Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
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Ce travail a été soutenu par la Fondation britannique de cardiologie, Richard Bright VEGF Research Trust et la MRC.

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	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Les étapes critiques de chaque méthode permettant l’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, y compris l’évaluation de la perméabilité des reins dans son ensemble (mesures d’uACR et plasmatique créatinine), la perméabilité des les glomérules (glomérulaire LpA / Vj’ai), examen des altérations structurales (Fe, Trichrome bleu et EM), localisation des protéines (IF) et l’expression des gènes glomérulaire (RT-PCR et Western Blot). Ces méthodes sont essentielles pour l’évaluation complète de la fonction glomérulaire dans des modèles murins de la maladie rénale.
Lors de l’évaluation de la perméabilité du GFB, de nombreuses études ont choisi d’utiliser le taux de l’excrétion d’albumine uACR ou 24h classique comme une mesure efficace17,18. Ces techniques permettent l’évaluation de la perméabilité GFB dans son ensemble, il ne permet pas pour l’évaluation de la perméabilité glomérulaire individuels et variation parmi les glomérules. Des études antérieures ont trouvé la mesure de la glomérulaire LpA / Vi une mesure plus sensible des modifications apportées à la GFB perméabilité5,9. En effet, dans les résultats représentatifs démontrés dans cet article, à 14 semaines après induction de VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b souris ont présenté un uACR significativement plus faible par rapport aux souris VEGF-A KO ; Cependant, ce résultat n’est pas reflété dans le glomérulaire LpA / Vje mesures, où VEGF-A165b n’empêche pas sensiblement augmente dans le GFB perméabilité (Figure 1 et Figure 2)5. Cela montre l’importance d’utiliser plusieurs tests pour évaluer la perméabilité rénale tant la perméabilité des glomérules individuels. En outre, le glomérulaire LpA / test de V oncometricje suggère que la perméabilité des différents glomérules du rein même peut varier considérablement, en particulier la maladie modèles5,10, 19. l’une des limitations à la mesure de la glomérulaire LpA / Vj’ai est qu’il ne peut être effectuée à la fin de l’expérimentation ; ainsi, uACR régulière des mesures sont nécessaires pour donner une indication de l’effet expérimental.
En plus d’évaluer le phénotype fonctionnel, la présente méthode encourage également évaluation du phénotype structurel et ultrastructural. Cela peut être fait à l’aide d’une sélection des taches telles que PAS, trichrome et des taches argent ; chacun pour évaluer différents aspects de la morphologie glomérulaire. Dans les modèles aiguës de la maladie glomérulaire, qui est souvent le cas dans des modèles murins, est peut être difficile de détecter d’éventuelles anomalies structurelles principales à l’aide de ces taches, sauf si vous êtes un pathologiste rénal formé. Exécution de EM est donc proposé d’évaluer l’ultrastructure de GFB, qui permet la mesure quantitative des paramètres tels que le GBM, fenestrae endothéliales taille et nombre et caractéristiques podocyte. Ces mesures exigent une formation minimale à effectuer et permet au chercheur de déterminer les structures cellulaires-types/affectés à un modèle de maladie. Dans l’exemple illustré dans les résultats représentatifs, la souris VEGF-A KO a été trouvée pour être un modèle doux de la maladie glomérulaire, ainsi, aucune anomalie structurale majeure n’était présents sur le PAS de coloration. Toutefois, podocyte spécifiques VEGF-A KO n’a induit des changements pour le GBM, podocytes et les cellules endothéliales lorsqu’on examine le glomérulaire ultra-structure5. Malheureusement, la préparation du rein pour EM décrit dans la méthode actuelle ne permet pas de détecter le glycocalyx endothélial, qui est également connu pour avoir des effets significatifs sur la perméabilité du GFB19. Afin de mesurer avec précision la profondeur de glycocalyx, le rein doit être perfuse-fixés au glutaraldéhyde de 2,5 % au bleu Alcian 1 % pour l’étiquetage de glycocalyx endothéliale, comme décrit dans Oltean et al.,19.
