Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
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Questo lavoro è stato supportato dalla British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust e il MRC.

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	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. 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T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Consentono i passaggi critici di ogni metodo per dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, compresa la valutazione della permeabilità dei reni nel suo complesso (misure della creatinina del plasma e dell'uACR), la permeabilità della singoli dei glomeruli (glomerulare LpA / Vho), esame delle alterazioni strutturali (PAS, Trichrome blu ed EM), la localizzazione della proteina (se) e l'espressione genica glomerulare (RT-PCR e Western blotting). Questi metodi sono fondamentali per la valutazione completa della funzione glomerulare in modelli murini di malattia renale.
Nel valutare la permeabilità della GFB, molti studi hanno optato per utilizzare il tasso di escrezione dell'albumina dell'uACR o 24h convenzionale come una misura efficace17,18. Anche se queste tecniche permettono la valutazione della permeabilità GFB nel suo complesso, non consente per la valutazione individuale permeabilità glomerulare e variazione tra i glomeruli. Gli studi precedenti hanno trovato misura del glomerulare LpA / V,i , per essere una misura più sensibile delle modifiche al GFB permeabilità5,9. Infatti, nei risultati della rappresentativi ha dimostrati in questa carta, a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO, VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b topi hanno un significativamente più bassa dell'uACR rispetto ai topi KO VEGF-A; Tuttavia, questo risultato non viene riflessa nella glomerulare LpA / Vho misure, dove VEGF-A165b non ha impedito significativamente aumenta in GFB permeabilità (Figura 1 e Figura 2)5. Ciò dimostra l'importanza di utilizzare saggi multipli per valutare sia la permeabilità del rene e la permeabilità dei glomeruli individuali. Inoltre, la glomerulare LpA / Vho oncometric l'analisi suggerisce che la permeabilità dei glomeruli individuali dal rene stesso può variare notevolmente, in particolare malattia modelli5,10, 19. una limitazione alla misura la glomerulare LpA / Vho è che essa può essere eseguita solo nel punto finale sperimentale; Pertanto, misure regolari dell'uACR vengono richiesto di fornire un'indicazione del punto finale sperimentale.
Oltre a valutare il fenotipo funzionale, il presente metodo incoraggia inoltre la valutazione del fenotipo strutturale ed ultrastrutturale. Questo può essere fatto utilizzando una selezione di macchie quali PAS, tricromica e le macchie d'argento; ogni valutare diversi aspetti della morfologia glomerulare. Nei modelli acuti della malattia glomerulare, che è spesso il caso in modelli murini, è può essere difficile da rilevare eventuali anomalie strutturali maggiori utilizzando queste macchie, a meno che non sei un patologo renale addestrato. Di conseguenza, realizzazione di EM è suggerito per valutare l'ultrastruttura di GFB, che permette la misurazione quantitativa di parametri quali il GBM, fenestrae endoteliale e numero le dimensioni caratteristiche del Podocita. Tali misure richiedono una formazione minima eseguire e permette al ricercatore di determinare la cella-tipi e strutture interessate in un modello di malattia. Nell'esempio indicato nei risultati rappresentativi, il mouse VEGF-A KO è stato trovato per essere un modello delicato della malattia glomerulare, così, non presenti anomalie strutturali maggiori erano presenti al momento di colorazione PAS. Tuttavia, specifici del Podocita VEGF-A KO ha indotto i cambiamenti il GBM, podociti e cellule endoteliali durante l'esame l' ultra-struttura glomerulare5. Purtroppo, la preparazione del rene per EM descritte nel presente metodo non attivare il rilevamento del glicocalice endoteliale, che è anche conosciuto per avere effetti significativi sulla permeabilità del GFB19. Al fine di misurare con precisione la profondità di glicocalice, rene dovrebbe essere irrorare-fisso con glutaraldeide 2,5% con 1% Alcian blu per l'etichettatura di glicocalice endoteliale, come descritto in Oltean et al.19.
