Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust og MRC.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Kritisk trinnene i hver metode tillate detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, inkludert vurdering av permeabilitet av nyrene som helhet (uACR og plasma creatinine målinger), permeabilitet av Personlige glomeruli (glomerular LpA / Vjeg), undersøkelse av strukturelle endringer (PAS Trichrome blå og EM), protein lokalisering (hvis) og glomerular genuttrykk (RT PCR og vestlige blotting). Disse metodene er nøkkelen til full vurdering av glomerular-funksjonen i musen modeller av nyre sykdom.
Når vurdere permeabilitet av GFB, har mange studier valgt for å bruke konvensjonelle uACR eller 24 h albumin utskillelse hastigheten som et effektivt tiltak17,18. Selv om disse teknikkene tillater vurdering av GFB permeabilitet som helhet, tillater den ikke for individuelle glomerular permeabilitet vurdering og variasjon blant glomeruli. Tidligere studier har funnet måling av glomerular LpA / Vjeg å være litt mer følsomme for den GFB permeabilitet5,9. Faktisk, i representative resultatene i dette papiret, på 14 uker innlegg induksjon av VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus har en betydelig lavere uACR sammenlignet med VEGF-A KO mus; men dette resultatet er ikke reflektert i glomerular LpA / Vjeg målinger, hvor VEGF-en165b ikke hindre betydelig øker i GFB permeabilitet (figur 1 og figur 2)5. Dette viser viktigheten av å bruke flere analyser for å vurdere både nyre permeabilitet og permeabilitet av personlige glomeruli. Videre glomerular LpA / Vjeg oncometric analysen antyder at permeabilitet av personlige glomeruli fra samme nyre kan variere sterkt, spesielt i sykdom modeller5,10, 19. en begrensning å måle glomerular LpA / Vjeg er at det kan bare utføres på den eksperimentelle end-point; vanlige uACR mål må derfor gi en indikasjon på den eksperimentelle sluttpunktet.
I tillegg til å vurdere funksjonelle fenotypen, oppfordrer metoden finnes også vurdering av strukturelle og ultrastructural fenotypen. Dette kan gjøres ved hjelp av et utvalg av flekker som PAS, trichrome, og sølv flekker; hver å vurdere ulike aspekter av glomerular morfologi. I akutt modeller av glomerular sykdom, som ofte er tilfelle i musen modeller, kan være vanskelig å oppdage noe store strukturelle unormalt bruker disse flekker med mindre du er en utdannet nyre patologen. Derfor er gjennomfører EM foreslått for å vurdere ultrastructure av GFB, hvilke innrømmer kvantitativ måling av parametere som GBM, endotelial fenestrae størrelse og antall og podocyte egenskaper. Slik mål krever minimal opplæring til å utføre og gir etterforskeren å finne celle-typer/strukturer påvirket på en sykdom modell. I eksemplet som vises i representant resultatene VEGF-A KO musen ble funnet å være en mild modell av glomerular sykdom, dermed var ingen store strukturelle forandringer tilstede ved PAS flekker. Podocyte-spesifikk VEGF-A KO imidlertid indusere endringer i GBM, podocytes og endotelceller når undersøke glomerular ultra-struktur5. Utarbeidelse av nyre for EM beskrevet i stede metoden aktiverer dessverre ikke påvisning av endotelial glycocalyx, som også er kjent å ha viktige effekter på permeabilitet av GFB19. For å måle glycocalyx dybden, bør nyre være perfuse-fast med 2,5% glutaraldehyde med 1% Alcian blå for endotelial glycocalyx merking, som beskrevet i Oltean et al19.
Når funksjonelle og strukturelle fenotypen har blitt vurdert, kan deretter uttrykk/aktivisering mønstre av ulike gener og veier vurderes spesielt i glomeruli. Tidligere ultra strukturelle vurdering kan gi noen informasjon om cellen typer/glomerular strukturer involvert, som angir om podocyte - eller endothelial-spesifikk gener/veier bør undersøkes. For eksempel i representant resultatene fra VEGF-A KO musene, ble en reduksjon i hvor endotelial fenestrae observert (figur 3D); Derfor ble glomerular protein uttrykk for en endothelial markør kjent være involvert i VEGF-en veien undersøkt; VEGFR-2 (figur 4B)5. I tillegg til uttrykket av proteiner i glomeruli, kan deres lokalisering også visualiseres med hvis. I en studie av Zhang et al20, ble podocyte-spesifikke overuttrykte GLUT1 bekreftet i podocytes av hvis co lokalisere den økte GLUT1 med podocin.