Une fois que le phénotype fonctionnel et structurel ont été évalués, les patrons d’expression/activation de gènes différents et les voies puis évaluer plus précisément dans les glomérules. Assessment ultra-structurale préalable pourrait donner quelques informations concernant la cellule types/glomérulaire structures impliquées, indiquant si les gènes spécifiques podocyte ou endothéliales et des sentiers doivent être examinés. Par exemple, dans les résultats représentatifs des souris KO VEGF-A, une réduction du nombre de perforations endothéliales a été observée (Figure 3D) ; par conséquent, l’expression de la protéine glomérulaire d’un marqueur endothélial connu pour être impliqués dans la voie du VEGF-A a été examinée ; VEGFR-2 (Figure 4 b)5. En plus de l’expression des protéines dans les glomérules, leur localisation peut également être visualisée à l’aide de si. Dans une étude par Zhang et al.20, podocyte spécifiques surexpression de GLUT1 a été confirmée dans les podocytes par si co localisation les GLUT1 accrue avec podocin.
Par rapport aux autres méthodes présentées dans la littérature pour évaluer la fonction glomérulaire, l’utilisation de la méthode décrite dans cet article pour évaluer la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire permet le phénotype glomérulaire à être pleinement évalué à partir plusieurs aspects. En utilisant cette méthode, le chercheur est en mesure de déterminer le phénotype de rein du modèle et d’évaluer le mécanisme quant à pourquoi le phénotype se développe. Cette information vitale sur le mécanisme de la maladie est requise lors de l’examen des possibilités thérapeutiques dans ces modèles. Cette méthode peut être facilement appliquée à de nouvelles études en fonction glomérulaire dans l’évaluation des phénotypes de la maladie et la thérapeutique possible.
En conclusion, ce protocole générique et adaptable décrit une marche à suivre complète rein pour modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

L’utilisation de modèles murins pour imiter la maladie de rein humain devient de plus en plus fréquente. Ces modèles murins comprennent les modèles spontanées par exemple spontanément hypertensive rats (RSH)1, par la streptozotocine (STZ)-induced rats diabétiques et souris2, et la db/db type II souris diabétiques3, modèles issus du génie génétique comme primaire spécifique podocyte segmentaire glomérulaire sclérose focale (FSG) modèles4, le podocyte spécifiques vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF-A) knock out (VEGF-A KO) modèle5, syndrome d’Alport modèles et6et acquis les modèles tels que la néphrectomie de 5/67 et l’obstruction urétérale unilatérale (UUO)8. Afin d’évaluer les différents aspects de la fonction glomérulaire dans ces modèles, il existe plusieurs techniques. Le but de cet article de méthode doit démontrer une marche à suivre complète qui doit être effectuée dans des modèles murins de la maladie rénale afin d’évaluer pleinement la fonction glomérulaire.
La justification de l’utilisation de cette méthode est qu’il permet le phénotype glomérulaire à être pleinement évalué à partir des aspects multiples. Cela inclut l’évaluation de la perméabilité glomérulaire, tant aux protéines et à l’eau, anomalies structurelles glomérulaires et changements dans l’expression/épissage des ARNm et de protéines essentielles pour la fonction glomérulaire normale. En utilisant cette méthode, le chercheur est en mesure de déterminer le phénotype de rein du modèle et d’évaluer le mécanisme quant à pourquoi le phénotype se développe. Il s’agit d’informations vitales sur le mécanisme de la maladie, qui est requise lors de l’examen des possibilités thérapeutiques dans ces modèles.
