Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den britiske Heart Foundation, Richard Bright VEGF forskning har tillid og MRC.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. De kritiske trin i hver metode giver mulighed for funktionelle, strukturelle og mekanistiske DETAILANALYSE af glomerulær funktion, herunder vurdering af permeabilitet af nyrerne som helhed (uACR og plasma kreatinin målinger), permeabilitet af enkelte glomeruli (glomerulær LpA / V,jeg), undersøgelse af de strukturelle ændringer (PAS, Trichrome blå og EM), protein lokalisering (IF) og glomerulær genekspression (RT-PCR og Western blotting). Disse metoder er nøglen til den fulde vurdering af glomerulær funktion i musemodeller af nyresygdom.
Ved vurderingen af permeabilitet af GFB, har mange undersøgelser valgt for at bruge den konventionelle uACR eller 24 h albumin udskillelse sats som en effektiv foranstaltning17,18. Selvom disse teknikker tillader vurdering af GFB permeabilitet som helhed, giver det ikke mulighed for individuelle glomerulær permeabilitet vurdering og variation blandt glomeruli. Tidligere undersøgelser har fundet måling af glomerulær LpA / Vi at være en mere følsom mål for ændringer i GFB permeabilitet5,9. Faktisk, i de repræsentative resultater viste i dette papir, på 14 uger post induktion af VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus har en betydeligt lavere uACR i forhold til VEGF-A KO mus; men dette resultat er ikke afspejlet i glomerulær LpA / Vjeg målinger, hvor VEGF-A165b ikke forhindre betydeligt øger i GFB permeabilitet (figur 1 og figur 2)5. Dette viser betydningen af at bruge flere assays til at vurdere både nyre permeabilitet og permeabilitet af individuelle glomeruli. Derudover glomerulær LpA / Vjeg oncometric analyse tyder på, at permeabiliteten af individuelle glomeruli fra samme nyrerne kan variere meget, især i sygdommen modeller5,10, 19. en begrænsning til måling af glomerulær LpA / Vjeg er, at det kun kan udføres på den eksperimentelle end-point; således, regelmæssig uACR målinger er forpligtet til at give en indikation af den eksperimentelle end-point.
Ud over vurderingen af den funktionelle fænotype, tilskynder den nuværende metode også vurdering af de strukturelle og ultrastrukturelle fænotype. Dette kan gøres ved hjælp af et udvalg af pletter såsom PAS, trichrome, og sølv pletter; hver at vurdere forskellige aspekter af glomerulær morfologi. I akut modeller af glomerulær sygdom, som det ofte er tilfældet i musemodeller, kan være svære at opdage eventuelle store strukturelle abnormiteter ved hjælp af disse pletter, medmindre du er en uddannet renal patolog. Derfor foreslås udfører EM for at vurdere ultrastruktur af GFB, som giver mulighed for kvantitativ måling af parametre såsom GBM, endotel fenestrae størrelse og antal og podocyte karakteristika. Sådanne målinger kræver minimal uddannelse til at udføre og muliggør investigator at bestemme celle-typer/strukturer påvirket i en sygdom model. I eksemplet vist i de repræsentative resultater, VEGF-A KO mus blev fundet at være en mild model af glomerulær sygdom, således, var ingen store strukturelle abnormiteter til stede ved PAS farvning. Dog podocyte-specifikke VEGF-A KO fremkalde ændringer til GBM, podocytes og endotelceller, når den undersøger de glomerulær ultra-struktur5. Forberedelse af nyrerne til EM beskrevet i den aktuelle metode giver desværre ikke påvisning af i endothelial glycocalyx, som også er kendt for at have betydelige virkninger på permeabilitet af GFB19. For at præcist at måle glycocalyx dybde, skal nyrerne være perfuse-fast med 2,5% glutaraldehyd med 1% Alcian blå i endothelial glycocalyx mærkning, som beskrevet i Oltean mfl19.
Når den funktionelle og strukturelle fænotype er blevet vurderet, kan udtryk/aktivisering mønstre af forskellige gener og veje derefter vurderes konkret i glomeruli. Ultra-strukturelle forhåndsvurdering kunne give nogle oplysninger om cellen typer/glomerulær strukturer involveret, der angiver, om podocyte - eller endotel-specifikke gener/veje bør undersøges. For eksempel, i de repræsentative resultater fra VEGF-A KO mus, blev en reduktion i endothelial fenestrae antallet observeret (figur 3D); Derfor blev glomerulær protein udtryk for en endotel mærke kendt for at være involveret i VEGF-en vej undersøgt; VEGFR-2 (figur 4B)5. Ud over udtrykket af proteiner i glomeruli, kan deres lokalisering også visualiseres ved hjælp af hvis. I en undersøgelse af Zhang mfl20, blev podocyte-specifikke overekspression af GLUT1 bekræftet i podocytes af hvis Co lokalisere den øgede GLUT1 med podocin.
I forhold til alternative metoder præsenteres i litteraturen til at vurdere glomerulær funktion, giver brug af metoden beskrevet i denne hvidbog at vurdere nyrefunktionen i musemodeller af glomerulær sygdom glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Ved hjælp af denne metode, er at forskeren stand til at bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Denne vitale oplysninger om mekanismen af sygdommen er påkrævet, når du undersøger potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller. Denne metode kan nemt anvendes til fremtidige undersøgelser glomerulær funktion både i vurderingen af sygdom fænotyper og potentielle therapeutics.
Til sidst, beskriver denne generisk og fleksibel protokol en fuld nyre arbejde op for musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.

