Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Britse Hartstichting, Richard Bright VEGF Research Trust en het MRC.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. De kritische stappen in elke methode voorzien in gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, met inbegrip van de beoordeling van de permeabiliteit van de nieren als geheel (uACR en plasma Kreatinine metingen), de doorlaatbaarheid van individuele glomeruli (glomerulaire LpA / Vik), onderzoek van de structurele wijzigingen (PAS Trichrome blauw en EM), eiwit lokalisatie (IF), en de glomerulaire genexpressie (RT-PCR en het westelijke bevlekken). Deze methoden zijn de sleutel tot de volledige beoordeling van de glomerulaire functie in muismodellen van nierziekte.
Bij de beoordeling van de permeabiliteit van de GFB, hebben tal van studies gekozen voor het gebruik van de conventionele uACR of 24 h albumine excretie snelheid als een doeltreffende maatregel17,18. Hoewel deze technieken toestaan beoordelingvan de GFB permeabiliteit als geheel, staat het niet toe voor de beoordeling van de individuele glomerulaire permeabiliteit en variatie onder de glomeruli. Eerdere studies hebben gevonden meting van de glomerulaire LpA / Vi een gevoeliger maatregel van wijzigingen in de GFB permeabiliteit5,9. Inderdaad, in de representatieve resultaten aangetoond in dit document, op 14 weken na de inductie van VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b muizen hebben een aanzienlijk lager uACR t.o.v. VEGF-A KO muizen; Dit resultaat komt echter niet tot uiting in de glomerulaire LpA / Vik metingen, waar VEGF-A165b belette niet aanzienlijk dat verhoogt in de GFB permeabiliteit (Figuur 1 en Figuur 2)5. Dit toont het belang van het gebruik van meerdere tests te beoordelen van zowel de permeabiliteit van de nier en de permeabiliteit van individuele glomeruli. Bovendien, de glomerulaire LpA / Vik oncometric assay suggereert dat de doorlaatbaarheid van individuele glomeruli van de dezelfde nier kan sterk variëren, met name in ziekte modellen5,10, 19. een beperking tot het meten van de glomerulaire LpA / Vik is dat het kan alleen worden uitgevoerd op de experimentele eindpunt; Dus, regelmatig uACR metingen moeten geven een indicatie van het experimentele eindpunt.
Naast de beoordeling van de functionele fenotype, moedigt de huidige methode ook een evaluatie van de structurele en ultrastructurele fenotype. Dit kan gedaan worden met behulp van een aantal vlekken zoals PAS, trichrome, en zilveren vlekken; elke om te beoordelen van verschillende aspecten van de glomerulaire morfologie. In acute modellen van glomerulaire ziekte, die vaak het geval in muismodellen is, is moeilijk te detecteren eventuele belangrijke structurele afwijkingen met behulp van deze vlekken, tenzij u een opgeleide renale patholoog. Daarom, uitvoeren van EM wordt voorgesteld om het beoordelen van de ultrastructuur van de GFB, waarmee de kwantitatieve meting van parameters zoals de GBM endothelial fenestrae grootte en aantal en podocyte kenmerken. Dergelijke metingen vereist minimale opleiding uit te voeren en kan de onderzoeker om de cel-typen/structuren beïnvloed in een model van de ziekte. In het voorbeeld in de representatieve resultaten, de muis VEGF-A KO bleek te zijn van een milde model van glomerulaire ziekte, dus waren geen grote structurele afwijkingen aanwezig op de PAS kleuring. Echter de podocyte-specifieke VEGF-A KO, er veranderingen aan de GBM podocytes en de endotheliale cellen veroorzaken bij het onderzoek van de glomerulaire ultra-structuur-5. Helaas, de voorbereiding van de nier voor EM beschreven in de huidige methode niet mogelijk detectie van het endotheel glycocalyx, waarvan ook bekend is dat aanzienlijke gevolgen hebben voor de permeabiliteit van de GFB19. Om nauwkeurige meting van de glycocalyx-diepte, moet de nier perfuse-vaste met 2,5% Glutaaraldehyde met 1% Alcian blauw voor endothelial glycocalyx etikettering, zoals beschreven in Oltean et al.19.