Dans la littérature, c’est une chose courante sera présenté avec un modèle murin de la maladie glomérulaire où le phénotype est déterminé par une augmentation du niveau d’albumine dans les urines. Cependant, il existe des preuves suggérant qu’une seule méthode pour déterminer la fonction glomérulaire n’est pas toujours efficace ; mesurer le taux d’excrétion urinaire de l’albumine ou la créatinine urinaire d’albumine (uACR) seulement fournit des informations sur la fonction rénale totale et pas des glomérules individuels. Des études antérieures ont démontré que la perméabilité peut varier dans les différents glomérules du rein même5,9,10. En outre, l’évaluation de la perméabilité des glomérules individuels est une manière plus sensible de l’évaluation de la fonction glomérulaire ; la technique de mesure de la perméabilité glomérulaire individuels (LpA / Vi) a montré pour être plus sensible aux changements dans la fonction glomérulaire que mesurer l' uACR9. Ce dosage est bénéfique dans des modèles murins qui résistent à une protéinurie, telles que celles sur un fond de c57BL/611. L’avantage du présent livre méthode c’est qu’il examine à la fois la perméabilité rénale totale à l’albumine ainsi que la perméabilité glomérulaire individuelle à l’eau.
Examen des anomalies structurelles glomérulaires est souvent évaluée par une batterie des taches telles que les Schiff d’acide périodique (APS), trichrome et des taches argent. Ceux-ci permettent un pathologiste rénal formé évaluer le niveau de l’insuffisance rénale par une méthode de notation. Bien que toutes les bonnes méthodes, modifications apportées à la macro-structure glomérulaire ne sont pas toujours respectées dans l’insuffisance rénale aiguë modèles12. Cette méthode propose qu’en plus des techniques d’histologie rénale décrites ci-dessus, l’ultra-structure glomérulaire devrait aussi être appréciée par l’intermédiaire de la microscopie électronique (EM). Un glomérule teinté peut sembler relativement normale sous un microscope optique ordinaire ; Toutefois, lors de l’évaluation avec EM, petits changements dans la largeur de la membrane basale glomérulaire (MBG), podocyte pied effacement de processus, fenestrations endothéliales et la couverture de l’espace sub-podocyte est analysée. Par conséquent, il est vital que l’ultra-structure glomérulaire et la microstructure est évalué afin de déterminer le mécanisme de la dysfonction glomérulaire.
En plus d’évaluer les anomalies structurelles glomérulaires, changements dans l’ARNm et expression de la protéine et l’épissage, ainsi qu’activation de la protéine (par exemple, la phosphorylation), doivent être examinées pour élucider davantage les mécanismes de la maladie glomérulaire. Quand on regarde la maladie glomérulaire, ou, par exemple, lorsque KO/over-expressing un gène spécifiquement dans les cellules glomérulaires, comme dans le podocyte spécifiques VEGF-A KO souris5, il est important que les changements d’ARNm et de protéines sont examinées que dans le les cellules glomérulaires et pas le rein entier. Ce protocole décrit une méthode dans laquelle les glomérules sont isolées à partir du cortex rénal de souris, et puis la protéine/ARN sont isolés. Cela permet une analyse spécifique de la protéine/ADN messagère dérèglement dans les glomérules du modèle de la maladie.
Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

L’utilisation de modèles murins pour imiter la maladie de rein humain devient de plus en plus fréquente. Notre recherche est axée sur l’évaluation de la fonction glomérulaire dans la néphropathie diabétique et podocyte spécifiques VEGF-A souris knock out ; par conséquent, ce protocole décrit la marche à suivre complète rein utilisé dans notre laboratoire pour évaluer ces modèles murins de la maladie glomérulaire, permettant une grande quantité d’informations au sujet de rein et de la fonction glomérulaire à provenir d’une seule souris. Par rapport aux autres méthodes présentées dans la littérature pour évaluer la fonction glomérulaire, l’utilisation de la méthode décrite dans cet article permet le phénotype glomérulaire à être pleinement évalué à partir des aspects multiples. En utilisant cette méthode, le chercheur peut déterminer le phénotype de rein du modèle et évaluer le mécanisme quant à pourquoi le phénotype se développe. Cette information vitale sur le mécanisme de la maladie est requise lors de l’examen des possibilités thérapeutiques dans ces modèles. Les méthodes permettant une évaluation fonctionnelle détaillée de la barrière de filtration glomérulaire par mesure de la créatinine urinaire d’albumine et perméabilité glomérulaire individuels, ainsi que l’examen tant structurel qu’ultra-structurale à l’aide de la coloration à l’acide périodique de Schiff et microscopie électronique. En outre, l’analyse de la dysrégulation de gènes au niveau de l’ARNm et de protéines permet analyse mécaniste de la fonction glomérulaire. Ce protocole décrit les méthodes génériques mais adaptables qui peuvent être appliquées à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Urine ont été recueilli à l’aide de cages métaboliques de type sauvage (WT), inductible podocyte spécifiques VEGF-A knock out (VEGF-A KO) et la VEGF-A KO X Neph-VEGF165b souris (souris VEGF-A KO qui surexpriment l’isoforme b de humaine VEGF-A165dans les podocytes dans un manière constitutive). À la mesure de la créatinine urinaire d’albumine aux semaines 0, 4, 10 et 14 après l’induction de la doxycycline de VEGF-A KO, KO VEGF-A souris ont développé albuminurie progressive de 10 semaines par rapport aux témoins de même portée WT. Les valeurs absolues sont visibles dans la Figure 2 aet le normalisé à la base de valeurs de chaque souris Figure2 b. Cependant, albuminurie dans pas observé chez les souris de b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (Figure 2), indiquant que de VEGF-A165b assure une protection dans le modèle de l’albuminurie5.
Le glomérulaire LpAVj’ai a été mesurée dans les glomérules individuels tamisés de WT, VEGF-A KO et VEGF-A X Neph-VEGF-A165b reins. Un exemple de comment un glomérule est interceptée et le rétrécissement observé lorsque perfusées avec 8 % de BSA sont indiquée dans la Figure 3 a. Ce retrait est ensuite utilisé pour déterminer la glomérulaire LpA / Vj’ai pour chaque glomérule (Figure 3 b). Souris KO VEGF-A eu une augmentation significative glomérulaire LpA / V j’à 14 semaines après induction de VEGF-KO par rapport aux glomérules contrôle WT. Bien que plus faible chez les souris de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, l’augmentation glomérulaire LpA / Vj’ai ne était pas empêché par la surexpression du VEGF-A165b à 14 semaines5.
PAS la coloration des parties du cortex rénal 14 semaines après l’induction de VEGF-A KO n’a révélé aucune anomalies structurelles glomérulaires chez le VEGF-A KO ou VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Figure 4 a). Cependant, après une analyse de la structure ultra glomérulaire par EM, souris KO VEGF-A avaient développé une largeur accrue de GBM, a diminué le nombre de perforations endothéliales, a diminué de couverture SPS et augmenté podocyte moyenne largeur de fente (Figure 4-4F ). Le pied moyen podocyte traite largeur et nombre de fentes est demeurée inchangée (Figure 3 b et 3 G). La surexpression du VEGF-A165b chez les souris KO VEGF-A empêche les changements sur le GBM et fente de largeur (Figure 4 et 4F). Cependant, VEGF-A165b a eu aucun effet sur le nombre de perforations altérée et le SPS couverture (Figure 4 et 4E)5.