Brugen af murine modeller til at efterligne menneskelige nyresygdom bliver mere og mere almindelige. Sådanne murine modeller omfatter spontan modeller som spontant hypertensive rotter (SHR)1, streptozotocin (STZ)-induceret diabetisk rotter og mus2, og db/db type II diabetisk mus3, gensplejsede modeller som primære podocyte-specifik fokal segmentær glomerulær sklerose (FSGS) modeller4, den podocyte-specifikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) model5, og Alport syndrom modeller6, og erhvervet modeller som 5/6 nephrectomistatus7 og ensidige ureter obstruktion (UUO) model8. For at vurdere de forskellige aspekter ved glomerulær funktion i disse modeller, er flere teknikker til rådighed. Formålet med denne metode papir er at vise et omfattende arbejde op, der skal udføres i musemodeller af nyresygdom for at fuldt ud for at vurdere glomerulær funktion.
Rationalet bag anvendelse af denne metode er, at det muliggør glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Dette omfatter vurdering af glomerulær permeabilitet, både protein og vand, glomerulær strukturelle abnormiteter og ændringer i udtryk/splejsning af mRNAs og proteiner afgørende for normal glomerulær funktion. Ved hjælp af denne metode, er at forskeren stand til at bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Dette er vigtige oplysninger om mekanismen af sygdommen, som er påkrævet, når undersøge potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller.
I litteraturen er det en fælles begivenhed at blive præsenteret med en musemodel af glomerulær sygdom hvor fænotype bestemmes af en øget niveau af albumin i urinen. Der er imidlertid grund til at formode, at en enkelt metode til at bestemme glomerulær funktion ikke er altid effektive; måle den urinveje albumin udskillelse sats eller urin albumin kreatinin ratio (uACR) kun giver oplysninger om samlede nyrefunktion, og ikke af de enkelte glomeruli. Tidligere undersøgelser har vist, at permeabiliteten kan variere i forskellige glomeruli fra samme nyre5,9,10. Vurdering af permeabilitet af individuelle glomeruli er desuden en mere følsom måde vurdere glomerulær funktion; teknik til at måle individuelle glomerulær vand permeabilitet (LpA / V,jeg) har vist sig for at være mere følsomme over for ændringer i glomerulær funktion end måling uACR9. Denne analyse er gavnlige i musemodeller der er resistente over for proteinuri, som dem på en c57BL/6 baggrund11. Fordelen ved den nuværende metode papir er, at den undersøger både den samlede renal permeabilitet til albumin såvel som den enkelte glomerulær permeabilitet til vand.
Undersøgelse af glomerulær strukturelle abnormiteter er ofte vurderet af et batteri af pletter såsom periodiske syre Schiff (PAS), trichrome, og sølv pletter. Disse aktiverer en uddannet renal patolog at evaluere niveauet for nyresygdom via en scoring metode. Selv om alle gode metoder, ændringer glomerulær makro-struktur ikke er altid overholdes i modeller akutte nyre skade12. Denne metode foreslår, at ud over udførelsen af renal histologi teknikker beskrevet ovenfor, bør den glomerulær ultra-struktur også vurderes via elektronmikroskopi (EM). En farves glomerulus kan ser relativt normal under en regelmæssig lysmikroskop; dog ved vurdering med EM, små ændringer i glomerulær basalmembran (GBM) bredde, er podocyte foden proces effacement, endotel fenestrations og sub-podocyte plads dækning analyseret. Derfor er det afgørende, at både glomerulær ultra-struktur og mikro-struktur er vurderet for at bestemme mekanismen af glomerulær dysfunktion.
Ud over vurderingen af glomerulær strukturelle abnormiteter, bør ændringer i mRNA og protein udtryk og splejsning samt protein aktivering (fx, fosforylering), undersøges for at yderligere belyse mekanismerne i glomerulær sygdom. Når man ser på glomerulær sygdom, eller, for eksempel, når KO/over-expressing et gen specielt i glomerulær celler, som i den podocyte-specifikke VEGF-A KO mus5, er det vigtigt at protein og mRNA ændringerne undersøges kun inden for de glomerulær celler, og ikke hele nyren. Denne protokol beskriver en metode hvor glomeruli er isoleret fra mus nyre cortex, og derefter protein/RNA er isoleret. Det giver specifikke analyse af protein/mRNA dysregulering i glomeruli sygdom model.
Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