Una volta che sono stati valutati il fenotipo funzionale e strutturale, il pattern di espressione/attivazione di diversi geni e vie quindi può essere valutato specificamente nei glomeruli. Previa valutazione ultra-strutturale potrebbe dare alcune informazioni per quanto riguarda la cella tipi/glomerulare strutture coinvolte, che indica se Podocita o endoteliali specifici geni/pathways dovrebbe essere esaminato. Ad esempio, nei risultati rappresentativi dai topi KO VEGF-A, è stata osservata una riduzione del numero di fenestrae endoteliale (Figura 3D); Pertanto, l'espressione della proteina glomerulare di un indicatore endothelial noto per essere coinvolti nella via del VEGF-A è stato esaminato; VEGFR-2 (Figura 4B)5. Oltre l'espressione delle proteine nei glomeruli, la loro localizzazione possa anche essere visualizzata con se. In uno studio di Zhang et al.20, specifiche del Podocita sovraespressione di GLUT1 è stata confermata in podociti di se co-localizza il GLUT1 aumentata con podocina.
Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'uso del metodo descritto in questo documento per valutare la funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare permette il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. Questo metodo può essere applicato facilmente per le indagini future in funzione glomerulare nella valutazione di fenotipi di malattia e di terapeutica potenziale.
In conclusione, questo protocollo generico ed adattabile descrive un work-up completo del rene per modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. Tali modelli murini includono spontanea come spontaneamente ipertesi (SHR) ratti1, streptozotocin (STZ)-indotta in ratti diabetici e topi2, e il db/db tipo II topi diabetici3, modelli geneticamente come primaria specifiche del Podocita sclerosi glomerulare segmentale focale (FSGS) modelli4, specifici del Podocita endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF-A) knock-out (KO VEGF-A) modello5, e la sindrome di Alport modelli6e acquisito modelli come la nefrectomia di 5/67 e l'ostruzione ureteral unilaterale (UUO) modello8. Al fine di valutare i diversi aspetti della funzione glomerulare in questi modelli, sono disponibili diverse tecniche. Lo scopo di questa carta di metodo è quello di dimostrare un work-up completo che deve essere eseguito in modelli murini di malattia renale al fine di valutare appieno la funzione glomerulare.
La spiegazione razionale dietro l'uso di questo metodo è che esso consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Questo include la valutazione della permeabilità glomerulare, sia di proteine e di acqua, le anomalie strutturali glomerulari e cambiamenti nell'espressione/impionbatura di mRNA e proteine essenziali per la normale funzione glomerulare. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Si tratta di informazioni vitali sul meccanismo della malattia, che è necessaria quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli.
Nella letteratura, è un evento comune per essere presentato con un modello murino di malattia glomerulare dove il fenotipo è determinato da un aumento del livello di albumina nelle urine. Tuttavia, ci è prova per suggerire che un unico metodo per determinare la funzione glomerulare non è sempre efficace; misura il tasso di escrezione urinaria dell'albumina o il rapporto di creatinina urinaria dell'albumina (dell'uACR) fornisce solo informazioni sulla funzione renale totale e non dei singoli glomeruli. Precedenti studi hanno dimostrato che la permeabilità può variare in glomeruli differenti dalla stessa rene5,9,10. Inoltre, la valutazione della permeabilità dei glomeruli individuali è un modo più sensibile di valutazione della funzione glomerulare; la tecnica di misurazione della permeabilità glomerulare individuali (LpA / Vio) ha dimostrato di essere più sensibili ai cambiamenti nella funzione glomerulare rispetto alla valutazione dell'uACR9. Questo test è utile in modelli murini che sono resistenti alla proteinuria, come quelle su una priorità bassa c57BL/611. Il vantaggio della carta metodo attuale è che esamina sia la totale permeabilità renale all'albumina, nonché i singole glomerulare permeabilità all'acqua.