I forhold til alternative metoder i litteraturen å vurdere glomerular funksjonen, gjør bruk av metoden skissert i denne utredningen å vurdere nyrefunksjon i musen modeller av glomerular sykdom glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. På denne måten, er forskeren kjøpedyktig avgjøre nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Denne viktige informasjonen på mekanismen av sykdommen er nødvendig når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene. Denne metoden kan lett brukes på fremtidige etterforskning glomerular funksjonen både i vurderingen av sykdom fenotyper og potensielle therapeutics.
Avslutningsvis beskriver denne generiske og tilpasningsdyktig protokollen en full nyre arbeidet opp for musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Bruk av murine modeller å etterligne menneskelige nyresykdom er stadig mer vanlig. Slike murine modeller inkluderer spontan modeller som spontant Hypertensiv rotter (SHR)1, streptozotocin (STZ)-indusert diabetiker rotter og mus2og db/db type II diabetiker mus3, genmodifiserte modeller som primære podocyte-spesifikke fokal Segmentinformasjon glomerular sklerose (FSGS) modeller4, den podocyte-spesifikke vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF A) knock-out (VEGF-A KO) modell5, og Alport syndrom modeller6, og kjøpt modeller som 5/6 nephrectomy7 og ensidig ureteral hindringen (UUO) modell8. Det finnes flere teknikker for å vurdere de ulike aspektene av glomerular funksjonen i disse modellene. Formålet med utredningen metoden er å vise en omfattende arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av nyresykdom for å fullt ut vurdere glomerular funksjon.
Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er at den lar glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. Dette inkluderer vurdere glomerular permeabilitet, både protein og vann, glomerular strukturelle unormalt og endringer i uttrykk/skjøting av mRNAs og proteiner viktig for normal glomerular funksjon. På denne måten, er forskeren kjøpedyktig avgjøre nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Dette er viktig informasjon på mekanismen av sykdom, som kreves når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene.
I litteraturen er det en vanlig foreteelse presenteres med en musemodell av glomerular sykdom der fenotypen bestemmes av et forhøyet nivå av albumin i urinen. Men er det bevis som tyder på at en enkel metode for å bestemme glomerular funksjon ikke er alltid effektiv; måle urin albumin utskillelse hastigheten eller urin albumin creatinine forholdet (uACR) bare gir informasjon på totalt nyre-funksjon, og ikke av de individuelle glomeruli. Tidligere studier har vist at permeabilitet kan variere i ulike glomeruli fra samme nyre5,9,10. I tillegg er vurdering av permeabilitet av personlige glomeruli mer følsom måte vurdere glomerular funksjon; teknikken å måle personlige glomerular vann permeabilitet (LpA / Vjeg) har vist seg for å være mer følsomme for endringer i glomerular funksjon enn måle uACR9. Denne analysen er nyttig i musen modeller som er resistente mot proteinuria, slik som de på en c57BL/6 bakgrunn11. Fordelen med denne metoden utredningen er at den undersøker både totale nyre permeabilitet til albumin samt individuelle glomerular permeabilitet til vann.
Undersøkelse av glomerular strukturelle unormalt vurderes ofte av et batteri av flekker som periodisk Acid Schiff (PAS), trichrome, og sølv flekker. Dette aktiverer en utdannet nyre patologen å evaluere nyresykdom via en scoring metode. Selv om alle gode metoder, endringer i glomerular makro-strukturen ikke er alltid observert i modeller akutt nyre skader12. Denne metoden foreslår at i tillegg til å utføre nyre histology teknikkene ovenfor, glomerular ultra-strukturen bør også vurderes via elektronmikroskop (EM). En farget glomerulus kan se relativt normalt under vanlig lys mikroskop; men på vurderingen EM, små endringer i glomerular kjeller membran (GBM) bredde, er podocyte foten prosessen effacement endotelial fenestrations og sub-podocyte plass dekningen analysert. Derfor er det viktig at både glomerular ultra-struktur og mikro-strukturen er vurdert for å avgjøre mekanismen av glomerular dysfunksjon.
I tillegg til å vurdere glomerular strukturelle unormalt, bør endringer i mRNA protein uttrykk og skjøting, samt protein Aktivisering (f.eks, fosforylering) undersøkes for å belyse ytterligere mekanismer av glomerular sykdom. Når du ser på glomerular sykdom, eller, for eksempel når KO/over-expressing et gen spesielt i glomerular celler, som podocyte-spesifikke VEGF-A KO musen5, er det viktig at protein og mRNA endringene er undersøkt bare innenfor den glomerular celler, og ikke hele nyrene. Denne protokollen beskriver en metode der glomeruli er isolert fra mus nyre cortex, og protein/RNA er isolert. Dette gir bestemte analyse av protein/mRNA feilregulering i glomeruli av sykdom modell.
Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

Bruk av murine modeller å etterligne menneskelige nyresykdom er stadig mer vanlig. Vår forskning er fokusert på vurderingen av glomerular funksjonen i diabetiker nephropathy og podocyte-spesifikke VEGF-en bank-out mus; Derfor beskriver denne protokollen full nyre arbeid-opp brukes i vår lab til å vurdere disse musen modeller av glomerular sykdom, slik at en stor mengde informasjon om nyre og glomerular funksjonen skal hentes fra et enkelt museklikk. I forhold til alternative metoder i litteraturen å vurdere glomerular funksjonen, kan bruk av metoden beskrevet i dette dokumentet glomerular fenotypen evalueres fullt fra flere aspekter. På denne måten, kan forskeren bestemme nyre fenotypen av modellen og vurdere mekanisme som hvorfor fenotypen utvikler. Denne viktige informasjonen på mekanismen av sykdommen er nødvendig når undersøke potensielle terapeutiske avenyene i disse modellene. Metodene tillater detaljert funksjonelle vurdering av glomerular filtrering barrieren gjennom måling av urin albumin creatinine forholdet og personlige glomerular vann permeabilitet, samt både strukturelle og ultra strukturelle undersøkelse ved hjelp av periodiske Acid Schiff flekken og elektronmikroskop. Videre kan analyse av gener dysregulated på mRNA og protein mekanistisk analyse av glomerular funksjonen. Denne protokollen skisserer generiske men tilpasningsdyktige metodene som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Urin ble samlet inn ved hjelp av metabolske bur fra vill-type (WT), induserbart podocyte-spesifikke VEGF-en slå ut (VEGF-A KO) og VEGF-A KO X Neph-VEGF165b mus (VEGF-A KO mus som over uttrykke den menneskelige VEGF-en165b isoformen i podocytes i en grunnleggende måte). Ved måling av urin albumin creatinine forholdet uker 0, 4, 10 og 14 etter doxycycline induksjon av VEGF-A KO utviklet VEGF-A KO musene progressiv albuminuria 10 uker sammenlignet WT littermate kontroller. De absolutte verdiene kan ses i figur 2Aog den normaliserte til grunnlinjen for hver musen verdiene i figur 2B. Men albuminuria i ikke observert i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 2), som indikerer at VEGF-en165b er beskyttende i modellen albuminuria5.
Den glomerular LpAVjeg ble målt i individuelle glomeruli soldet fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b nyrer. Et eksempel på hvordan et glomerulus er fanget og svinn observert når perifused med 8% BSA er vist i figur 3A. Denne krymping brukes deretter til å bestemme glomerular LpA / Vjeg for hver glomerulus (figur 3B). VEGF-en KO musene hadde en betydelig økt glomerular LpA / Vjeg på 14 uker post VEGF-KO induksjon sammenlignet WT kontroll glomeruli. Tross for lavere i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus, økt glomerular LpA / Vjeg var ikke forhindret av over-uttrykk for VEGF-en165b på 14 uker5.
PAS farging av nyre cortex 14 uker etter innledningen av VEGF-A KO ikke avsløre noe glomerular strukturelle unormalt i VEGF-A KO eller VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (figur 4A). Men på analyse av glomerular ultra-strukturen via EM, VEGF-A KO mus hadde utviklet en økt GBM bredden, redusert antall endotelial fenestrae, redusert SPS dekning og økt gjennomsnittlig podocyte slit bredde (figur 4C-4F ). Gjennomsnittlig podocyte foten behandle bredden og antallet åpninger forble uendret (figur 3B og 3 G). Over-uttrykk for VEGF-en165b i VEGF-A KO mus hindret endringene til GBM og kuttet bredde (figur 4C og 4F). Men hadde VEGF-en165b ingen effekt på endrede fenestrae antall og SPS dekning (Figur 4 d og 4E)5.
