Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

この作品は、英国心臓財団、リチャード ・ ブライト VEGF 研究トラストと MRC によって支持されました。

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、糸球体疾患、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量の有効化のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。腎臓の全体 (uACR および血漿クレアチニン測定)、透磁率の評価を含む、糸球体の機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にする各メソッドで重要な手順の透磁率個々 の球体 (糸球体 LpA/V は私)、構造変化 (PAS、ブルー、Trichrome、EM)、蛋白質のローカリゼーション (IF) と糸球体の遺伝子発現 (RT-PCR および西部にしみが付くこと) の検討。これらのメソッドは、腎疾患のマウスモデルの糸球体の機能を完全に把握するための鍵です。
GFB の透水性を評価する際、多くの研究は効果的な対策17,18として従来 uACR または 24 h アルブミン排泄率を使用するオプトインしています。これらのテクニックは、全体として GFB 透過性の評価をできるように、個々 の糸球体透過性評価と球体の間で変動のためそれはできません。以前の研究は、糸球体の LpA の測定を発見した/Vi GFB 透磁率5,9への変更のより敏感な指標となります。確かに、本稿で示した代表的な結果で 14 週に投稿 VEGF-A KO の誘導、VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b マウス VEGF-A KO マウス; と比較して有意に低い uACRただし、この結果、糸球体の LpA に反映されません GFB 透磁率 (図 1および図 2)5V私計測、VEGF-A165b は大幅防ぐない増加/。これは腎臓の透水性と個々 の糸球体の透過性の両方を評価するために複数のアッセイを使用しての重要性を示しています。さらに、糸球体の LpA/V私oncometric アッセイは、同じ腎臓から個々 の糸球体の透過性が大きく異なることが、特に疾患モデル5,10,を示唆しています。19. 糸球体 LpA を測定する 1 つの制限/V私はそれすることができますのみ; 実験的なエンドポイントで実行されることしたがって、正規 uACR 測定実験のエンドポイントの指示を与える必要があります。
機能の表現型を評価するとともに本法はまた構造と微細構造の表現の評価を推奨します。これを行うことができます PAS、ヒアリンなど汚れやシルバーの汚れの選択を使用して各糸球体形態のさまざまな側面を評価します。これはしばしばマウス モデルの場合、糸球体疾患の急性のモデルでは、訓練された腎病理医でない限り、これらの汚れを使用して任意の主要な構造異常を検出することは困難することができます。したがって、EM の遂行が糸球体基底膜、内皮 fenestrae サイズと数、およびポドサイト特性などのパラメーターの定量化を可能にする GFB の微細構造を評価するために示唆されました。そのような測定を実行する最小限のトレーニングを必要とするでき、疾患モデルで影響を受けるセル-型/構造決定する捜査官。例では代表的な結果に VEGF-A KO マウスが発見された糸球体疾患の軽度のモデルであること、したがって、主要な構造異常が存在しない PAS 染色時に。ただし、ポドサイト固有 VEGF-A KO でした変化を誘発する糸球体基底膜、足細胞、内皮細胞糸球体の超構造5を調べるとき。残念なことに、EM 法に記載されているため、腎臓の準備 GFB19の透磁率に重大な影響があることも知られている内皮の糖衣の検出を有効にしません。糖衣の深さを正確に測定するために腎臓はずの内皮糖衣 1% アルシアン ブルーと 2.5% グルタルアルデヒド灌流固定 Olteanら19で説明されているようです。
機能的及び構造的表現型が評価され、一度異なる遺伝子および細道の式/アクティベーション パターン、糸球体では特に評価できます。事前の超構造評価の種類/糸球体構造関係、ポドサイトまたは内皮特異遺伝子/経路を検討すべきかどうかを示すセルに関するいくつかの情報を与えることができます。たとえば、VEGF-A KO マウスから代表的な結果、内皮 fenestrae 数の減少は、(図 3 D) を認められた;したがって、VEGF の経路に関与すると知られている血管内皮マーカーの糸球体蛋白発現を検討しました。VEGFR 2 (図 4 b)5。糸球体のタンパクの発現、に加えて局在も場合を使用して視覚化することができます。張ら20による調査で、ポドサイト固有 GLUT1 の発現は、共同 podocin と増加の GLUT1 をローカライズする場合、足で確認されました。
糸球体の機能を評価するために文献の提示の方法と比較して糸球体疾患のマウスモデルの腎機能を評価するために本稿で説明した方法を使用できますから完全に評価する糸球体の表現型複数の側面。このメソッドを使用して、研究者はモデルの腎臓の表現型を決定し、表現型を開発する理由とメカニズムを評価することができます。病気のメカニズムに重要な情報は、これらのモデルの潜在的な治療手段を調べる場合に必要です。このメソッドは、疾患表現型と潜在的な治療の評価における糸球体機能に将来の調査に簡単に適用できます。
結論としては、このジェネリックと適応プロトコルは、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量の有効化、糸球体疾患のマウスモデルの仕事アップにおける腎臓をについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