Zodra het functionele en structurele fenotype zijn beoordeeld, kunnen de expressie/activatie patronen van verschillende genen en wegen dan specifiek in de glomeruli worden beoordeeld. Voorafgaande Ultra structurele evaluatie kan geven wat informatie over de cel typen/glomerulaire structuren betrokken, die aangeeft of podocyte - of endotheel-specifieke genen/trajecten dienen te worden onderzocht. Bijvoorbeeld in de representatieve resultaten van de muizen VEGF-A KO, werd een vermindering van het aantal endothelial fenestrae waargenomen (figuur 3D); Daarom werd de glomerulaire eiwit expressie van een endothelial markering bekend te worden betrokken bij de VEGF-A-traject onderzocht; VEGFR-2 (figuur 4B)5. Naast de uitdrukking van eiwitten in de glomeruli, kan ook hun localisatie worden gevisualiseerd met behulp van als. In een studie door Zhang et al.20, werd podocyte-specifieke overexpressie van GLUT1 bevestigd in de podocytes door als mede het lokaliseren van de verhoogde GLUT1 met podocin.
In vergelijking met alternatieve methoden gepresenteerd in de literatuur te beoordelen glomerulaire functie, maakt het gebruik van de methode beschreven in dit document aan het beoordelen van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte het glomerulaire fenotype volledig worden geëvalueerd van meerdere aspecten. Met behulp van deze methode, is de onderzoeker kunnen bepalen van het fenotype van de nier van het model en het beoordelen van het mechanisme over de vraag waarom het fenotype ontwikkelt. Deze vitale informatie over het mechanisme van de ziekte is vereist bij het onderzoeken van potentiële therapeutische mogelijkheden in deze modellen. Deze methode kan eenvoudig worden toegepast op toekomstige onderzoek naar glomerulaire functie, zowel bij de beoordeling van ziekte fenotypes en potentiële therapeutics.
Kortom, beschrijft dit generieke en flexibele protocol een volledige nier werk-up voor Muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Het gebruik van lymfkliertest modellen om na te bootsen menselijke nierziekte wordt steeds gewoner. Dergelijke lymfkliertest modellen bevatten spontane modellen zoals spontaan hypertensieve ratten (SHR)1, streptozotocin (STZ)-geïnduceerde diabetische ratten en muizen2, en de db/db type II diabetesmuizen3, genetisch gemanipuleerde modellen zoals primaire podocyte-specifieke focale segmentale glomerulaire sclerose (FSGS)4, de podocyte-specifieke vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) model5, modellen en syndroom van Alport6modellen en verworven modellen zoals de 5/6 Nefrectomie7 en de unilaterale ureterale obstakel (UUO)-model8. Om te beoordelen de verschillende aspecten van de glomerulaire functie in deze modellen, zijn verschillende technieken beschikbaar. Het doel van deze paper methode is om aan te tonen van een uitgebreide werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van nierziekte teneinde volledig glomerulaire functie.
