估肾小球功能的其他方法相比, 本文概述的方法用于评估肾小球疾病模型小鼠肾脏功能, 使肾小球表型能充分评估从多个方面。利用该方法, 研究人员能够确定模型的肾脏表型, 并对表型的形成机理进行评估。在研究这些模型中潜在的治疗途径时, 需要了解有关疾病机制的重要信息。这种方法可以很容易地应用于今后对肾小球功能的研究, 无论是在评估疾病表型和潜在疗法。
总之, 这种通用的和适应性的协议描述了肾小球疾病小鼠模型的全肾脏工作, 使大量有关肾脏和肾小球功能的信息可以从一只老鼠身上获得。这些方法可以对肾小球疾病的所有小鼠模型进行详细的功能、结构和机械分析。

使用小鼠模型模仿人类肾脏疾病越来越普遍。这种小鼠模型包括自发性高血压大鼠 (SHR)1、链脲佐菌素 (STZ) 诱发的糖尿病大鼠和小鼠2, 以及 db/db ii 型糖尿病老鼠3, 基因工程模型, 如原发性足细胞特异性局灶节段性肾小球硬化 (FSGS) 模型4, 足细胞特定血管内皮生长因子 a (vegf a) 敲出 (vegf a) 模型5, Alport 综合征模型6, 并获得模型如5/6 肾切除术7和单侧输尿管梗阻 (UUO)8。为了评估这些模型中肾小球功能的不同方面, 有几种技术可供选择。本方法的目的是为了充分评估肾小球功能, 在小鼠肾脏疾病模型中进行综合性的研究。
使用这种方法的基本原理是它能使肾小球表型从多个方面得到充分的评价。这包括评估肾小球通透性, 无论是蛋白质和水, 肾小球结构异常, 和变化的基因和蛋白质的表达/剪接对正常肾小球功能至关重要。利用该方法, 研究人员能够确定模型的肾脏表型, 并对表型的形成机理进行评估。这是关于疾病机制的重要信息, 在研究这些模型中的潜在治疗途径时, 这是必需的。
在文献中, 这是一个常见的发生, 提出了一个小鼠肾小球疾病模型, 其中表型是由增加水平的白蛋白在尿液中。然而, 有证据表明, 单一的方法来确定肾小球功能并不总是有效的;测量尿白蛋白排泄率或尿白蛋白肌酐比值 (uACR) 只提供有关总肾功能, 而不是单个肾小球的信息。以往的研究表明, 不同肾小球的通透性可以从同一个肾脏的5,9,10不等。另外, 评估单个肾小球的通透性是评估肾小球功能的一种较为敏感的方法;测量单个肾小球通透性的方法 (LpuACR) 对肾小球功能变化的敏感性比测量9。这种方法对抗蛋白尿的小鼠模型有益, 如 c57BL/6 背景11。本方法的优点是, 它检查了总肾通透性的白蛋白以及个别肾小球通透性的水。
对肾小球结构异常的检查通常是由一电池的污点, 如周期性酸希夫 (PAS), 三色, 和银污渍评估。这使经过训练的肾脏病理学家可以通过评分方法来评估肾脏疾病的水平。虽然所有的好方法, 肾小球宏观结构的变化并不总是观察到急性肾损伤模型12。该方法建议, 除了实施上述肾脏组织学技术外, 还应通过电子显微镜 (EM) 对肾小球超微结构进行评估。染色的肾小球在常规光镜下看起来相对正常;然而, 通过对 EM 的评估, 分析了肾小球基底膜宽度、足细胞足过程避嫌、内皮 fenestrations 和亚足细胞空间覆盖率的小变化。因此, 对肾小球超结构和微结构进行评估, 确定肾小球功能障碍的机制至关重要。
除了评估肾小球结构异常外, 还应检查 mRNA 和蛋白表达和剪接的变化, 以及蛋白质活化 (如磷酸化), 以进一步阐明肾小球疾病的机制。当观察肾小球疾病, 或例如, 当高/超表达一个基因专门在肾小球细胞, 如在足细胞特定 VEGF-一个高鼠5, 重要的是, 蛋白质和 mRNA 的变化只检查在肾小球细胞, 而不是整个肾脏。本协议描述了一种从小鼠肾皮质分离肾小球的方法, 然后分离出蛋白质/RNA。这允许对疾病模型肾小球中蛋白质/mRNA 失调的具体分析。
本议定书描述了肾小球疾病的小鼠模型中应进行的全肾脏工作, 从而能够从一只老鼠身上获得关于肾脏和肾小球功能的大量信息。这些方法可以对肾小球疾病的所有小鼠模型进行详细的功能、结构和机械分析。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
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			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
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assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