ひと腎臓疾患を模倣するマウスモデルの使用はますます一般的になっています。マウスのようなモデルは、自然発症高血圧ラット (SHR)1, ストレプトゾトシン (STZ) など自発的なモデル-誘発糖尿病ラットとマウス2と db/db タイプ II 糖尿病マウス3、遺伝子組み換えモデルプライマリ ポドサイト固有焦点区域糸球体硬化症 (FSGS) モデル4、ポドサイト固有血管内皮増殖因子 (VEGF A) ノックアウト (KO VEGF-A) モデル5とアルポート症候群モデルの6、および取得5/6 腎7など片側尿管閉塞 (UUO) モデル8モデル。これらのモデルにおける腎糸球体機能のさまざまな側面を評価するためにいくつかのテクニックがあります。本方法の目的は、包括的な作業を完全に糸球体の機能を評価するために腎臓病のマウス ・ モデルで実行する必要がありますを示すことです。
このメソッドを使用しての背後にある理論的根拠は、複数の側面から評価される完全に糸球体の表現が可能です。これは糸球体の透過性、タンパク質と水と糸球体の構造異常と Mrna やタンパク質の正常な糸球体機能のために不可欠の式/スプライシングの変化の両方評価含まれています。このメソッドを使用して、研究者はモデルの腎臓の表現型を決定し、表現型を開発する理由とメカニズムを評価することができます。これは、これらのモデルの潜在的な治療上の道を調べるときに必要なある病気のメカニズムに重要な情報です。
文学、尿中アルブミンの増加レベルで決まる糸球体疾患のマウスモデルで提示される一般的な現象です。しかし、糸球体の機能を決定する単一のメソッドが常に効果的なないことを示唆する証拠があります。尿中アルブミン排泄率または尿中アルブミン クレアチニン比 (uACR) 測定は、総腎機能および個々 の糸球体にだけ情報を提供します。以前の研究では同じ腎臓5,9,10から異なる糸球体透過性が変化する場合を示しています。さらに、個々 の糸球体の透過性の評価は、糸球体機能を評価するためのより敏感な方法個々 の糸球体の水の透過性を測る手法 (LpA/V は私) uACR9の測定よりも糸球体機能の変化により敏感になることを示しています。この試金は、蛋白尿、c57BL/6 背景11などに耐性のあるマウス モデルで有益です。メソッド本稿の利点は、それが水に個々 の糸球体透過性と同様、両方のアルブミン総腎透磁率を調べることです。
糸球体の構造異常の検討はしばしば電池など過ヨウ素酸シッフ (PAS)、ヒアリン、汚れや銀汚れによって評価されます。これらは、スコアリング法による腎疾患のレベルを評価する訓練された腎病理医を有効にします。すべての良い方法の糸球体のマクロ構造の変更がで常に観察されていませんが、急性腎障害は12をモデル化します。このメソッドは、上記の腎組織学手法を実施に加えで、糸球体の超構造する必要があります電子顕微鏡 (EM) で評価されるも提案します。染色糸球体は通常光学顕微鏡の下で比較的普通に見ることができます。ただし、EM、糸球体基底膜 (GBM) 幅の小さな変化で評価にポドサイト足プロセス卑下、内皮のピンホールとサブ ポドサイト領域カバレッジに分析されます。したがって、糸球体超構造と微細構造の両方が糸球体障害のメカニズムを決定する評価が不可欠です。
糸球体の構造異常を評価するとともに、さらに糸球体疾患のメカニズムを解明する mRNA とタンパク質の発現とスプライシングと同様にタンパク質の活性化 (例えば、リン酸化)、変更を検討すべき。糸球体疾患を見るときとか、例えば、KO/オーバー-expressing ポドサイト固有 VEGF-A KO マウス5のような糸球体の細胞で遺伝子はタンパクと mRNA の変化が内にのみ検討が重要なとき、糸球体細胞、腎全体ではないです。このプロトコルでは、糸球体マウス腎皮質から分離されたタンパク質・ RNA、分離法について説明します。これは疾患モデルの糸球体における蛋白質/mRNA 不全の特定の分析をことができます。
このプロトコルでは、糸球体疾患、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量の有効化のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