RT-PCR effectuée sur l’ARN extrait de glomérules tamisées a révélé que le VEGF-A165b humaine ARNm n’est présent que chez les souris de b165VEGF-A KO X Neph-VEGF-A (Figure 5 a). Lors de l’extraction protéique de glomérules tamisées et d’évaluer les niveaux de protéines par Western Blot, l’expression de la protéine glomérulaire du VEGFR-2 s’est avérée être tombée chez la souris KO VEGF-A, qui a été empêché par la surexpression du VEGF-A165b ( Figure 5 b et 5c)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> La figure 1. Diagrammatique mise en place de la plate-forme de la perméabilité glomérulaire (LpA). (A) le glomérule est interceptée sur (B) la micropipette dans un support à l’aide de succion, qui est fixé sur une monture pour la stabilité. (C) rectangulaire micro-lames. (D) les objectif 4 X d’un microscope avec une caméra vidéo. (E) solution à 1 % BSA chauffé à 37 ° C. (F) 8 % solution de BSA chauffé à 37 ° C. (G) Remote tap portant deux lignes contenant périfusées, permettant l’échange rapide périfusées. (H) Route de périfusées vers des micro-lames, qui baigne ensuite le glomérule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figure 2. Créatinine urinaire d’albumine. (A) les valeurs d’uACR aux semaines 0, 4, 10 et 14 après l’induction de VEGF-A KO chez WT, VEGF-A KO et VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. (B) les mêmes valeurs uACR normalisés à la valeur de base (semaine 0) de chaque souris individuels. L’uACR a notablement augmenté chez les souris VEGF-A KO aux semaines 10 et 14 par rapport aux témoins WT de même portée, qui n’a pas pu chez les souris de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05 ; ANOVA bidirectionnelle, correction pour la comparaison entre les paires ; n = 4-12 souris par point dans le temps ; barres d’erreur : erreur-type de la moyenne [SEM]). Ce chiffre a été modifié par Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figure 3. Mesure de la perméabilité glomérulaire. (A) le glomérule est pris sur la micropipette par aspiration ; la périfusées sont passée de 1 % de BSA (IA) à 8 % de BSA (Aii), et on observe une rétraction glomérulaire. (B) les mesures prises avant et après le passage de BSA 8 % servent à déterminer la glomérulaire LpA / Vj’ai. (C) VEGF-A KO souris développent une augmentation glomérulaire LpA / V j’à 14 semaines après induction de VEGF-A KO par rapport aux témoins WT. Cela n’empêche pas significativement chez les souris de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (* p < 0,05 ; Aller simple ANOVA, correction de Bonferroni pour comparaison entre paires ; n = 4-9 souris, 15-30 glomérules ; barres d’erreur : SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figure 4. Analyse structurale glomérulaire. (A) PAS de coloration du cortex rénal n’a pas indiqué toutes les anomalies structurales dans les glomérules, les souris de b165WT, VEGF-A KO et VEGF-A X Neph-VEGF-A (Ai - iii). EM a révélé des anomalies ultra-structurale dans les glomérules VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la moyenne FPW n’a pas changé entre les groupes. (C) le GBM a augmenté dans les glomérules KO VEGF-A, qui a été empêché par le VEGF-A165b. (D) le nombre de fenêtres est diminué dans les glomérules KO VEGF-A, qui est resté inchangés de VEGF-A165b. couverture de la SPS (E) a été diminué en glomérules KO VEGF-A, qui est également resté inchangés de VEGF-A165b. (F) la moyenne largeur de fente a été augmentée dans les glomérules KO VEGF-A, qui a été empêché par le VEGF-A165b. (G) le nombre de fente est demeurée inchangé entre les trois groupes (* p < 0,05 ; Aller simple ANOVA, correction de Bonferroni pour comparaison entre paires ; n = 3 souris, 9 glomérules ; barres d’erreur : SEM). Ce chiffre a été modifié par Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figure 5. expression ARNm et de protéines de marqueurs. (A) RT-PCR a montré qu’expression de l’ARNm humaine VEGF-A165b n’était évidente dans les glomérules tamisées de souris de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b. (B) Western Blot a indiqué que VEGFR-2 expression de la protéine était diminuées dans les glomérules VEGF-A KO, qui n’a pas pu en glomérules de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (* p < 0,05 ; Aller simple ANOVA, correction de Bonferroni pour comparaison entre paires ; n = 3 - 6 souris ; barres d’erreur : SEM). Ce chiffre a été modifié par Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

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