Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

이 작품은 영국 심장 재단, 리처드 밝은 VEGF 연구, 믿음과 MRC에 의해 지원 되었다.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 각 방법의 중요 한 단계 (uACR 및 플라즈마 크 측정), 전체적으로는 신장에의 침투성의 평가 포함 하 여 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석에 대 한 허용의 침투성 개별 glomeruli (사 LpA / V나), 구조 변경 (파, Trichrome 블루, 그리고 EM), 단백질 지 방화 (면), 그리고 사 유전자 발현 (RT-PCR 및 서쪽 blotting)의 검사. 이 메서드는 키 사 기능 신장 질병 마우스 모델에서의 전체 평가를.
GFB의 침투성을 평가할 때 효과적인 측정17,18로 기존의 uACR 또는 24 시간 알 부 민 배설 속도 사용 하 여 많은 연구 하셨습니다. 비록 이러한 기술을 허용 전체 GFB 침투성의 평가, 개별 사 침투성 평가 및 glomeruli 사이 유사에 대 한 허용 하지 않습니다. 이전 연구는 사 LpA의 측정 발견 / Vi GFB 침투성5,9에 변화의 더 민감한 측정 될. 사실,이 문서에서 설명 하는 대표적인 결과에서 14 주에 게시 VEGF-A 코의 유도, VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐 VEGF-A 코 쥐;에 비해 상당히 낮은 uACR 그러나,이 결과는 사 LpA에에서 반영 되지 않습니다 / V나 측정, VEGF A165b 크게 방지 하지 않았다 GFB 침투성 (그림 1 및 그림 2)5증가. 이 신장 침투성 및 개별 glomeruli의 침투성을 평가 하기 위해 여러 개의 분석 실험을 사용의 중요성을 보여줍니다. 또한, 사 LpA / V나 oncometric 분석 결과 제안 같은 신장에서 개별 glomeruli의 침투성 크게 다를 수 있습니다, 특히 질병 모델5,10, 19. 사 LpA를 측정 한 제한 / V나 그것만 실험 끝점;에서 수행할 수 있습니다 따라서, 일반 uACR 측정 실험 끝점의 표시를 제공 해야 합니다.
기능 형 평가, 이외에 현재 메서드는 또한 구조 및 ultrastructural 표현 형의 평가 권장 합니다. 이 행 해질 수 있다 파, trichrome, 같은 얼룩은 얼룩;의 선택을 사용 하 여 각 사 형태학의 다양 한 측면을 평가 하기 위해. 종종 마우스 모델의 경우는 사 병의 급성 모델에는 어떤 주요 구조적 이상이 있습니다 훈련된 신장 병리학이이 얼룩을 사용 하 여 감지 하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, EM 수행 평가 매개 GBM, 내 피 fenestrae 크기 및 수, 및 podocyte 특성의 정량적 측정을 허용 GFB의 열 대권 외 건의 된다. 이러한 측정 수행에 최소한의 교육 요구 및 셀-종류/구조는 질병 모델에 영향을 확인 하기 위해 조사를 수 있습니다. 예 대표 결과에 VEGF-A 코 마우스 발견 사 질병의 가벼운 모델로, 따라서, 아무 주요 구조적 이상이 파스 얼룩에 참석 했다. 그러나, podocyte 특정 VEGF-A 코 않았다 유도 GBM, podocytes, 및 내 피 세포에 대 한 변경 사항을 사 울트라 구조5를 조사 하면. 불행 하 게도, 현재의 방법에서 설명 하는 그들에 대 한 신장의 준비 또한 GFB19의 침투성에 중요 한 영향으로 알려져 내 피 glycocalyx의 감지를 사용 하지 않습니다. Glycocalyx 깊이 정확 하 게 측정 하기 위해서는 신장 해야 합니다 2.5%도 내 피 glycocalyx 라벨에 대 한 1 %Alcian 블루 perfuse-고정 Oltean 외19에 설명 된 대로.
기능과 구조 표현 형 평가 되어, 일단 다른 유전자 및 통로의 식/활성화 패턴은 glomeruli에서 특히 평가 다음 수 있습니다. 이전 초 구조 평가 관련 된, podocyte 또는 내 피-특정 유전자/경로 검사 해야 합니다 여부를 나타내는 형식/사 구조 셀에 대 한 몇 가지 정보를 줄 수 있습니다. 예를 들어 VEGF-A 코 쥐에서 대표적인 결과에서 내 피 fenestrae 수에 있는 감소 (그림 3D) 관찰 되었다; 따라서, VEGF A 통로에 관련 된 것으로 알려져 내 피 마커의 사 단백질 발현 조사 되었다; VEGFR-2 (그림 4B)5. glomeruli에 단백질의 표현 뿐만 아니라 그들의 지 방화 수 또한 구상 될 경우를 사용 하 여. 연구에서 장 외20, podocyte 특정 overexpression GLUT1의 공동 podocin와 증가 GLUT1 지역화 하는 경우 의해 podocytes에서 확인 됐다.
사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교 사 질병 마우스 모델에서 신장 기능을 평가 하기 위해이 문서에서 설명 하는 메서드를 사용 하 여 수에서 완전히 평가 하 사 형 여러 측면입니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 이 메서드는 질병 고기 및 잠재적인 치료제의 평가에 모두 사 기능으로 미래의 수사에 쉽게 적용할 수 있습니다.