Esame delle anomalie strutturali glomerulari è spesso valutata tramite una batteria di macchie quali acido periodico Schiff (PAS), tricromica e le macchie d'argento. Questi strumenti consentono un patologo renale addestrato per valutare il livello di malattia renale tramite un metodo segnante. Anche se tutti i buoni metodi, le modifiche alla macro-struttura glomerulare non sono sempre rispettati nel danno renale acuto modelli12. Questo metodo propone che oltre a svolgere le tecniche di istologia renale sopra descritte, l'ultra-struttura glomerulare dovrebbe essere valutata anche tramite microscopia elettronica (EM). Un glomerulo macchiato può guardare relativamente normale microscopio ottico regolari; Tuttavia, al momento della valutazione con EM, piccoli cambiamenti nella membrana basale glomerulare (GBM) larghezza, Podocita piede processo effacement, fenestrazioni endoteliali e la copertura dello spazio sub-Podocita è analizzato. Pertanto, è essenziale che l'ultra-struttura glomerulare e la microstruttura è valutato per determinare il meccanismo di disfunzione glomerulare.
Oltre a valutare le anomalie strutturali glomerulari, cambiamenti in mRNA e l'espressione della proteina e splicing, come pure l'attivazione della proteina (ad es., fosforilazione), dovrebbero essere esaminati per più ulteriormente per delucidare i meccanismi della malattia glomerulare. Quando guardando la malattia glomerulare, o, per esempio, quando KO/over-expressing un gene specificamente in cellule glomerulari, ad esempio il Podocita specifiche VEGF-A KO del mouse5, è importante che i cambiamenti di mRNA e proteina sono esaminati solo all'interno del cellule glomerulari e non l'intero rene. Questo protocollo descrive un metodo in cui i glomeruli sono isolati dalla corteccia del rene del mouse, e quindi il proteina/RNA sono isolati. Questo permette l'analisi specifica della disregolazione della proteina/mRNA nei glomeruli di modello della malattia.
Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. La nostra ricerca è concentrata sulla valutazione della funzione glomerulare in nefropatia diabetica e specifiche del Podocita VEGF-A topi knock-out; di conseguenza, questo protocollo descrive il rene completo work-up utilizzato nel nostro laboratorio per valutare questi modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'utilizzo del metodo descritto in questo documento consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore può determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. I metodi consentono dettagliata valutazione funzionale della barriera di filtrazione glomerulare attraverso misurazioni del rapporto creatinina urinaria dell'albumina e permeabilità glomerulare individuali, così come esame sia strutturale che ultra-strutturale usando la macchia dello Schiff dell'acido periodico e la microscopia. Inoltre, analisi della dysregulated geni a livello di mRNA e proteina consente analisi meccanicistica della funzione glomerulare. Questo protocollo descrive i metodi generici ma adattabili che possono essere applicati a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Urina è stata raccolta utilizzando gabbie metaboliche da wild type (WT), inducibile Podocita specifiche VEGF-A knock out (VEGF-A KO) e VEGF-A KO X Jhonny-VEGF165b topi (VEGF-A KO topi che over-esprimono l'isoforma b umano VEGF-A165in podociti in un maniera costitutiva). Su misura del rapporto albumina urinaria della creatinina alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di doxiciclina di VEGF-A KO, VEGF-A KO topi sviluppato progressivo albuminuria da 10 settimane rispetto al WT littermate controlli. I valori assoluti può essere visto in Figura 2Ae la normalizzazione alla linea di base di ogni valori del mouse nella Figura 2B. Tuttavia, albuminuria in non osservato nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (Figura 2), che indica che il VEGF-A165b è protettiva nel modello dell'albuminuria5.
La glomerulare LpAVmi è stata misurata in singoli glomeruli setacciati da WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b reni. Un esempio di come un glomerulo viene catturato e la contrazione osservata quando perifused con 8% BSA è mostrato in Figura 3A. Questo restringimento viene quindi utilizzato per determinare la glomerulare LpA / Vho per ogni glomerulo (Figura 3B). Topi KO per il VEGF-A ha avuto un significativo aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-KO rispetto ai glomeruli controllo WT. Anche se più bassi in VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi, l'aumentata glomerulare LpA / V non è stato impedito di sovra-espressione di VEGF-A165b a 14 settimane5.