使用小鼠模型模仿人类肾脏疾病越来越普遍。我们的研究重点是评估肾小球功能的糖尿病肾病和足细胞特异性 VEGF-一个敲出小鼠;因此, 本协议描述了我们实验室中用于评估肾小球疾病小鼠模型的全肾脏工作, 使一只老鼠可以获得大量关于肾脏和肾小球功能的信息。与文献中提出的评估肾小球功能的其他方法相比, 本文概述的方法可以使肾小球表型从多个方面得到充分评价。利用该方法, 研究人员可以确定模型的肾脏表型, 并对表型的形成机制进行评估。在研究这些模型中潜在的治疗途径时, 需要了解有关疾病机制的重要信息。这些方法可以通过测量尿白蛋白肌酐比值和单个肾小球水渗透性, 以及结构和超结构检查, 对肾小球滤过屏障进行详细的功能评估。采用周期性酸席夫碱染色和电镜。此外, 分析基因失调在 mRNA 和蛋白质水平上能够对肾小球功能进行机械分析。本协议概述了可应用于所有小鼠肾小球疾病模型的通用但适应性强的方法。

用野生型代谢笼收集尿液, 诱导足细胞特异 vegf-一个敲出 (vegf a 高) 和 vegf-a 高 X Neph vegf165b 小鼠 (vegf-高表达人 vegf 的高鼠-165b 异构体在足中本构方式)。在0、4、10、14周的尿白蛋白肌酐比值测定后, 在血管内皮生长因子-a 高、vegf-a 的作用下, 与 littermate 控制相比, 高鼠逐渐形成蛋白尿10周。绝对值可以在图 2A中看到, 并且规范化到图 2B中每个鼠标值的基线。然而, 在 vegf 中没有观察到的蛋白尿--X Neph-vegf-165b 小鼠 (图 2), 表明 vegf-A165b 在蛋白尿5的模型中是保护性的。
肾小球 LpAV我是测量的单个肾小球筛出的体重, vegf a 高, 和 vegf-一个 X Neph VEGF-165b 肾。图 3A显示了一个肾小球被捕获的例子, 以及当与 8% BSA perifused 时观察到的收缩情况。这种收缩, 然后用于确定肾小球 LpA/V我为每个肾小球 (图 3B)。vegf-a 型小鼠肾小球 Lpa/V 在 14周后 vegf-高诱导与控制肾小球相比显著增加。虽然 vegf--一个 X Neph-vegf-165b 小鼠的低, 但肾小球 Lpa /V 的增加没有预防 vegf 的过度表达-165b 14 周5。
内皮生长因子诱导后14周肾皮质部分的 PAS 染色未发现 vegf 的肾小球结构异常-a 高或 vegf-X Neph vegf-165小鼠 (图 4A)。然而, 通过 EM 对肾小球超微结构的分析, VEGF-A 型小鼠发展了肾小球的宽度增加, 内皮吕克茶减少, SPS 覆盖率下降, 平均足细胞狭缝宽度增加 (图 4C-4F).平均足细胞脚加工宽度和缝数保持不变 (图 3B 和 3G)。vegf 的过度表达-165b 在血管内皮生长因子-一个高鼠阻止了改变的肾小球和狭缝宽度 (图 4C 和 4F)。然而, VEGF-A165b 对改变的吕克茶数和 SPS 覆盖率没有影响 (图 4D 和 4E)5。
对从筛出的肾小球中提取的 RNA 进行 rt-pcr PCR 显示, 人 vegf--165b mRNA 仅存在于 vegf 中--高 X Neph-vegf-165b 小鼠 (图 5A)。当从被筛的肾小球中提取蛋白质并通过西方印迹对蛋白质水平进行评估时, VEGFR-2 的肾小球蛋白表达减少, vegf-一个高的小鼠, 这是预防的血管内皮生长因子的过度表达-165b (图 5B 和 5C)5。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> 图1。肾小球通透性 (LpA) 平台的图解建立.(a)肾小球被夹在(B)微内的持卡人使用吸力, 它被夹在支架上以稳定。(C)矩形 microslide。(D) 4X 用摄像机拍摄的物镜。(E) 1% BSA 溶液升温至37摄氏度。(F) 8% BSA 溶液升温至37摄氏度。