결론적으로,이 일반 및 적응 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에 대 한 전체 신장 작업을 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 이러한 murine 모델 포함 자발적인 모델을 자연스럽 게 고혈압 쥐 (SHR)1, streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐와 쥐2, 유도 및 db/db 타입 II 당뇨병 쥐3와 같은 유전자 조작된 모델 기본 podocyte 특정 초점 단편 사 경화 증 (FSGS) 모델4, podocyte 특정 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF-A) 노크 아웃 (VEGF-A 코) 모델5, 그리고 Alport 증후군6, 모델 인수 5/6 신7 과8의 일방적인 ureteral 방해 (UUO) 모델 등 모델. 이러한 모델에서 사 기능의 다양 한 측면을 평가, 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 종이의 목적은 완전히 평가 사 기능 신장 질환의 마우스 모델에서 수행 해야 하는 포괄적인 작업 최대 보여.
이 메서드를 사용 하 여 뒤에 근거는 그것 완전히 여러 측면에서 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 평가 사 침투성, 단백질, 물, 사 구조 이상, 그리고 식/mRNAs 및 단백질 정상 사 기능에 대 한 필수의 접합에 변화를 포함 한다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 이것은 이러한 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요한은 질병의 메커니즘에 대 한 중요 한 정보 이다.입니다.
문학, 그것은 사 질병 표현 형의 소변에서 알 부 민 증가 수준에 의해 결정 됩니다의 마우스 모델을 제시 하는 일반적인 발생. 그러나, 증거가 제안 사 기능을 결정 하는 하나의 방법을 하지 항상 효과; 총 신장 기능, 그리고 개별 glomeruli의 정보를 제공 합니다만 요 알 부 민 배설 속도 또는 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)를 측정. 이전 연구 침투성 다른 glomeruli 같은 신장5,,910에서에서 변화할 수 있다 설명 했다. 또한, 개별 glomeruli의 침투성의 평가 평가 사 기능;의 더 민감한 방법 개별 사 물 침투성 측정 기술 (LpA / V나) uACR9측정 보다 사 기능에서 변화에 더 민감한 것으로 나타났습니다. 이 분석 결과 저항 proteinuria c57BL/6 배경11등을 마우스 모델에서 유용 합니다. 현재 방법 종이의 장점은 그것은 알 부 민을 총 신장 침투성 뿐만 아니라 개별 사 침투성 물 검사.
사 구조적 이상이의 검사는 종종 얼룩 등 정기 산 Schiff (PA), trichrome, 그리고 실버 얼룩의 배터리에 의해 평가 됩니다. 이러한 점수 매기기 방법을 통해 신장 질병의 수준을 평가 하는 훈련된 신장 병리학 자 가능 모든 좋은 방법, 사 매크로 구조에 변화에 항상 나타나지 않으면 비록 급성 신장 손상 모델12. 이 메서드는 실행 위에서 설명한 신장 조직학 기술, 뿐만 아니라 사 울트라 구조 또한 평가 되어야 합니다 전자 현미경 (EM)를 통해 제시 한다. 얼룩진된 glomerulus 상대적으로 일반 조명 현미경; 정상 볼 수 있습니다. 그러나, EM, 작은 변화, 사 지하실 멤브레인 (GBM) 폭에서과 평가 시 podocyte 발 과정 겸, 내 피 fenestrations, 그리고 하위-podocyte 공간 범위 분석 이다. 따라서, 사 울트라-구조와 마이크로 구조 사 역의 메커니즘을 확인 평가 생명 이다.
평가 사 구조 이상, 뿐만 아니라 사 질병의 메커니즘을 더 명료 하 mRNA와 단백질 표정 및 접합로 단백질 활성화 (예를 들어, 인 산화), 변화를 시험 한다. 사 병을 볼 때 또는, 예를 들어, 코/오버-expressing 유전자는 podocyte 전용 VEGF-A 코 마우스5, 같이 사 셀에 특히 중요 하다 단백질 mRNA의 변화만 내 검사는 사 세포, 그리고 전체 신장 하지입니다. 이 프로토콜 있는 glomeruli 마우스 신장 피 질에서 격리 되며 다음 단백질/RNA 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 질병 모델의 glomeruli 단백질/mRNA dysregulation의 특정 분석을 수 있습니다.
이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 우리의 연구는 당뇨병 신 장병 및 podocyte 관련 VEGF A 녹아웃 쥐; 사 기능 평가에 초점을 맞춘합니다 따라서,이 프로토콜 설명 전체 신장 작업-최대 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하면 사 병의 이러한 마우스 모델을 평가 하기 위해 우리의 실험실에 사용 합니다. 사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교이 문서에 설명 된 메서드를 사용 하 여 여러 측면에서 완전히 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있습니다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 방법의 구조와 매우 구조 시험 뿐만 아니라 오 줌 알 부 민 크 비율 및 개별 사 물 침투성, 측정을 통해 사 여과 방 벽의 상세한 기능 평가 대 한 허용 정기 산 Schiff 얼룩이 및 전자 현미경을 사용 하 여. 또한, mRNA와 단백질 수준에 유전자 dysregulated의 분석을 사 기능의 기계적 분석을 수 있습니다. 이 프로토콜 사 질병의 모든 마우스 모델에 적용 될 수 있는 일반 하지만 적응할 수 있는 방법을 설명 합니다.