De grondgedachte achter het gebruik van deze methode is dat hierdoor het glomerulaire fenotype volledig worden geëvalueerd vanuit meerdere invalshoeken. Dit omvat de beoordeling van de glomerulaire permeabiliteit, zowel aan proteïne en te water, de glomerulaire structurele afwijkingen, veranderingen in de expressie/splitsen van mRNAs en eiwitten essentieel voor normale glomerulaire functie. Met behulp van deze methode, is de onderzoeker kunnen bepalen van het fenotype van de nier van het model en het beoordelen van het mechanisme over de vraag waarom het fenotype ontwikkelt. Dit is essentiële informatie over het mechanisme van ziekte, die vereist is bij het onderzoeken van potentiële therapeutische mogelijkheden in deze modellen.
In de literatuur is het een gemeenschappelijk optreden te worden gepresenteerd met een muismodel van glomerulaire ziekte waar het fenotype wordt bepaald door een verhoogd niveau van eiwit in de urine. Er is echter bewijs om te suggereren dat een enkele methode om te bepalen van de glomerulaire functie niet altijd effectief is; meten van de urine albumine uitscheiding tarief of de urine albumine Kreatinine ratio (uACR) biedt alleen informatie op totale nierfunctie, en niet van de afzonderlijke glomeruli. Eerdere studies hebben aangetoond dat de permeabiliteit in verschillende glomeruli van de dezelfde nier5,9,10 variëren kan. Bovendien, is beoordeling van de permeabiliteit van individuele glomeruli een gevoeliger manier beoordelen glomerulaire functie; de techniek van het meten van de individuele glomerulaire waterdoorlaatbaarheid (LpA / Vik) gebleken meer gevoelig voor veranderingen in het glomerulaire functie dan het meten van de uACR9. Deze test is het nuttig in muismodellen die resistent zijn tegen Proteïnurie, zoals die op een achtergrond van c57BL/6-11. Het voordeel van de huidige methode papier is dat het onderzoekt zowel de totale renale permeabiliteit aan albumine, alsmede de individuele glomerulaire permeabiliteit voor water.
Onderzoek van de glomerulaire structurele afwijkingen wordt vaak beoordeeld door een batterij van vlekken zoals periodieke Zure Schiff (BK), trichrome, en zilveren vlekken. Deze kunnen een opgeleide renale patholoog te beoordelen van het niveau van nierziekte via een methode van scoren. Hoewel alle goede methoden, veranderingen in het glomerulaire macro-structuur niet altijd worden nageleefd modellen acute nier schade12. Deze methode stelt voor dat de glomerulaire ultra-structuur naast het uitvoeren van de technieken van de renale histologie hierboven beschreven, ook moet worden beoordeeld via elektronenmicroscopie (EM). Een gekleurd glomerulus kunt kijken relatief normale onder een regelmatige lichte Microscoop; echter, na beoordeling met EM, kleine veranderingen in het glomerulaire kelder membraan (GBM) breedte, podocyte voet proces geweest, endothelial fenestrations, en de sub-podocyte ruimte dekking wordt geanalyseerd. Het is daarom essentieel dat zowel de glomerulaire ultra-micro-structuur en wordt beoordeeld om te bepalen van het mechanisme van de glomerulaire dysfunctie.
Naast de beoordeling van glomerulaire structurele afwijkingen, moeten veranderingen in mRNA en eiwit expressie en splicing, evenals eiwit activering (b.v., fosforylatie) worden onderzocht om te verder het ophelderen van de mechanismen van de glomerulaire ziekte. Wanneer we kijken naar glomerulaire ziekte, of, bijvoorbeeld wanneer KO/over-expressing een gen concreet in glomerulaire cellen, zoals de podocyte-specifieke VEGF-A KO muis5, is het belangrijk dat de eiwitten en mRNA wijzigingen alleen binnen worden onderzocht de glomerulaire cellen, en niet de hele nier. Dit protocol beschrijft een methode waarin de glomeruli zijn geïsoleerd van de muis nier cortex, en vervolgens het eiwit/RNA worden geïsoleerd. Hierdoor kan specifieke analyse van het eiwit/mRNA disregulatie in de glomeruli van het model van de ziekte.
Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