(G)带有两条 perifusate 的遥控水龙头, 允许快速 perifusate 交换。(H) perifusate 对 microslide 的路线, 然后将肾小球沐浴。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> 图2。尿白蛋白肌酐比值。(a)在0、4、10和14周后的 uACR 值, 在血管内皮生长因子的诱导下, Neph、vegf a 和 vegf--一个 X--vegf--165b 小鼠。(B)与每个鼠标的基线值 (0 周) 规范化的相同 uACR 值。uACR 明显增加 vegf-一个小鼠在周10和14与 littermate 控制, 这是预防的 vegf-X Neph vegf-165b 小鼠 (* p < 0.05;双向方差分析法, 对对比较的校正;n = 4-12 小鼠每时间点;误差条: 平均值的标准误差 [SEM])。这个数字已经从史蒂文斯等5修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> 图3。肾小球水渗透性的测量。(A)肾小球通过吸力被微;perifusate 从 1% bsa (Ai) 转换为 8% bsa (全部), 并观察肾小球萎缩。(B)在 8% BSA 开关之前和之后进行的测量用于确定肾小球 LpA/V.(C) vegf--一个高鼠肾小球 Lp一/Vi . 在14周后诱导 vegf-a 比对照。这在 vegf-X Neph-vegf-165b 小鼠 (* p < 0.05) 中没有明显的预防作用;单程方差分析, Bonferroni 校正为比较之间对;n = 4-9 小鼠, 15-30 肾小球;误差条: SEM)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> 图4。肾小球结构分析。(A)肾皮质 PAS 染色并没有表明从体重、vegf a 和 vegf--X Neph-vegf-165b 小鼠 (Ai iii) 的肾小球中的任何结构异常。EM 揭示 VEGF 的超结构异常--高肾小球 (禽流感)。(B)各组之间的平均 FPW 没有变化。(C)血管内皮生长因子-一个高肾小球, 由 vegf (165b) 所阻止, 在 vegf 中增加. (D)血管内皮生长因子 (吕克茶) 的数量减少, vegf-a-165b. (E) SPS 覆盖率血管内皮生长因子 (高肾小球) 减少, vegf 也保持不变-165b. (F) vegf 的平均狭缝宽度增加-a 高肾小球, 由 vegf 预防-165b. (G)狭缝数未改变三组之间 (p < 0.05;单程方差分析, Bonferroni 校正为比较之间对;n = 3 只老鼠, 9 个肾小球;误差条: SEM)。这个数字已经从史蒂文斯等5修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> 图5标记物的 mRNA 和蛋白表达。(a) rt-pcr 表明, 人 vegf-165b mRNA 表达仅在筛肾血管内皮生长因子-高 X Neph-vegf-165小鼠中可见。(B)西方印迹表明, VEGFR-2 蛋白表达下降调节 vegf-高肾小球, 这是预防 vegf-高 X Neph-vegf-165B 肾小球 (* p < 0.05;单程方差分析, Bonferroni 校正为比较之间对;n = 3-6 小鼠;误差条: SEM)。这个数字已经从史蒂文斯等5修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

本议定书描述了肾小球疾病小鼠模型中应进行的全肾脏工作。这些方法可以对肾小球疾病的所有小鼠模型进行详细的功能、结构和机械分析。

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