RT PCR på RNA utvunnet fra soldet glomeruli avslørt at den menneskelige VEGF-en165b mRNA er bare tilstede i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus (figur 5A). Når utdrager protein fra soldet glomeruli og vurdere nivåer av proteiner via Western blotting, ble glomerular protein uttrykk for VEGFR-2 funnet å være redusert i VEGF-A KO mus, som ble forhindret av over-uttrykk for VEGF-en165b ( Finne 5B og 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figur 1. Diagrammatisk satt opp av glomerular permeabilitet (LpA) riggen. (A) glomerulus er fanget (B) brønnene i en holder bruke sugekraft, som er festet til en mount for stabilitet. (C) rektangulær microslide. (D) 4 X mål for et mikroskop med et videokamera. (E) 1% BSA løsning varmet til 37 ° C. (F) 8% BSA løsning varmet til 37 ° C. (G) Fjern trykk betydning to perifusate inneholder linjer, som tillater rask perifusate exchange. (H) ruten perifusate mot microslide, som deretter bader i glomerulus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figur 2. Urin albumin creatinine forholdet. (A) uACR verdiene på uker 0, 4, 10 og 14 etter induksjon av VEGF-A KO i WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus. (B) samme uACR verdier normalisert opprinnelig verdi (uke 0) av hver individuelle musen. UACR betydelig økt i VEGF-A KO mus uker 10 og 14 sammenlignet WT littermate kontroller, som ble hindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; Toveis VARIANSANALYSE, korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 4-12 mus per punkt; feilfelt: standard feil av gjsnitt [SEM]). Dette tallet er endret fra Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figur 3. Måling av glomerular vann permeabilitet. (A) glomerulus er fanget på brønnene via sugekraft; perifusate er byttet fra 1% BSA (Ai) til 8% BSA (alle), og glomerular krymping er observert. (B) målinger tatt før og etter 8% BSA bryteren brukes til å fastsette den glomerular LpA / Vjeg. (C) VEGF-A KO mus utvikle en økt glomerular LpA / Vjeg på 14 uker post induksjon av VEGF-A KO sammenlignet WT kontroller. Dette var ikke betydelig forhindret i VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (* p < 0,05; Enveis ANOVA, Bonferroni korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 4-9 mus, 15-30 glomeruli; feilfelt: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figur 4. Glomerular strukturelle analysen. (A) PAS flekker på nyre cortex inneholdt noen strukturelle forandringer i glomeruli fra WT, VEGF-A KO og VEGF-A X Neph-VEGF-A165b mus (Ai - iii). EM Avsløre Ultra strukturelle unormalt i VEGF-A KO glomeruli (Aiv - vi). (B) den gjennomsnittlige FPW ikke endre mellom grupper. (C) The GBM økte i VEGF-A KO-glomeruli som ble hindret av VEGF-A165b. (D) antall fenestrae ble redusert i VEGF-A KO glomeruli, som forble uendret av VEGF-A165b. (E) The SPS dekning var i VEGF-A KO glomeruli, som også forble uendret av VEGF-A165b. (F) gjennomsnittlig slit bredde ble økt i VEGF-A KO glomeruli, som ble hindret av VEGF-A165b. (G) hvor slit var uendret mellom de tre gruppene (* p < 0,05; Enveis ANOVA, Bonferroni korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 3 mus, 9 glomeruli; feilfelt: SEM). Dette tallet er endret fra Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figur 5. mRNA og protein uttrykk for markører. (A) RT PCR viste at menneskelig VEGF-en165b mRNA uttrykk var bare tydelig i de soldet glomeruli fra VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus. (B) vestlige blotting indikerte at VEGFR-2 protein uttrykk var ned-regulert i VEGF-A KO glomeruli, som ble forhindret i VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0,05; Enveis ANOVA, Bonferroni korreksjon for sammenligning mellom parene; n = 3 - 6 mus; feilfelt: SEM). Dette tallet er endret fra Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Denne protokollen beskriver en full nyre arbeidet opp som skal utføres i musen modeller av glomerular sykdom. Metodene gir detaljert funksjonelle, strukturelle og mekanistisk analyse av glomerular-funksjonen, som kan brukes på alle musen modeller av glomerular sykdom.

Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metode for Mouse Lung Intubasjon

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Vurdering av hjertefunksjonen og Hjerteinfarkt morfologi hjelp Small Animal Look-skap Inversjon Recovery (SALLI) MR i Rats

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Vurdering av Høyreventrikulært struktur og funksjon i Mouse Modell av lungearterie Innsnevring av Transtorakal Ekkokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Vurdering av vaskulær funksjon hos pasienter med kronisk nyresykdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Mus nyretransplanterte: Modeller av allograft-avstøting

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Bruk av Ultra-high Feltet MR i smågnager modeller av Polycystisk nyresykdom for<em&gt; I Vivo</em&gt; Fenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan vurdering av nyrefunksjonen hos bevisste Gnagere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Kutan Kirurgisk denervering: En metode for å teste Krav til nerver i mus modeller av Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Gjentatt måling av respiratorisk muskelaktivitet og ventilasjon i musemodeller av neuromuskulær Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...