Het gebruik van lymfkliertest modellen om na te bootsen menselijke nierziekte wordt steeds gewoner. Ons onderzoek is gericht op de beoordeling van de functie van de glomerulaire diabetische nefropathie en podocyte-specifieke VEGF-A knock-out muizen; Dit protocol beschrijft daarom de volledige nier werk-up gebruikt in ons lab ter beoordeling van deze Muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. In vergelijking met alternatieve methoden gepresenteerd in de literatuur te beoordelen glomerulaire functie, maakt het gebruik van de methode beschreven in dit document het glomerulaire fenotype volledig worden geëvalueerd vanuit meerdere invalshoeken. Met behulp van deze methode, kan de onderzoeker het fenotype van de nier van het model te bepalen en beoordelen van het mechanisme over de vraag waarom het fenotype ontwikkelt. Deze vitale informatie over het mechanisme van de ziekte is vereist bij het onderzoeken van potentiële therapeutische mogelijkheden in deze modellen. De methoden toestaan voor gedetailleerde functionele beoordeling van de barrière van de glomerulaire filtratie door meting van de urine albumine Kreatinine ratio en individuele glomerulaire waterdoorlaatbaarheid, evenals zowel structurele als Ultra structurele onderzoek met behulp van de periodieke Zure Schiff Vlek- en elektronenmicroscopie. Bovendien maakt een analyse van de genen dysregulated op het niveau van mRNA en eiwit mechanistische analyse van glomerulaire functie. Dit protocol beschrijft het generieke maar flexibele methoden die kunnen worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Urine werd verzameld met behulp van metabole kooien van wild type (WT), afleidbare podocyte-specifieke VEGF-A knock out (VEGF-A KO) en VEGF-A KO X Neph-VEGF165b muizen (VEGF-A KO muizen die over het uitdrukken van de menselijke VEGF-A165b isovorm in de podocytes in een constitutieve wijze). Bij meting van de urine albumine Kreatinine ratio in de weken 0, 4, 10 en 14 na doxycycline inductie van VEGF-A KO ontwikkeld VEGF-A KO muizen progressieve albuminurie door 10 weken in vergelijking met WT littermate besturingselementen. De absolute waarden te zien in figuur 2A, en de genormaliseerde tot de basislijn van de waarden van elke muis in figuur 2B. Albuminuria in niet waargenomen in de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (Figuur 2), die aangeeft dat VEGF-A165b is echter beschermende in het model van albuminurie5.
De glomerulaire LpAVik werd gemeten in individuele glomeruli gezeefd uit WT, VEGF-A KO en VEGF-A X Neph-VEGF-A165b nieren. Een voorbeeld van hoe een glomerulus is gevangen en de krimp waargenomen wanneer perifused met 8% BSA wordt weergegeven in figuur 3A. Deze krimp wordt vervolgens gebruikt voor het bepalen van de glomerulaire LpA / Vik voor elke glomerulus (figuur 3B). VEGF-A KO muizen had een aanzienlijk verhoogde glomerulaire LpA / Vik 14 weken post VEGF-KO inductie in vergelijking met WT controle glomeruli. Hoewel lager in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen, de verhoogde glomerulaire LpA / Vik was niet wordt gehinderd door overmatige expressie van VEGF-A165b op 14 weken5.
PAS kleuring van nier cortex secties 14 weken na de inductie van VEGF-A KO openbaarde niet eventuele glomerulaire structurele afwijkingen in de VEGF-A KO of VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (figuur 4A). Echter bij de analyse van de glomerulaire ultra-structuur via EM, VEGF-A KO muizen had ontwikkeld een verhoogde GBM-breedte, daalde het aantal endothelial fenestrae, daalde van SPS dekking en toegenomen gemiddelde podocyte Breedte gleuf (figuur 4C-4F ). De gemiddelde podocyte voet breedte en aantal spleten bleef onveranderd (figuur 3B en 3 G) verwerken. Overmatige expressie van VEGF-A165b in de VEGF-A KO muizen voorkomen van de wijzigingen op de GBM en gleuf breedte (figuur 4C en 4F). VEGF-A165b had echter geen effect op de gewijzigde fenestrae nummer en SPS dekking (Figuur 4 d en 4E)5.
RT-PCR uitgevoerd op RNA geëxtraheerd uit gezeefde glomeruli bleek dat de menselijke VEGF-A165b mRNA alleen aanwezig in de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b muizen (figuur 5A is). Wanneer eiwit wilt uitpakken vanaf de gezeefde glomeruli en beoordeling van de niveaus van eiwitten via het westelijke bevlekken, de glomerulaire eiwit expressie van VEGFR-2 bleek te zijn verminderd in VEGF-A KO muizen, die werd verhinderd door overmatige expressie van VEGF-A165b ( Figuur 5B en 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figuur 1. Schetsmatig instellen voor de glomerulaire permeabiliteit (Lpvan A) rig. (A) de glomerulus is gevangen op (B) de micropipet binnen een houder met behulp van zuiging, die op een mount voor stabiliteit is geklemd. (C) rechthoekige microslide. (D) 4 X doelstelling van een microscoop met een videocamera. (E) 1% BSA oplossing