야생 타입 (WT), (VEGF-A 코), 밖으로 유도할 수 있는 podocyte 전용 VEGF A 노크와 VEGF-A 코 X Neph-VEGF165b 쥐 대사 케이지를 사용 하 여 소변 수집 (VEGF-A 코 쥐-인간의 VEGF A165b isoform에 podocytes에서 표현 하는 구성 방식)입니다. 측정 오 줌 알 부 민 크 비율의 주 0, 4, 10, 14에서 VEGF-A 코의 doxycycline 유도 후, 시 VEGF-A 코 쥐 10 주 WT littermate 컨트롤에 비해 진보적인 단백뇨를 개발. 그림 2A, 및 그림 2B에 각 마우스 값의 기준선에 정규화 된 절대 값을 볼 수 있습니다. 그러나,에서 단백뇨 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 생쥐 (그림 2)에서 관찰 되지 않는 그 VEGF A165b은 단백뇨5의 모델에서 보호입니다.
사 LpAV나 개별 glomeruli WT, VEGF-A 코, VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 신장에서 sieved에서 측정 했다. 어떻게는 glomerulus는 고 수축의 예로 그림 3A에서8 %BSA perifused 표시 하면 관찰. 이 수축 사 LpA를 결정 하는 데 사용은 / V나 각 glomerulus (그림 3B)에 대 한. VEGF A 코 쥐 했다는 크게 증가 사 LpA / V나 14 주에 WT 제어 glomeruli에 비해 VEGF 코 유도 포스트. 비록 낮은 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐, 증가 사 LpA / V나 14 주5에서 VEGF A165b-식으로 하지 못했습니다.
싶어 서 신장 피 질 부분의 VEGF-A 코의 유도 후 14 주 얼룩 VEGF-A 코 또는 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 생쥐 (그림 4A)에서 어떤 사 구조 이상 공개 하지 않았다. 그러나, 그들을 통해 사 울트라 구조 분석, 시 VEGF-A 코 쥐 했다 증가 GBM 폭을 개발, 내 피 fenestrae의 수를 감소, SPS 범위 감소 및 평균 podocyte 슬릿 폭을 증가 (그림 4C-4 층 ). 평균 podocyte 피트 폭 및 슬릿 변하지 않게 남아 있었다 (그림 3B 및 3 세대)의 수를 처리합니다. -표현의 VEGF-A 코 쥐에서 VEGF A165b는 GBM을 변화를 방해 하 고 슬릿 폭 (그림 4C 와 4 층). 그러나, A VEGF165b이 했다 변경 된 fenestrae 수와 SPS 범위 (그림 4D 및 4E)5에 영향을 주지 않습니다.
RT-PCR 체질된 glomeruli에서 추출한 RNA에 수행 이라고 밝혔다 인간의 VEGF A165b mRNA만 (그림 5A) VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에. VEGF A165b ( -식에 의해 방지 되었다 VEGF-A 코 생쥐에서 감소 VEGFR-2의 사 단백질 표정 발견 체질된 glomeruli 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 통해 단백질의 수준을 평가 하 고에서 단백질을 추출 하는 경우 그림 5B 와 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> 그림 1입니다. 사 침투성 (LpA) 장비의 도식 설정. (A)는 glomerulus 적발 (B) 흡입을 사용 하 여 홀더 내 micropipette에 안정성에 대 한 마운트에 고정 됩니다. (C) 사각형 microslide입니다. (D) 4 X 비디오 카메라와 현미경의 목적. (E) 37 ° c 1 %BSA 솔루션 따뜻하게 ((F)) 8 %BSA 솔루션 37 ° c 예 열 (G) 원격 탭 베어링 두 포함 하는 perifusate 라인 빠른 perifusate 교류를 허용 합니다. (H) 다음은 glomerulus 목욕 microslide로 perifusate의 경로입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> 그림 2입니다. 요 알 부 민 크 비율입니다. (A) uACR 값 0, 4, 10, 및 14 주 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐에서 VEGF-A 코의 유도 후에. (B) 같은 uACR 값을 기준 값 (주 0) 각 개별 마우스의 정규화. uACR 주 10와 14 WT littermate 컨트롤에 비해 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 방해 했다 VEGF-A 코 쥐에 크게 증가 (* p < 0.05; 양방향 ANOVA, 쌍; 사이의 비교에 대 한 보정 n = 4-12 시간 포인트; 당 쥐 오차 막대: [SEM] 의미의 표준 오류). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> 그림 3입니다. 사 물 침투성의 측정입니다. (A) 는 glomerulus 흡입; 통해 micropipette에 잡힌 perifusate 1 %BSA (Ai)에서 8 %BSA (좋아), 전환 그리고 사 수 축을 관찰. (B) 측정 전후에 8 %BSA 스위치를 사용 하 결정 사 LpA / V나. (C) 마우스 VEGF-A 코 개발 한 증가 사 LpA / V나 14 주에 포스트 VEGF-A WT 컨트롤에 비해 코의 유도. 이것은 크게 막을 수 없습니다 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 있는 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 4-9 마우스, 15-30 glomeruli; 오차 막대: sem의). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> 그림 4입니다. 사 구조 분석입니다. (A) 파 신장 피 얼룩 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐 (Ai-iii)에서 glomeruli에 어떤 구조적 이상이 표시 하지 않았다. EM은 VEGF-A 코 glomeruli (Aiv-vi)에 매우 구조적 이상이 나타났다. (B) 평균 FPW 그룹 사이 변화 하지 않았다. (C)는 GBM 증가 VEGF-A 코 glomeruli는 VEGF A165b. fenestrae 수 VEGF-A 코 glomeruli, VEGF A165b. (E)는 SPS 보도 의해 불변에 남아 있었다 감소 되었다 (D) 에 의해 방지 되었다 이었다 VEGF-A 코 glomeruli, 또한 VEGF A165b. 슬릿 폭 평균 VEGF-A 코 glomeruli에 증가 되었다 (F) 불변에 남아 있었다에서 감소는 VEGF A165b. (G) 슬릿 수에 의해 방지 되었다 아니었다 변경 3 개 그룹 사이 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3 마우스, 9 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> 그림 5. 마커의 mRNA와 단백질 표정. (A) RT-PCR 인간의 VEGF A165b mRNA 표현 했다 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에서 체질된 glomeruli 분명만 보였다. (B) 서 부 럽 표시는 VEGFR-2 단백질 표정 VEGF-A 코 glomeruli 아래로 통제 되는 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b glomeruli에서 방지 되었다 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3-6 쥐; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

연구

의학

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

작은 동물 룩 로커 반전 복구 (SALLI) 쥐의 MRI를 사용하여 심장 기능 및 심근 형태학의 평가

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

경 흉부 심 초음파에 의한 폐동맥 수축의 마우스 모델에서 마우스 오른쪽 심실 구조 및 기능의 평가

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

만성 신장 질환 환자에서 혈관 기능의 평가

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

대한 다낭성 신장 질환의 작은 설치류 모델에서 매우 높은 필드 MRI의 사용<em&gt; 생체</em&gt; 표현형 의약품 모니터링

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

의식 설치류에서 신장 기능의 경피 평가

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

신경 근육 질환의 마우스 모델에서 호흡 근육 활동 및 환기의 반복 측정

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...