PAS di colorazione di sezioni di corteccia del rene 14 settimane dopo induzione di VEGF-A KO non ha rivelato alcune anomalie strutturali glomerulari nei VEGF-A KO o VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi (Figura 4A). Tuttavia, sull'analisi della ultra-struttura glomerulare tramite EM, VEGF-A KO topi avevano sviluppato una maggiore larghezza GBM, riduzione del numero di fenestrae endoteliale, è diminuito di copertura SPS e maggiore Podocita medio taglio (Figura 4-4F ). Il piede Podocita medio processo di larghezza e il numero di strisce è rimasto invariato (Figura 3B e 3G). Sovra-espressione di VEGF-A165b nei topi KO VEGF-A ha impedito i cambiamenti per il GBM e taglio (Figura 4 e 4F). Tuttavia, il VEGF-A165b ha avuto alcun effetto sul numero di fenestrae alterata e SPS copertura (Figura 4 e 4E)5.
RT-PCR effettuata su RNA Estratto da glomeruli setacciati ha rivelato che l'umano VEGF-A165b mRNA è presente solo nei topi di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (Figura 5A). Durante l'estrazione della proteina da glomeruli setacciati e valutazione dei livelli di proteine tramite Western blotting, l'espressione della proteina glomerulare di VEGFR-2 è stata trovata per essere diminuita in topi KO VEGF-A, che è stata impedita da sovra-espressione di VEGF-A165b ( Figura 5B e 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figura 1. Impostare schematica dell'impianto di perforazione permeabilità glomerulare (LpA). (A) il glomerulo è catturato su (B) la micropipetta all'interno di un supporto mediante aspirazione, che è fissato su un supporto per la stabilità. (C) rettangolare 2mpx. Obiettivo 4x (D) di un microscopio con una videocamera. (E) soluzione di BSA 1% riscaldato a 37 ° C. (F) soluzione all'8% BSA riscaldato a 37 ° C. (G) remoto toccare cuscinetto perifusate-contenente due linee, che consente lo scambio rapido perifusate. (H) itinerario di perifusate verso la 2mpx, che poi si bagna il glomerulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figura 2. Rapporto della creatinina urinaria dell'albumina. (A) i valori dell'uACR alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di VEGF-A KO in topi165b WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A. (B) gli stessi valori dell'uACR normalizzato al valore basale (settimana 0) di ogni singoli mouse. Dell'uACR aumentato significativamente in topi KO per VEGF-A alle settimane 10 e 14 confrontati ai comandi di littermate WT, che è stata impedita nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; ANOVA a due vie, correzione per il confronto tra le coppie; n = 4-12 topi al punto di tempo; barre di errore: errore standard della media [SEM]). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figura 3. Misura della permeabilità glomerulare. (A) il glomerulo è catturato la micropipetta tramite aspirazione; il perifusate è passato da BSA 1% (Ai) a 8% BSA (Aii), e restringimento glomerulare è osservato. (B) le misurazioni effettuate prima e dopo il passaggio di BSA 8% vengono utilizzate per determinare la glomerulare LpA / Vho. (C) VEGF-A KO topi sviluppano un aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO confrontati ai comandi WT. Questo non è stato impedito significativamente nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 4-9 topi, 15-30 glomeruli; barre di errore: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figura 4. Analisi strutturale glomerulare. (A) PAS macchiatura della corteccia del rene non ha indicato tutte le anomalie strutturali nei glomeruli da topi WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ha rivelato le anomalie ultrastrutturali nei glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la media FPW non è cambiato tra gruppi. (C) The GBM aumentato nei glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (D) il numero di fenestrae è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che è rimasto inalterati dalla copertura di VEGF-A165b. (E) la SPS è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che inoltre è rimasto invariati da VEGF-A165b. (F) la media a taglio larghezza è stata aumentata in glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (G) il numero di fessura è rimasto invariato fra i tre gruppi (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 topi, 9 glomeruli; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figura 5. espressione di mRNA e proteina di marcatori. (A) RT-PCR ha mostrato che umana espressione di mRNA di VEGF-A165b solo era evidente nei glomeruli setacciati dai topi di VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b. (B) Western blotting hanno indicato che l'espressione della proteina VEGFR-2 era down-regolata in glomeruli VEGF-A KO, che è stata impedita in glomeruli di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 - 6 topi; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

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