Brugen af murine modeller til at efterligne menneskelige nyresygdom bliver mere og mere almindelige. Vores forskning er fokuseret på vurderingen af glomerulær funktion i diabetisk nefropati og podocyte-specifikke VEGF-en knock-out mus; Derfor, denne protokol beskriver fuld nyre arbejde-op bruges i vores lab til at vurdere disse musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. I forhold til alternative metoder præsenteres i litteraturen til at vurdere glomerulær funktion, muliggør brug af metoden beskrevet i denne hvidbog glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Ved hjælp af denne metode, kan forskeren bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Denne vitale oplysninger om mekanismen af sygdommen er påkrævet, når du undersøger potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle vurdering af glomerulær filtration barriere gennem måling af urin albumin kreatinin ratio og individuelle glomerulær vand permeabilitet, samt både strukturelle og ultra-strukturelle gennemgang ved hjælp af periodiske syre-Schiff pletten og elektronmikroskopi. Derudover muliggør analyse af gener dysregulated på mRNA og protein niveau mekanistiske analyse af glomerulær funktion. Denne protokol beskriver de generiske men fleksible metoder, der kan anvendes på alle musemodeller af glomerulær sygdom.

Urinen blev indsamlet ved hjælp af metaboliske bure fra vildtype (WT), inducerbar podocyte-specifikke VEGF-A banke ud (VEGF-A KO) og VEGF-A KO X Neph-VEGF165b mus (VEGF-A KO mus, der over express menneskelige VEGF-A165b isoform i podocytes i en konstituerende måde). Ved måling af urin albumin kreatinin ratio på uger 0, 4, 10 og 14 efter doxycyclin induktion af VEGF-A KO udviklet VEGF-A KO mus progressive albuminuri af 10 uger i forhold til WT littermate kontrol. De absolutte værdier kan ses i figur 2A, og den normaliserede til grundlinjen på hver mus værdier i figur 2B. Dog albuminuri i ikke observeret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 2), der angiver at VEGF-A165b er beskyttende i modellen af albuminuri5.
Den glomerulær LpAVjeg blev målt i individuelle glomeruli sigtes fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b nyrerne. Et eksempel på hvordan en glomerulus er fanget og svind observeret, når perifused med 8% BSA er vist i figur 3A. Denne svind bruges derefter til at bestemme den glomerulær LpA / Vjeg for hver glomerulus (figur 3B). VEGF-en KO mus havde en signifikant øget glomerulær LpA / Vjeg på 14 uger post VEGF-KO induktion i forhold til WT kontrol glomeruli. Selv om lavere i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b musene, øget glomerulær LpA / V,jeg var ikke hindres af overdreven udtryk af VEGF-A165b på 14 uger5.
PAS farvning af nyre cortex afsnit 14 uger efter induktion af VEGF-A KO ikke afsløre nogen glomerulær strukturelle abnormiteter i VEGF-A KO eller VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 4A). Dog ved analyse af glomerulær ultra-strukturen via EM, VEGF-A KO mus havde udviklet en øget GBM bredde, faldt antallet af endotel fenestrae, faldt SPS dækning og øget gennemsnitlig podocyte spalteformede bredde (figur 4 c-4F ). Gennemsnitlige podocyte foden behandle bredde og antallet af spalter uændret (figur 3B og 3 G). Overdrevne udtryk af VEGF-A165b i VEGF-A KO mus forhindret ændringerne til GBM og udskærer bredde (figur 4 c og 4F). Dog havde VEGF-A165b ingen effekt på den ændrede fenestrae nummer og SPS dækning (figur 4D og 4E)5.
RT-PCR udføres på RNA ekstraheret fra sigtede glomeruli afslørede, at den menneskelige VEGF165Baasch mRNA er kun til stede i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus (figur 5A). Når udvinding protein fra sigtede glomeruli og vurdere niveauet af proteiner via Western blotting, blev glomerulær protein udtryk af VEGFR-2 fundet at være faldet i VEGF-A KO mus, som blev forhindret af overdrevne udtryk af VEGF-A165b ( Figur 5B og 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figur 1. Skematisk nedsat glomerulær permeabilitet (LpA) riggen. (A) glomerulus er fanget på (B) mikropipette inden for en indehaver bruger suge, som er fastspændt på et mount for stabilitet. (C) rektangulære microslide. (D) 4 X formålet med et mikroskop med et videokamera. (E) 1% BSA opløsning opvarmes til 37 ° C. (F) 8% BSA opløsning opvarmes til 37 ° C. (G) fjernbetjeningen tryk forsynet med to perifusate, der indeholder linjer, som