ひと腎臓疾患を模倣するマウスモデルの使用はますます一般的になっています。我々 の研究は糖尿病性腎症とポドサイト固有 VEGF A ノックアウト マウスを用いて糸球体機能の評価に焦点を当ててください。したがって、このプロトコルは、糸球体疾患、腎臓および単一のマウスから得られる糸球体の機能に関する情報の膨大な量を有効にすることのこれらのマウスのモデルを評価するために我々 の研究室で使用される完全腎臓仕事アップについて説明します。糸球体の機能を評価するために文献の提示の方法と比較して本稿で説明したメソッドを使用して有効複数の側面から評価される完全に糸球体の表現型にします。このメソッドを使用して、研究者はモデルの腎臓の表現型を決定し、表現型を開発する理由とメカニズムを評価できます。病気のメカニズムに重要な情報は、これらのモデルの潜在的な治療手段を調べる場合に必要です。構造・超構造検討と同様、尿中アルブミン ・ クレアチニン比および個々 の糸球体水透磁率の測定による糸球体濾過障壁の詳細な機能評価を可能にする方法過ヨウ素酸シッフ染色、電子顕微鏡を使用しています。さらに、mRNA やタンパク質のレベルで遺伝子の調節不全の分析には、糸球体の機能の解明ができます。このプロトコルは、糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用できる汎用が適応できる方法を紹介します。