opgewarmd tot 37 ° C. (F) 8% BSA oplossing opgewarmd tot 37 ° C. (G) afstandsbediening Tik op dragende twee perifusate-bevattende lijnen, waardoor snelle perifusate uitwisseling. (H) Route van perifusate naar de microslide, die vervolgens de glomerulus baadt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figuur 2. Urine albumine Kreatinine ratio. (A) de uACR-waarden in de weken 0, 4, 10 en 14 na de inductie van VEGF-A KO in WT, VEGF-A KO en VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen. (B) dezelfde uACR waarden genormaliseerd naar de waarde van de basislijn (week 0) van elke individuele muis. De uACR aanzienlijk verhoogd in muizen VEGF-A KO op weken 10 en 14 vergeleken met WT littermate besturingselementen, waardoor werd in de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (* p < 0.05; Two-way ANOVA, correctie voor vergelijking tussen paren; n = 4-12 muizen per tijdstip; foutbalken: standaardfout van het gemiddelde [SEM]). Dit cijfer is gewijzigd van Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figuur 3. Meting van de glomerulaire waterdoorlaatbaarheid. (A) de glomerulus is betrapt op het micropipet via de zuigkracht; de perifusate is overgestapt van 1% BSA (Ai) naar 8% BSA (Aii) en glomerulaire krimp wordt waargenomen. (B) metingen vóór en na de 8% BSA-schakeloptie worden gebruikt om te bepalen van de glomerulaire LpA / Vik. (C) VEGF-A KO muizen ontwikkelen een grotere glomerulaire LpA / Vik 14 weken post inductie van VEGF-A KO in vergelijking met de WT-besturingselementen. Dit was niet significant voorkomen in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (* p < 0.05; One way ANOVA, Bonferroni correctie voor vergelijking tussen paren; n = 4-9 muizen, 15-30 de glomeruli; foutbalken: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figuur 4. Glomerulaire structurele analyse. (A) PAS kleuring van de nier cortex deed niet geven eventuele structurele afwijkingen in de glomeruli van WT, VEGF-A KO en VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (Ai - iii). EM geopenbaard Ultra structurele afwijkingen in de glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) de gemiddelde FPW veranderde niet tussen groepen. (C) de GBM steeg in de glomeruli VEGF-A KO, die werd verhinderd door VEGF-A165b. (D) het aantal fenestrae werd afgenomen in VEGF-A KO glomeruli, die bleef ongewijzigd door VEGF-A165b. (E) de SPS dekking was daalde in VEGF-A KO glomeruli, die ook bleef onveranderd door VEGF-A165b. (F) het gemiddelde breedte gleuf werd verhoogd in de glomeruli VEGF-A KO, die werd verhinderd door VEGF-A165b. (G) het nummer van de gleuf was onveranderd tussen de drie groepen (* p < 0.05; One way ANOVA, Bonferroni correctie voor vergelijking tussen paren; n = 3 muizen, 9 glomeruli; foutbalken: SEM). Dit cijfer is gewijzigd van Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figuur 5. mRNA en eiwit expressie van markers. (A) RT-PCR bleek dat menselijke VEGF-A165b mRNA uitdrukking alleen zichtbaar in de gezeefde glomeruli van VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b muizen. (B) westelijke bevlekken aangegeven dat VEGFR-2 eiwit expressie down-gereglementeerde in VEGF-A KO glomeruli was, die was verhinderd in VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0.05; One way ANOVA, Bonferroni correctie voor vergelijking tussen paren; n = 3 - 6 muizen; foutbalken: SEM). Dit cijfer is gewijzigd van Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Een eenvoudige methode van de Muis van Lung intubatie

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Evaluatie van de hartfunctie en myocard morfologie Met kleine dieren Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI bij ratten

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Beoordeling van de rechter ventrikel structuur en functie in een muismodel van longslagader Vernauwing door Transthoracale Echocardiografie

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Evaluatie van de vaatfunctie bij patiënten met chronische nierziekte

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Muis Niertransplantatie: Modellen van transplantaatafstoting

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Het gebruik van ultra-hoge gebied MRI in kleine knaagdieren Modellen van Polycystic voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotypering and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transcutane beoordeling van de nierfunctie in Conscious Knaagdieren

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutane Chirurgische denervatie: een methode voor de Eis Testen op Zenuwen in muismodellen van huidziekte

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Herhaalde Meting van Respiratory spieractiviteit en Ventilatie in muismodellen van neuromusculaire aandoening

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...