tillader hurtig perifusate dataudveksling. (H) rute af perifusate mod microslide, som derefter bader glomerulus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figur 2. Urin albumin kreatinin ratio. (A) uACR værdier uger 0, 4, 10 og 14 efter induktion af VEGF-A KO i WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus. (B) de samme uACR-værdier normaliseret til en baseline værdi (uge 0) af hver individuelle mus. UACR steget betydeligt i VEGF-A KO mus i uge 10 og 14 i forhold til WT littermate kontrol, som blev forhindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; To-vejs ANOVA, korrektion for sammenligning mellem par; n = 4-12 mus pr. tidspunkt; fejllinjer: standard fejl af middelværdien [SEM]). Dette tal er blevet ændret fra Stevens mfl5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figur 3. Måling af glomerulær vand permeabilitet. (A) af glomerulus er fanget på mikropipette via suge; perifusate er skiftet fra 1% BSA (Ai) til 8% BSA (Aii), og glomerulær svind er observeret. (B) målinger taget før og efter 8% BSA kontakten bruges til at bestemme den glomerulær LpA / V,jeg. (C) VEGF-A KO mus udvikler en øget glomerulær LpA / Vjeg på 14 uger post induktion af VEGF-A KO i forhold til WT kontrol. Dette var ikke signifikant forhindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; Én måde ANOVA, Bonferroni korrektion for sammenligning mellem par; n = 4-9 mus, 15-30 glomeruli; fejllinjer: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figur 4. Glomerulær strukturel analyse. (A) PAS farvning af nyre cortex angav ikke nogen strukturel abnormiteter i glomeruli fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (Ai - iii). EM afslørede ultra-strukturelle abnormiteter i VEGF-A KO glomeruli (Aiv - vi). (B) det gennemsnitlige FPW ikke ændre mellem grupper. (C) The GBM steg i VEGF-A KO glomeruli, som blev forhindret af VEGF-A165b. (D) antallet af fenestrae faldt i VEGF-A KO glomeruli, som forblev uforandret af VEGF-A165b. (E) den SPS dækning var faldet i VEGF-A KO glomeruli, som også er uændret af VEGF-A165b. (F) den gennemsnitlige spalteformede bredde blev forøget i VEGF-A KO glomeruli, som blev forhindret af VEGF-A165b. (G) slids antallet var uændret mellem de tre grupper (* p < 0,05; Én måde ANOVA, Bonferroni korrektion for sammenligning mellem par; n = 3 mus, 9 glomeruli; fejllinjer: SEM). Dette tal er blevet ændret fra Stevens mfl5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figur 5. mRNA og protein udtryk markører. (A) RT-PCR viste, at menneskelige VEGF-A165b mRNA udtryk kun var tydeligt i de sigtede glomeruli fra VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus. (B) Western blotting tilkendegivet, at VEGFR-2 protein udtryk var nedreguleret i VEGF-A KO glomeruli, som blev forhindret i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0,05; Én måde ANOVA, Bonferroni korrektion for sammenligning mellem par; n = 3 - 6 mus; fejllinjer: SEM). Dette tal er blevet ændret fra Stevens mfl5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.

Vurdering af nyrefunktion i musemodeller af glomerulær sygdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En simpel metode til Mouse Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Vurdering af hjertefunktion og Myocardial morfologi Brug Small Animal Look-skab Inversion Recovery (SALLI) MRI i rotter

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Vurdering af Højre ventrikels struktur og funktion i musemodel med lungepulsåren Konstriktion af Transtorakal Ekkokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Vurdering af vaskulære funktion hos patienter med kronisk nyresygdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Mus nyretransplantation: modeller af allotransplantatafstødning

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Anvendelse af Ultra-high Field MRI i Small gnavermodeller af polycystisk nyresygdom for<em&gt; In vivo</em&gt; Fænotypebestemmelse and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan vurdering af nyrefunktionen i bevidste Gnavere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Kutan Kirurgisk Denervation: En metode til afprøvning af Krav om Nerver i musemodeller af Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Gentagen Måling af åndedrætsorganer muskel aktivitet og ventilation i musemodeller af Neuromuskulær sygdom

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...