尿は、野生型 (WT)、誘導ポドサイト固有 VEGF A ノックアウト (VEGF-A KO)、VEGF-A 島 X Neph VEGF165b マウスから代謝ケージを使用して収集した (表現、球体のヒト VEGF A165b アイソ フォーム VEGF-A KO マウス、構成方法)。VEGF-A KO のドキシサイクリン誘導後 0、4、10、14 週で尿中アルブミン クレアチニン比の測定、VEGF-A の KO マウスは WT 濾胞と比較して 10 週間によって進歩的な蛋白尿を開発しました。絶対値は、図 2 a、および図 2 bに各マウスの値の基準に正規化で見ることができます。しかし、VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウス (図 2) で蛋白尿は認めその VEGF の165を示す b は蛋白尿5モデルの保護。
糸球体 LpAV は私は WT、VEGF-A の島、VEGF-A X Neph の VEGF-A165b 腎臓からふるわれた個々 の糸球体で測定しました。例、糸球体のキャッチ方法と収縮の観察 8 %bsa を用いで3 a を図に表示される場合。この収縮し、糸球体の LpA を調べるため/V私の各糸球体 (図 3 b)。VEGF の KO マウスは、大幅に増加した糸球体 LpA/V私14 週間でポスト WT 制御糸球体と比較して VEGF KO 誘導。VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウス、高められた糸球体 LpA で下が 14 週5で VEGF A165b の過剰発現によって妨げられていない私V/。
PAS 染色腎臓皮質セクションの VEGF-A 島導入後 14 週 VEGF-A KO または VEGF-A X Neph の VEGF-A の165b マウス (図 4 a) 糸球体構造的な異常を明らかにしなかった。ただし、EM を介して糸球体微細構造の分析、VEGF-A の KO マウスいた増加の GBM 幅を開発、fenestrae 内皮細胞の数を減少、SPS カバレッジを減少、平均ポドサイトのスリット幅を増加 (図 4-4 階).平均ポドサイト足は、スリットの変わらずに残った (図 3B と 3 G) の幅と数を処理します。VEGF-A165b VEGF-A KO マウスでの過剰発現は、GBM への変更を防止し、スリット幅 (図 4 ・ 4 f)。ただし、VEGF-A165b には、変更された fenestrae 数と SPS カバレッジ (図 4 および 4E)5の影響はなかった。
RT-PCR ふるわれた腎糸球体から抽出した RNA 上で実行は、ヒト VEGF A165b mRNA がのみに存在する (図 5 a) VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b マウスを明らかにしました。VEGFR 2 糸球体蛋白発現は VEGF-A165b (の過剰発現によって防がれた VEGF-A KO マウスで減少する発見されたふるわれた腎糸球体および西部にしみが付くことによって蛋白質のレベルを評価するからタンパク質を抽出する場合図 5B , 5 C)5。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> 図 1。糸球体透過性 (LpA) リグの図式設定します。(A)糸球体がキャッチ安定性のためのマウントの上にクランプする(B)マイクロ ピペット吸引を使用してホルダー内に。(C)長方形 microslide。(D)ビデオ カメラで顕微鏡の 4 X の目的。(E) 1 %bsa 溶液 37 ° C に加温(F) 8 %bsa 溶液 37 ° C に加温(G)リモート タップ ベアリング 2 perifusate を含む行、急速な perifusate 交換を許可します。(H)し、糸球体を bathes microslide に向かって perifusate のルートです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> 図 2。尿中アルブミン クレアチニン比。(A) WT、VEGF-A の島、VEGF-A X Neph の VEGF-A の165b マウスにおける VEGF-A の KO の誘導後 0、4、10、14 週間で uACR 値。(B)同じ uACR 値はそれぞれ個々 のマウスの基準値 (週 0) に正規化します。UACR 大幅増加 VEGF-A KO マウス週 10 と 14 WT 濾胞と比較して VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウスができなかった (* p < 0.05;二元、ペアの比較のための補正n = 4-12 マウス時間ポイントごと誤差範囲: [SEM] 平均値の標準誤差)。この図は、スティーブンスら5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> 図 3。糸球体の水透過性の測定。(A)吸引; を介してマイクロ ピペットで糸球体をキャッチperifusate が 1 %bsa (Ai) から 8 %bsa (Aii) に切り替わるし、糸球体の収縮が観察されます。(B) 8 %bsa スイッチ前後の測定値決定される糸球体 LpA/V は私。(C) VEGF-A KO マウスを開発する高められた糸球体 LpA/V私14 週間でポスト VEGF-A KO WT コントロールと比較しての誘導。これは大幅 VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウスで妨げられない (* p < 0.05;一方通行 ANOVA、ボンフェローニ補正の組み合わせの比較n = 4-9 マウス, 15-30, 糸球体;誤差範囲: SEM)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> 図 4。糸球体の構造解析。(A) PAS 陽性腎皮質は WT、VEGF-A の島、VEGF-A X Neph の VEGF-A165b マウス (Ai - iii) から糸球体の構造的な異常を示さなかった。EM は、VEGF-A 島糸球体 (Aiv - vi) の超構造異常を明らかにしました。(B)グループ間平均 FPW は変更しませんでした。(C)は糸球体基底膜増加 VEGF-A 島糸球体における VEGF A165b (D) fenestrae は VEGF-A165* (E) 、SPS 報道によって不変に残った VEGF-A 島糸球体の減少によって防がれました。いたも VEGF A165b (F)スリット幅平均は VEGF-A 島糸球体で増加したがそのまま残った、VEGF-A 島糸球体の減少を変更されなかった VEGF-A165b (G)スリット数によって防がれました。3 つのグループの間 (* p < 0.05;一方通行 ANOVA、ボンフェローニ補正の組み合わせの比較n = 3 のマウス, 9 糸球体;誤差範囲: SEM)。この図は、スティーブンスら5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> 図 5。 マーカーの mRNA および蛋白質の表現。(A) RT-PCR ヒト VEGF A165b mRNA 発現のみ VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b マウスからふるわれた球体で明らかにされたことを示した。(B)西部にしみが付くことを示した VEGFR 2 発現 VEGF-A 島糸球体でダウン規制 VEGF-A 島 X Neph-VEGF-A165b 糸球体で防がれた (* p < 0.05;一方通行 ANOVA、ボンフェローニ補正の組み合わせの比較n = 3-6 マウス;誤差範囲: SEM)。この図は、スティーブンスら5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

このプロトコルでは、糸球体疾患のマウス ・ モデルで実施する必要があります完全腎臓の仕事-アップについて説明します。糸球体疾患のすべてのマウスのモデルに適用することができます糸球体機能の詳細な機能・構造・機構解析を可能にするメソッド。

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

マウス肺挿管の簡単な方法

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

小動物ルックロッカー反転回復（サリー）ラットにおけるMRIを用いた心機能と心筋形態の評価

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

経胸壁心エコー検査による肺動脈狭窄のマウスモデルにおける右室の構造と機能の評価

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

慢性腎臓病患者における血管機能の評価

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

マウス腎臓移植：同種移植片拒絶のモデル

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

のための多発性嚢胞腎疾患の小齧歯類モデルにおける超高磁場MRIの使用<em&gt;インビボ</em&gt;表現型と薬物モニタリング

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

皮膚外科神経切除：皮膚病のマウスモデルにおける神経のための要件をテストする方法

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

神経筋疾患のマウスモデルにおいて呼吸筋活動および換気の繰り返し測定

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

糸球体疾患のマウス・モデルにおける腎機能の評価